专利名称：与小麦白粉病抗性基因PmHNK54连锁的标记引物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及小麦抗白粉病基因的标记引物，属分子遗传学领域，特别是涉及与小 麦白粉病抗病基因PrnHNK54紧密连锁的标记引物及其在分子标记辅助育种中的应用。
背景技术：
小麦白粉病是由小麦白粉病菌[Blumeria graminis (DC) Speer f. sp. Tritici, 简称为欲 ]所引起的一种气传性真菌病害，为世界各主要麦区的主要病害之一，且发病范 围日益扩大，危害程度不断加重，可引起13. 4% 34%的产量损失。选育和使用高效抗病 品种是最经济、安全、有效的解决办法，根据“基因对基因”假说，任何抗病基因都会出现克 服其抗性的毒性小种，反之亦然，二者呈共进化的关系，即一个新的抗病基因在经过一段时 间的应用后，就会有针对它的毒性小种出现，使其逐渐丧失抗病性，给小麦生产造成严重损 失。因此，发掘新的白粉病抗源已成为目前小麦抗白粉病育种工作一项非常迫切的任务。到目前为止，国际小麦基因命名委员会共正式命名了来自43个位点的61个白粉 病抗病基因(powdery mildew, Pm) 0%7-作衫)，其中35个抗病基因已找到连锁或共分离 的分子标记。近年来，分子标记作图技术发展迅速，众多的分子标记类型中以简单重复序列 标记(SSR)、扩增长度多态性标记(AFLP)以及由限制性片段长度多态性标记(RFLP)转化的 序列标签位点(STS)标记应用最为广泛。新发掘的白粉病抗病基因所构建的遗传图谱基本 都是应用的这三类标记。随着小麦基因组学研究的蓬勃发展，表达序列标签(EST)数据库的信息量呈现出 指数级增长，截止2008年11月小麦EST数据库登录的EST序列 (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/dbEST/index.html)已超过 1，250，932 条，同时 EST-SSR 因具有成本低、特 异性好等优点，为新的标记开发提供了丰富的序列资源，已成为SSR标记发展的一个新方 向。小麦近缘种属如一粒小麦、二粒小麦、粗山羊草等已成为白粉病新抗病基因非常 重要的来源、Pm30-Pm37，Pm41~Pm43)，这些抗病基因多为质量抗性，对当前流行的生理小 种有较好的抗性。但这类抗源往往与不利的农艺性状相连锁，作为抗源导入栽培品种时，后 代需要经过多代回交打破与不利基因的连锁，有的甚至经过多代回交以后仍无法打破这种 连锁，这在很大程度上制约了此类抗源在育种中的应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题提供一种与小麦白粉病 抗性基因/^//ΛΤ似紧密连锁的标记 及其应用，通过发掘到的分子标记，首次对小麦亲本材料郑9754中的白粉病抗性新基因进 行染色体定位，同时构建其连锁图谱，为该基因在小麦白粉抗病育种中的应用提供抗源材 料和理论支持。本发明的技术方案
与小麦白粉病抗性基因PmHNK54连锁的标记引物，所述标记弓丨物的核苷酸序列为 标记引物Xbarc5，
Pl :5，-GCGCCTGGACCGGTTTTCTATTTT-3，，P2 :5’ -GCGTTGGGAATTCCTGAACATTTT -3’， 或者标记引物Xgwm312， P3 5' -ATCGCATGATGCACGTAGAG -3，， P4 :5’ -ACATGCATGCCTACCTAATGG -3，。所述标记引物在遗传图谱上的顺序为Xbarc5、PmHNK54、Xgwm312，所述标记引物 Xbarc5与基饭PmHNK54的遗传距离为5. OcM，所述标记引物Xgwm312与PmHNK54的遗传距 离为6. O cMo将标记引物用于SSR标记筛选时的反应程序为 (1) PCR 反应
