专利名称：：用于小麦白粉病抗病基因PmHNK辅助选择的分子标记及其用法的制作方法
技术领域：
：本发明涉及小麦抗白粉病新基因尸/z必W分子标记育种的方法，属分子遗传学领域，特别涉及利用小麦白粉病抗病新基因,yzzW紧密连锁的分子标记迸行分子标记辅助育种以提高小麦抗白粉病育种的效率中的应用。二、技术背景小麦白粉病是由小麦白粉病菌[Blumeriagraminis(DC)Speerf.印.Tritici，简称为Bgt]所引起的一种气传性真菌病害，为世界各主要麦区的主要病害之一，且发病范围日益扩大，危害程度不断加重，可引起13.434%的产量损失。选育和使用高效抗病品种被认为是最经济、安全、有效的解决办法。根据"基因对基因"假说，任何抗病基因都会出现克服其抗性的毒性小种，反之亦然，二者呈共进化的关系，即一个新的抗病基因在经过一段时间的应用后，就会有针对它的毒性小种出现，使其逐渐丧失抗病性，从而给小麦生产造成严重损失。因此，发掘新的白粉病抗源已成为目前小麦抗白粉病育种的一项非常急迫的任务。到目前为止，国际小麦基因命名委员会共正式命名了来自39个位点的55个白粉病抗病基因(&7-户y^"，其中30个抗病基因已找到连锁或共分离的分子标记。近年来，分子标记作图技术发展迅速，众多的分子标记类型中以SSR(SimpleSequenceR印eat，简单重复序列，又称微卫星标记)、AFLP(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism,扩增片段长度多态性)以及由RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphisms,限制性片段长度多态性)转化的STS(SequenceTaggedSite,序列标签位点)应用最为广泛。近几年新发掘的白粉病抗病基因所构建的遗传图谱基本都是应用的这三类标记。随着小麦基因组学研究的蓬勃发展，EST(ExpressedSequenceTag,表达序列标签)数据库的信息量呈现出指数级增长，截止2008年11月小麦EST数据库登录的EST序列(http:〃雨.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/index.html)已超过1,250，932条，同时EST-SSR因具有成本低、特异性好等优点，已成为SSR标记发展的一个新方向。小麦近缘种属如一粒小麦、二粒小麦、粗山羊草等已成为白粉病新抗病基因非常重要的来源(/^^-/^^),这些抗病基因多为质量抗性，对当前流行的生理小种有较好的抗性。但这类抗源往往与不利的农艺性状相连锁，作为抗源导入栽培品种时，后代需要经过多代回交来打破与不利基因的连锁，有的甚至经过多代回交以后仍无法打破这种连锁，这在很大程度上制约了此类抗源在育种中的应用。普通小麦品种周98165对白粉病具有优异的抗性，且自身农艺性状优良，作为新的白粉病抗源导入小麦品种的难度小，无不利连锁，所以周98165在育种应用方面具有较大的优势。
发明内容本发明要解决的技术问题提供用于小麦白粉病抗病基因尸/^vyr辅助选择的分子标记引物及其用法，并通过该分子标记首次定位了小麦品种周98165中的白粉病抗性新基因A2^^。本发明的技术方案本发明采用的方法是将小麦抗病亲本周98165与感病亲本中国春(ChineseSpring,CS)杂交、正交、自交、测交，对双亲及其杂交后代进行苗期鉴定，用小麦白粉病菌08B1进行遗传分析，利用SSR、EST-SSR标记对双亲及抗感池进行筛选和分析，并结合中国春缺-四体材料进行染色体定位。小麦品种周98165对白粉菌高毒力小种08B1抗性良好，其抗病性受1对显性核基因控制，将该基因暂命名为尸〃湖《。筛选了与/fe^V,紧密连锁的2个微卫星标记，在遗传图谱上的顺序为xgwm299、xwmc291、/M5W。与尸/a^VJ遗传距离分别为5.3cM和3.8cM，并将尸yz必W定位于3BL染色体上。