专利名称：人参内生莫勒接霉菌及利用其制备人参皂苷Rd的方法
技术领域：
本发明涉及一株人参内生真菌，莫勒接霉菌Zygorhynchus moelleri (CGMCCNo. 4315)，以及利用该菌专一性转化底物人参皂苷Rb1为人参皂苷Rd的方法。
背景技术：
人参皂苷Rd是一种很有应用前景的候选药物，它具有特异性阻断受体依赖性钙 离子通道的功能，在肾功能保护、调节免疫、抑制HeLa细胞生长、诱导C0X22产生、防辐射方 面具有其他单体人参皂苷所没有的独特作用；在镇痛、神经保护作用方面，Rd相对于其他 单体人参皂苷也较强。因此，人参皂苷Rd可开发成防辐射，治疗心血管疾病、炎症、创伤以 及由损伤引起的体内外出血等方面的药物。然而，由于人参皂苷Rd在人参属植物中含量较 低，而且结构复杂，化学合成至今尚未成功，目前只能通过从人参等药用植物的根、茎、叶中 提取，但其效率低，成本高，从而限制了 Rd的深入研究和应用。因此，获得大量、高纯度的人 参皂苷Rd具有特别重要的科学研究意义和实际应用价值。对于人参皂苷的转化，若采用传统的化学转化法，其选择性低，副产物多，而且容 易对环境造成污染。相比较而言，生物转化法具有高度专一性和无污染性等优势，因此，具 有很好的应用前景。Rd与Rb1具有相同的糖苷配基，其结构差异仅在于C3和C20位上的糖 基，而Rb1在人参中的含量较高，因此，可以通过水解Rb1去除其C-20位上的糖基而获得，转 化途径如附图1所示。目前，很多研究者都在寻找能够将Rb1转化成Rd的微生物或者是酶， 然而，大多数微生物或酶都缺少高度的专一性，甚至会将Rd进一步转化成F2、Rg3或他2， 而生成Rd的效率很低。利用微生物来源的酶转化主要人参皂苷生产人参皂苷Rd普遍存在的问题有转 化过程中转化产物不专一；作为转化底物的主要人参皂苷浓度不能过高；底物对酶有抑 制作用等。Kim等从70多株好气菌中筛选到12株产生的酶均可将人参皂苷Rb1转化成 人参皂苷Rd，底物质量浓度为0. 47mg/mL ；而能将人参皂苷Rb1较完全转化的3株细菌， 均有 Compound K 等副产物产生(Kim M K 等，The Journal of Microbiology, 2005,43 456-46 。Son等利用Thermus caldophilus产生的β -葡萄糖苷酶，将人参皂苷Rb1转化 成Rd，底物质量浓度为lmg/mL，温度为75°C。但由于人参皂苷的抑制作用，该反应底物用人 参总提取物替代时，反应时间比用纯Rb1延长30倍；当人参总提取物质量浓度达到4. 2mg/ mL 时，人参皂苷 Rd 的产率从 80% 降低到 12% (Son J W 等 BiotechnologyLetters，2008， 30 :713-716)。本发明人即试图寻找新的方案，来实现人参皂苷Rd的工业化生产，满足临床 需要，同时可解决人参、三七等常用中药材的资源紧缺的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可用于生物转化生产稀有人参皂苷Rd的微生物，以 及使用该菌专一性转化底物人参皂苷Rb1生产Rd的方法。
本发明的人参内生菌是发明人从人参中分离得到的一株真菌，经传统方法鉴定为 莫勒接霉菌 Zygorhynchus moelleri。上述本发明的莫勒接霉菌已于2010年11月8日提交保藏，具体保藏信息如下保藏单位名称中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期2010年11月08日；保藏编号CGMCCNo. 4315。本发明的所述的莫勒接霉菌(CGMCC No. 4315)具有如下的特征SMA上20°C菌落生长较快，6天长满全皿，土灰色，边缘颜色较浅，棉絮状，似青霉 药味；孢子囊球形，略扁，初浅黄色，成熟后黑褐色，直径30 75 μ m ；囊轴多为扁平的球形、 半球形，有的菌株为倒卵形，无色，壁光滑，大小为20 34(50) μ m ；孢囊孢子多 为矩形或椭圆形，少数卵形，个别近球形，壁光滑，无色，大小2. 5 3 X 3. 5 5 μ m ；在基础 菌丝和侧生孢囊梗上生有接合孢子，近球形，表面具有许多疣状突起，初呈黄褐色，成熟为 黑褐色；厚垣孢子在基础菌丝中很丰富。发明人还发现，该菌在转化人参皂苷Rb1制备Rd的反应中，能专一地作用于底物 人参皂苷Rb1,将其转化为人参皂苷Rd ；并且产物只有Rd，无副产物生成。基于上述研究结果，本发明进一步提供一种利用所述的莫勒接霉菌(CGMCC No. 4315)转化底物人参皂苷Rb1生产人参皂苷Rd的方法。