所述PCR 反应体系为 10 μ 1，含 IOXbuffer 1 μ 1,10 mM/μ 1 dNTP 0. 2μ L,20 uM/μ L 引物 0· 2μ 1，5 U/ul Taq 酶 0. lul，去离子水 8. 1 μ 1,20 ng/μ 1 基因组 DNA 0. 4 μ 1 ；
(2)扩增程序为94°C预变性3min，94°C变性1 min，55°C或60°C复性1 min，72°C 延伸2 min, 40个循环；72°C延伸10 min ；
(3)扩增产物用6%变性聚丙烯酰胺凝胶或8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染 色后观察照相。所述的与小麦白粉病抗性基因Λβ/ΥΛΤ似连锁的标记引物在辅助育种中的应用。本发明采用的方法是将小麦抗病亲本郑9754与感病亲本中国春(Chinese Spring, CS)杂交、自交，对双亲及其杂交后代进行苗期鉴定，用小麦白粉病菌10YY2进行遗 传分析，利用SSR、EST-SSR标记对双亲及抗感池进行筛选和分析，并结合中国春缺_四体材 料进行染色体定位。试验结果显示小麦亲本材料郑9754对白粉菌高毒力小种10YY2的抗性良好，其 抗病性受一对显性核基因控制，将该基因暂命名为/^iWU么本发明筛选了与Z^fflWf似紧 密连锁的2个微卫星标记，在遗传图谱上的顺序为Xbarc5、PmHNK54、Xgwm3120两个连锁 的侧翼标记于/7^Wf似遗传距离分别为5. 0 cM、6. 0 cM，姚PmHNK54定位于2AL染色体 上。本发明的积极有益效果
本发明提供的普通小麦亲本材料郑9754中的抗白粉病基因/^//ΛΤ似的分子标记方 法，具有以下特点
1、本发明的分子标记引物首次定位了小麦亲本材料郑9754中的白粉病抗性新基因 /^//ΛΤ似。标记的特异性强、稳定性高，并且标记的筛选方法操作简单快捷，对检测设备和引 物模板质量要求不高，具有试验试剂用量少，速度快，成本低，适合大批次、高通量、自动化 的优点。非常适合现代农业分子育种的实现。2、本发明的辅助育种的功能目标 十分明确，可以大量节约成本。传统的白粉病抗 病育种首先利用优异白粉病抗源和改良亲本进行杂交，然后对后代群体进行白粉病抗病性 接种鉴定，该方法易受环境气候影响，选择准确性较低。因此传统抗病育种不但费时、费工， 而且效率低、成本高。利用本发明的白粉病抗病基因分子标记与白粉病抗性新基因/^//ΛΤ似 紧密连锁，在苗期就可快速、高通量地鉴定出含有白粉病抗性新基因/^//ΛΤ似的分离群体 和高代品系，在降低育种成本的同时，还大幅度地提高了选择效率。3、本发明为抗白粉病基因/^//ΛΤ似的图位克隆提供了重要的分子遗传学信息。两个标记在遗传图谱上的顺序为\\mrdPmHNK54、Xgwm312。两个连锁的侧職紛PmHNK54 遗传距离分别为5. O cM、6.0 cM，并将/^/ΥΛΤ似定位于2AL染色体上。上述信息可以为白粉 病抗性新基因PmHNK54的图位克隆试验奠定基础。4、本发明利用的亲本材料郑9754对白粉病具有优异的抗性，且自身农艺性状优 良，作为新的白粉病抗源导入小麦品种的难度小，无不利连锁，在育种方面具有较大优势。 利用经典遗传学、中国春缺体-四体定位和分子标记方法对小麦亲本材料郑9754携带的 白粉病抗性新基因进行遗传分析，明确其遗传规律，对抗病基因进行定位，开发与其紧密连 锁的分子标记，为白粉病抗病育种提供新的抗源，同时也为/^//ΛΤ似在生产中进行分子标 记辅助育种提供技术支持。5、本发明的白粉病抗病基因分子标记引物应用于育种工作中，将大大降低白粉病 流行引起的小麦产量损失，同时减少农药使用量，有利于降低生产成本和提高粮食产量，具 有很大的应用潜力和较高的经济价值。