本发明的用于小麦白粉病抗病基因尸i^必W辅助选择的分子标记中扩增该分子标记的引物具有如下所示的核苷酸序列标记xgwm299:4PI:5'-ACTACTTAGGCCTCCCGCC-3，，P2:5'-TGACCCACTTGCMTTCATC-3，；或者标记xwmc291:PI:5'-TACCACGGGAAAGGAAACATCT-3，，P2:5，-CACGTTGAAACACGGTGACTAT-3，。所述标记xgwm299与小麦白粉病抗性基因尸77z/y7Vf的遗传距离为5.3cM，标记xwmc291与尸/a/W,的遗传距离为3.8cM。所述的分子标记用于SSR标记筛选时的反应程序为(1)PCR反应体系为10yL，含10Xbuffer1uL、15咖ol/LMgCl21yL、2mmol/LdNTP1uL、20ng/uL分子标记引物luL、1UTaq酶、去离子水3.875uL、20ng/uL基因组DNA2uL;(2)扩增程序为94°C预变性3min;94。C变性lmin，55。C或6(TC退火1min，72。C延伸2min，40个循环;72。C延伸10min;(3)扩增产物用6%变性聚丙烯酰胺凝胶或8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色后观察照相。所述的分子标记引物为xgwra299时，退火温度为55°C;分子标记引物为xwmc291时，退火温度为60°C。本发明的分子标记在小麦白粉病分子标记辅助育种中的应用。本发明的有益效果本发明所提供的普通小麦周98165中的抗白粉病基因尸7Z皿的分子标记方法，具有以下优点1、本发明利用分子标记确定小麦品种周98165所携带的尸/z必WT基因为一新的白粉病抗病基因，并首次定位了该基因，标记xgwra299与该基因的遗传距离为5.3cM，标记xwmc291与该基因的遗传距离为3.8cM,上述两个标记均与T^Z^W基因紧密连锁，皆可用于该基因的分子标记辅助育种。2、利用本发明的白粉病分子标记辅助育种选择目标明确，可节约成本。传统的白粉病抗病育种首先要利用优异白粉病抗源为亲本进行杂交，然后对后代群体进行白粉病抗病性接种鉴定，该方法易受环境气候影响，选择准确性较低。因此传统抗病育种不但费时、费工，而且效率低、成本高。利用本发明的分子标记与白粉病抗性新基因户mi^V《紧密连锁的特点，在苗期就可快速、高通量地鉴定出含有白粉病抗性新基因i^/iAK的分离群体和高代品系，在降低了成本的同时还可大幅度地提高选择效率。3、本发明利用经典遗传学、中国春缺体-四体定位和分子标记方法，对小麦品种周98165携带的白粉病抗性新基因进行遗传分析，明确其遗传规律，对抗病基因进行定位、开发与其紧密连锁的分子标记，为将来通过染色体步移的途径对尸m/ZiV《进行图位克隆成为可能，为白粉病抗病育种提供新的抗源和技术基础。四图1:SSR标记Xwmc291在双亲、抗感池、2761-5和中国春缺体-四体系间的扩增结果。图中，Ml:DNAmarker;1:抗病池；2:感病池；3:抗病亲本周98165;4:感病亲本中国春；5:N3AT3B;6:N3AT3D;7:N3BT3A;8:N3BT3D;9:N3DT3A;10:N3DT3B。图2:抗白粉基因尸/zz/^V,的微卫星标记连锁遗传图谱。图3:抗白粉基因尸/Z必Wf的微卫星标记连锁图谱。图中，Ml:100bpDNALader;1:周22;2:中国春；3:2761-5(Pml3);箭头表示多态性片段。五具体实施例方式以下结合实施例详细说明本发明。一、材料与方法(一)供试小麦材料周98165与中国春(CS)的正交和反交h代、F2代、F2:3、Bd代群体，以及中国春及其缺体-四体系(nullisomic-tetrasomiclines):N3AT3B、N3AT3D、N3BT3A、N3BT3D、N3DT3A和N3DT3B，抗病对照材料Aramda(/to必)、Kavkaz(尸/H劝、2761-5(尸/z")、京05-3672-1(尸/zi7)、齿牙糙(尸/z^力、京05-3539-1,周98165的三个亲本材料为周麦12、周麦13和豫麦49。