图1连锁标记Xgwm312对2A同源群缺体-四体及2A缺失系的扩增结果。图中，箭头所示为多态性目的条带。M: Marker, 1郑9754，2:中国春，3:抗病 DNA 池，4:感病 DNA 池，5:缺体 2A 四体 2B (N2AT2B)，6 缺体 2A 四体 2D (N2AT2D), 7 缺 体 2B 四体 2A (N2BT2A)，8缺体 2B 四体 2D (N2BT2D)，9缺体 2D 四体 2A (N2DT2A), 10: 缺体 2D 四体 2B (N2DT2B), 11:缺失系(2AL-1)。图2抗白粉基因作办似的微卫星标记连锁遗传图谱，显示分子标记与 PmHNK54。图2中左边为位点名称，右边为遗传距离，单位是cM。图3抗白粉基因/^fflWif似的微卫星标记物理图谱，证明了Λη/ΥΛΤ似基因在染色体 2AL上的存在区域。图中a表示遗传图谱；b表示物理图谱。图4 PmLK906和Pm4连锁的分子标记对抗病亲本材料郑9754与中国春及其杂 交后代组成的抗、感池检测结果，用以检验/7^Wf似与浙和Zi^在分子水平上的差 异，表明/^ffl/W^M不同于/iBZ烈和作毛是一个位于染色体2AL上的新基因。图中，M: Marker, 1郑 9754，2 中国春，3 抗病 DNA 池，4:感病 DNA 池。
具体实施例方式
以下结合实施例详细说明本发明，其中出现的百分比浓度如无特别说明，均指质量百 分比浓度。实施例1 与小麦白粉病抗性基因PmHNK54连锁的标记弓丨物及其应用 材料与方法
(一)供试验的小麦材料亲本材料郑9754与中国春(CS)的正交和反交F1代、F2 代、F2:3、代群体，以及中国春及其缺体-四体系(nullisomic-tetrasomic lines, NT) N2A-T2B, N2A-T2D, N2B-T2A, N2B-T2D, N2D-T2A 和 N2D-T2B,染色体 2A 的 2 个缺失系 2AS-5 (FL=O. 78)，2AL-1 (FL=O. 85)，抗病对照材料Aramda iPm4b) ,Kavkaz、周 22
、郑麦 883 (/^力)、齿牙糙(/^匆)、兰考 906 (PmLK906)。(二)分析方法①苗期白粉病抗病性分析抗病性鉴定采用人工接种方法，当 供试小麦幼苗长至三叶期时，用抖粉法接种后置于隔离的接种间内(温度15-20°C /昼、 10-15°C /夜，光照14-16 h/h · d-1，光强10000 lx，相对湿度:80%)潜育发病，待感病对照中国春充分发病后(7-10d)，按盛宝钦6级分类法划分抗病分级即0，0;，1，2，3，4，其中 0-0 ；为免疫，1为高抗，2为中抗，3为中感，4为高感。对F2、F213后代用卡方检验进行分离 比适合度测验，确定品种所含的抗病基因数目及互作方式。②DNA提取和抗感池构建小麦基因组DNA的提取采用CTAB法。在F2群体中分 别随机选取10株抗病植株和10株感病株提取DNA，各自取等量混合建立抗病池和感病池。③SSR引物的分析SSR引物根据SSR协作组的610对SSR和EST-SSR弓丨物 (http://wheat, pw. usda. gov/ggpages/SSR/)报道的引物合成。PCR 反应在 Bio-RAD Thermocycler 上进行。反应体系为10 μ 1，含 IOXbuffer (Mg2+) 1 μ 1,10 mM/μ 1 dNTP 0· 2 μ L，20 uM/ μ L 引物 0. 2μ1，5 U/ul Taq 酶 0. lul，去离子水 8.1 μ 1,20 ng/μ 1 基因组 DNA 0.4 μ I。扩增程序94°C预变性3 min，94°C变性 1 min，50°C、55°C、60°C复性 lmin，72°C延 伸2min，40个循环；72°C延伸lOmin。扩增产物用6%变性聚丙烯酰胺凝胶或8%非变性聚 丙烯酰胺凝胶电泳，经硝酸银染色后观察照相。④遗传距离估算、连锁分析以及白粉病抗病基因的染色体定位
用Mapmarker 3. Ob软件计算标记与抗白粉病基因间的遗传距离(L0D彡3. 0)。用 Mapdraw软件绘制该基因的遗传连锁图谱。根据SSR扩增结果，找到在双亲、抗病池和感 病池间具有多态性的引物，通过F2:3群体对多态性引物进行验证，利用该引物的定位信息 对抗病基因进行定位，并利用一套中国春的缺体四体(第二同源群)对定位结果进一步的验 证。然后，结合小麦微卫星引物的物理图谱，对该抗病基因的精细定位进行进一步的分析。结果与分析
(一)抗性鉴定和遗传分析
用河南省的7个高致病力小麦白粉病菌生理小种对供试材料接菌，苗期接种结果表 明，亲本材料 郑9754对其中的6个小种表现为高抗或中抗，与兰考906 (PmLK906)抗病表 现差异十分明显感病品种中国春、Armada {Pm4b)和Kavkaz 0%劝对以上7个小种均表 现为高感，侵染型为3-4型；齿牙糙(Pm24~)对08B1和10YY2表现为感病；周22 (PmHNK)、郑 麦883 (Pm21)则对以上小种表现出很好的抗性。试验结果表明抗病基因/is^W似与Pm4、 PmLK906对7个菌系抗性水平表现差异十分明显，亲本材料郑9754的抗性表现优异。(见 表1)
表1小麦亲本材料郑9754单孢小种抗病鉴定结果(0-2 抗病；3-4 感病)
权利要求
与小麦白粉病抗性基因PmHNK54连锁的标记引物，其特征在于，所述标记引物的核苷酸序列为 标记引物Xbarc5， P15’ GCGCCTGGACCGGTTTTCTATTTT 3’，P25’ GCGTTGGGAATTCCTGAACATTTT 3’，或者标记引物Xgwm312， P35’ ATCGCATGATGCACGTAGAG 3’， P45’ ACATGCATGCCTACCTAATGG 3’。
2.根据权利要求1所述的标记引物，其特征在于，所述标记引物在遗传图谱上的顺序 为Xhar&、ΡπιΗΝΚ54、Xgwm312，所述标记弓丨物Xbarc5与基因PmHNK54的遗传距离为5. OcM， 所述标记引物Xgwm312与PmHNK54的遗传距离为6. O cM。
3.—种权利要求1所述的与小麦白粉病抗性基因PmHNK54似连锁的标记引物的用法，其 特征在于，将所述标记引物用于SSR标记筛选时的反应程序为(1) PCR 反应PCR 反应体系为 10 μ 1，含 IOXbuffer 1 μ 1,10 mM/μ 1 dNTP 0. 2 μ L, 20 uM/μ L 引物 0. 2μ1，5 U/ul Taq 酶 0. Iul，去离子水 8.1 μ 1,20 ng/μ 1 基因组DNA 0. 4 μ 1 ；(2)扩增程序为94°C预变性3min，94°C变性1 min，55°C或60°C复性1 min，72°C 延伸2 min, 40个循环；72°C延伸10 min ；(3)扩增产物用6%变性聚丙烯酰胺凝胶或8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染 色后观察照相。
4.权利要求1或2所述的与小麦白粉病抗性基因PmHNK54似连锁的标记引物在辅助育种 中的应用。
全文摘要
本发明涉及与小麦白粉病抗病基因PmHNK54紧密连锁的标记引物及其在分子标记辅助育种中的应用。标记引物在遗传图谱上的顺序为Xbarc5、PmHNK54、Xgwm312，Xbarc5、Xgwm312与PmHNK54的遗传距离分别为5.0cM、6.0cM。SSR标记筛选时PCR反应体系10μl，含10×buffer1μl，10mM/μldNTP0.2μL、20uM/μL引物0.2μl、5U/ulTaq酶0.1ul、去离子水8.1μl、20ng/μl基因组DNA0.4μl；扩增程序为94℃预变性3min，94℃变性1min，55℃或60℃复性1min，72℃延伸2min，40个循环；72℃延伸10min；扩增产物用6%变性聚丙烯酰胺凝胶或8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色后观察照相。本发明首次定位了小麦亲本材料郑9754中的白粉病抗性新基因PmHNK54，标记特异性强、稳定性高，适合大批次、高通量、自动化的优点，节约成本，提高选择效率。
文档编号C12N15/11GK101988064SQ20101057227
公开日2011年3月23日 申请日期2010年12月3日 优先权日2010年12月3日
发明者张建周, 张磊, 李春鑫, 王会伟, 胡琳, 董海滨, 许为钢 申请人:河南省农业科学院