(二)分析方法1.苗期白粉病抗病性分析抗病性鉴定采用人工接种方法，当供试小麦幼苗长至三叶期时用抖粉法接种后置于隔离的接种间内(温度15-20。C/昼、10-15。C/夜，光照14-16h/h.d-1，光强10000lx，相对湿度:80%)潜育发病，待感病对照中国春充分发病后(7-10d)，按盛宝钦6级分类法划分抗病分级即0，0;，1，2，3，4，其中O为免疫(植物无病斑，无侵染症状)，0;为近免疫(有枯斑，不产生孢子堆)，l为高抗(病斑小，倒四叶菌丝小而少，菌丝层稀薄，可见绿色叶面，偶见较大病斑，但仍透绿，产孢量极少)，2为中抗(倒三叶、倒二叶感病，叶片病斑直径小于lmm，下部叶片菌丝少而薄)，3为中感(旗叶感病，叶片病斑多，但病斑不连片，直径大于lmm，下部叶片菌丝大而厚)，4为高感(穗部或旗叶感病，叶片病斑直径一般大于lmm，菌丝层厚，产孢量大，病斑连片)。对F2后代用卡方检验进行分离比适合度测验，确定品种所含的抗病基因数目及互作方式。2.DNA提取和抗感池构建小麦基因组DNA的提取采用CTAB法。采用分离体分组混合分析法(BulkedSegregationAnalysis)进行筛选与户w7/A^基因连锁的分子标记，即在周98165与中国春(CS)的杂交F2分离群体中随机选取10株极端抗病植株和10株极端感病植株，分别提取DNA，各自取等量DNA混合建立抗病池和感病池。利用SSR标记对抗池、感池和双亲(周98165和中国春)进行分析。3.SSR引物的分析本研究所使用的分子标记通过以下途径获取(1)根据国际小麦SSR协作组最新公布的小麦遗传连锁图谱(http://wheat,pw.usda.gov/cgi-bin/swish/search.cgi)，选取分布于小麦21条染色体组的分子标记进行遗传分析，分子标记引物序列来自国际小麦SSR协作组公布的536对小麦WMC引物(http:〃wheat,pw.usda.gov/ggpages/SSR/WMC);(2)本实验室根据NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation,美国国家生物技术信息中心)公布的小麦EST序列信息自行设计合成的EST-SSR引物。PCR反应在德国Biometra公司TlThermocycler上进行。反应体系为10uL(含10XbufferluL,15,1/LMgC121uL，2,1/LdNTP1yL，20ng/uL弓l物luL，1UTaq酶，去离子水3.875yL，20ng/uL基因组DNA2uL)。扩增程序为94。C变性3min;94。C变性lmin,50°C、55。C或60。C复性lmin，72。C延伸2min，40个循环；72'C延伸10min。扩增产物用6%变性聚丙烯酰胺凝胶或8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，经硝酸银染色后观察照相。4.遗传距离估算和连锁分析和白粉病抗病基因的染色体定位用国际动植物分子标记开发研究通用的Mapmarker3.Ob软件计算标记与抗白粉病基因间的遗传距离(L0D》3.0)。用通用的专业软件Mapdra绘制该基因的遗传连锁图谱。根据SSR扩增结果，找到在双亲、抗病池和感病池间具有多态性的引物，通过F2群体对多态性引物进行验证，利用该引物的定位信息对抗病基因进行定位，并利用一套中国春的缺体四体(第三同源群)对定位结果进行进一步的验证。然后，结合Sourdille等报道的小麦微卫星引物的物理图谱，对该抗病基因的精细定位进行进一步的分析。二、结果与分析(一)抗性鉴定和遗传分析用河南省的高毒力小麦白粉病菌生理小种LY2-1、ZZ1-1、08Bl对供试材料接菌，苗期接种结果表明，周98165对3个小种均表现近免疫或高抗，与京05-3672-1(/^^)和京05-3539-1的抗病表现一致；感病品种中国春对以上3个小种均表现为高感，侵染型为4型；齿牙糙(尸迈i^)对ZZl-l抗病，而感染LY2-1和08B1;2761-50°//lJ)则对3个小种全部感病。试验结果表明抗病基因尸;zz^W与尸/Bi7、/fe加对三个菌系抗性水平表现一致，而与/^艰病表现有差异。见表l。表1周98165单小种抗病鉴定结果抗病鉴定材料<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表中R表示抗病；S表示感病。周98165接种菌系08B1后表现为近免疫，侵染型为O;，感病亲本中国春接种08Bl后表现为高感，侵染型为4型，对FhF2、F2:3和Bd接种进行遗传分析，0-2为抗病，3-4为感病。结果见表2，表明20株正交F,和25株反交F,全部抗病，15株Bd有9株抗病、7株感病，x2检验符合l:l的分离比，在周98165与中国春的F2正交群体(278株)中，其中抗病219株、感病59株，经x2检验符合1对显性基因控制的3R:1S的分离比例(x2={3:l}=0.8653，p>0.25)。对周98165与中国春杂交的193个F2:3家系同样接种了菌系08B1，结果显示45个家系有抗性且不发生抗性分离，101个F2:3家系发生抗性分离，48个家系表现感病不分离，〃检验结果(x2={l:2:l}=1.91，df=2，p=0.38)表明其符合l:2:l的显性单基因分离比。这些结果表明周98165对08B1的白粉病抗性是由1对显性基因所控制，将该基因暂命名为AzMWf。表208B1对周98165的白粉病抗病遗传分析结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表中，R表示45个纯合抗病系和101个发生分离的F2:3家系中的抗性株，S表示48个纯合感病系和101个发生分离的F2:3家系中的感病株。*表示显著水平为0.05时的f值。(二)P/Z必WT基因连锁标记的筛选与染色体定位如材料与方法中所述，本实验室根据国际小麦SSR协作组公布的SSR分子标记和自行设计的EST-SSR分子标记合成了均匀分布于小麦21条染色体的210对引物，在抗病亲本周98165、感病亲本中国春、抗性池和感病池间进行PCR扩增、筛选，发现有两对SSR引物在抗、感池和双亲间扩增出多态性，比对这两对引物的遗传图谱，发现其均位于染色体3B的长臂。在这两对引物遗传图谱的周围选取26对SSR引物进行扩增，又发现3对引物也在双亲及抗感池间存在多态性。经过对F2分离群体的电泳分析，从中选取xwmc291、xgwm299两个可靠性、稳定性最好的引物作为白粉病抗病新基因户mW《的选择标记，见附图1。(三)遗传连锁性分析为检测目的基因位点与所获得标记位点的遗传连锁性，将R后代278个单株分别提取基因组DNA。利用这些连锁标记进一步对这278个单株进行分析，以确定抗白粉病基因/^WJ与标记位点之间的连锁关系。用M即marker3.0b软件对抗白粉病基因尸^zWI与SSR位点进行连锁分析(L0D》3.0)，结果显示标记Xwmc291、Xgwm299和抗白粉病基因尸/a^^遗传距离分别为3.8cM和5.3cM，见附图2。三、结论本发明利用3个河南省当前小麦白粉病流行小种评价了周98165的抗病性，证实其对多个白粉菌小种有很强的抗性。利用经典遗传学分析，发现周98165对08B1的抗病性是由1对显性核基因所控制，用SSR标记将其定位于染色体3BL上，并有3B的缺体-四体进行了验证。到目前为止，定位于3BL上的已正式命名的白粉病抗病基因只有一个即尸历"。尸/zM是由C.Ceoloni等(Hereditas，1992，116:239-245)在小麦近缘属高大山羊草"e^77ops70/^7'ssi历a)中发现并转入普通小麦的，共有3BL.3SS-3S、3DL.3SS-3S两种转入类型。在试验中用与尸/zz^7T基因连锁的两个标记对2761-5(尸历7》进行扩增，结果显示尸历"与2个标记皆不连锁，表明/fe"与尸/z必V^基因不在同一位点，是2个不同的白粉病抗病基因，即Az/^^为一新的白粉病抗病基因。另外在白粉病抗病鉴定方面，/fe^W与尸/zL^也有明显不同，/^在接种LY2-1、ZZ1-1和08B13个白粉病生理小种后，侵染型分别为4、4和3,而同样条件下Az^^侵染型分别为0;、1和0;，二者的抗病性有明显的不同。因此可以判定尸/a/W与/^"不是同一或等位基因，同时由于目前定位于3BL上的白粉病抗病基因只有尸WJ，因此可以确定周98165所携带户y必V^为一新的白粉病抗病基因。为了进一步证实试验结果，利用/fe/J的标记对周98165与2761-5(尸历")进行了分子鉴定(见附图3)，结果表明周98165不含有抗白粉病基因i^WA即P/zz^Wr和/^A不是同一基因。由于周98165自身农艺性状比较优异，也尚未看到该抗病基因与不利的基因连锁，因此尸^^及该基因的载体周98165具有较好的育种利用价值。权利要求1.一种用于小麦白粉病抗病基因PmHNK辅助选择的分子标记，其特征在于扩增该分子标记的引物具有如下所示的核苷酸序列标记xgwm299P15’-ACTACTTAGGCCTCCCGCC-3’，P25’-TGACCCACTTGCAATTCATC-3’；或者标记xwmc291P15’-TACCACGGGAAAGGAAACATCT-3’，P25’-CACGTTGAAACACGGTGACTAT-3’。2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于所述标记xgwm299与小麦白粉病抗性基因尸/必V^的遗传距离为5.3cM，标记xwmc291与尸/n^T的遗传距离为3.8cM。3.—种权利要求1所述的用于小麦白粉病抗病基因尸/a^W辅助选择的分子标记的用法，其特征在于将所述的分子标记用于SSR标记筛选时的反应程序为(1)PCR反应体系为10yL，含10Xbuffer1uL、15腿ol/LMgCl21uL、2腿ol/LdNTP1uL、20ng/yL分子标记引物luL、1UTaq酶、去离子水3.875uL、20ng/uL基因组DNA2uL;(2)扩增程序为94°C预变性3min;94。C变性lmin，55r或6(TC退火lmin，72。C延伸2min，40个循环;72。C延伸10min;(3)扩增产物用6%变性聚丙烯酰胺凝胶或8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色后观察照相。4.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于所述的分子标记引物为xgwm299时，退火温度为55°C;分子标记引物为xwmc291时，退火温度为6(TC。5.权利要求1或2所述的分子标记在小麦白粉病分子标记辅助育种中的应用。全文摘要本发明涉及利用小麦白粉病抗病新基因PmHNK紧密连锁的分子标记进行辅助育种以提高小麦抗白粉病育种的效率中的应用。本发明的分子标记中扩增该分子标记为xgwm299、标记xwmc291，xgwm299与基因PmHNK的遗传距离为5.3cm，标记xwmc291与PmHNK的遗传距离为3.8cm。将所述的分子标记用于SSR标记筛选，通过PCR反应进行扩增，扩增产物聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色后观察照相。本发明首次定位了PmHNK基因，两个标记均与PmHNK基因紧密连锁，可用于该基因的分子标记辅助育种。利用本发明的白粉病分子标记辅助育种选择目标明确，节约成本，还可大幅度地提高选择效率，为将来通过染色体步移的途径对PmHNK进行图位克隆成为可能，为白粉病抗病育种提供新的抗源和技术基础。文档编号C12Q1/68GK101532054SQ20091006432公开日2009年9月16日申请日期2009年3月4日优先权日2009年3月4日发明者张建周,李春鑫,琳胡,许为钢申请人:河南省农业科学院