所述的制备人参皂苷Rd的方法，其一是原位转化法，即将活化的莫勒接霉菌 (CGMCC No. 4315)点种至含有人参皂苷Rb1的PDA培养基上，于25°C静置培养5 7天。搜 集培养基中的转化产物即可。该方法适用于小量生产人参皂苷Rd。所述的制备人参皂苷Rd的方法之二是微生物酶转化法，是将活化的莫勒接霉菌 (CGMCC No. 4315)接种于产酶培养基上，于培养5 7天；收集酶液并将其与人参皂苷 Rb1混合后，于40°C下反应24h ；所述的产酶培养基是每20mL去离子水中加入麦麸15g和 豆粕5g，经121°C，1. OkPa高压灭菌30min。其中所述的酶液收集方法是加入与产酶培养 基等体积的PH 5. 0醋酸-醋酸钠缓冲液，搅拌1 池；纱布过滤，滤液在8000r/min下离 心IOmin ；取离心上清液，加入3倍产酶培养基体积的95%乙醇，优选0 4°C乙醇，4°C沉 淀4h ；8000r/min下离心lOmin，去掉上清液，沉淀溶于pH 5. 0醋酸-醋酸钠缓冲液并在该 缓冲液中透析，离心收集上清液即可。采用本发明的技术方案生产人参皂苷Rd，具有专一性强、简单方便、安全可靠、成 本低且无副产物的特点。发酵产物Rd的纯度在90%以上，转化率可达到60%以上。
本发明附图3幅，图1是人参皂苷Rb1转化为Rd的转化途径示意图；图2是本发明的莫勒接霉菌形态照片，其中A是孢囊；B是囊轴；C是孢囊孢子；D、 E是接合孢子；图3是本发明的莫勒接霉菌转化不同底物单一性及产物单一性试验的TLC结果。
具体实施例方式下面以具体实施例的方式对本发明的技术方案作进一步的说明，但本发明不以任 何形式受限于实施例的内容。无特殊说明，本发明所用的仪器和试剂包括人参总皂苷、 各种人参单体皂苷对照品，购自吉林大学基础医学院；薄层层析板Silica Gel-60F254, 德国MERCK公司产品；高效液相色谱分析仪(岛沣LC-20AD)，色谱柱为C18kromaSi 1 0DS2250mmX4. 6mm, 5 μ m,中科院大连化学物理研究所提供；其他试剂均为分析纯试剂。如无特殊说明，本部分产物检测所采用的TLC及HPLC条件为TLC检测薄层层析板Silica Gel_60F254 ；展开剂V (氯仿)V(甲醇)V (水) =7:3: 0. 5 !^04水溶液，于110°C下烘干显色。HPLC 检测(1)样品处理将萃取液在lOOOOr/min，离心lmin，用直径为0. 22 μ m的微孔滤膜
过滤ο(2) HPLC条件流速0. 6mL/min ；检测波长203nm ；柱温；流动相A为乙腈，B 为高纯水；梯度洗脱流动相的比例0min，A为20%，B为80% ； 18min，A为40%，B为60% ； 38min，A 为 80%，B 为 20%;48min，A 为 100%，B 为 0%;58min，A 为 80%，B 为 20%;78min， A 为 40%，B 为 60% ；78 90min，A 为 20%，B 为 80%。在该HPLC条件下，底物Rb1,出峰时间为23. 139min ；转化产物出峰时间为 25. 237min ；Rd标准品出峰时间为25. 506min，可以进一步确定转化产物为Rd。实施例1 菌株的分离筛选1、分离人参内生菌选取新鲜健康的人参，用自来水冲洗干净，经滤纸吸干水分 后，先用0. 升汞浸泡1 1.5min，经无菌水冲洗4 5次；再用75%酒精浸泡1 1. 5min，经无菌水冲洗3 4次。在无菌条件下，采用经灭菌的手术剪将人参根系剪成小块 (2mmX 2mm)，分别置于直径9cm的PDA平板上。5 7d后观察组织块周围有无菌落形成，并 挑取内生真菌菌丝接种到PDA斜面培养基上纯化和保存。培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)马铃薯200g，葡萄糖18g，琼脂 18g,lOOOmL。本实施例所采用的人参(Panax ginseng C. A. Mey)通过自行采集的方式获得，由 发明人于是2009年8月采自辽宁省桓仁县。2、菌株筛选(1)初步筛选制备固体转化培养基制备培养基小块(cp5mmXH5mm)，分别 将已活化好的真菌点种至块状培养基上，于25°C静置培养5 7d，将菌块浸泡在0. 5mL正 丁醇中，取上清液进行TLC分析。所述固体转化培养基是每IOOmL培养基中含马铃薯20g，葡萄糖1. Sg,琼脂 1. 8g，人参总皂苷20g ；去离子水配制，121°C，1. OkPa高压灭菌30min。(2)复筛将已初步筛选出来的活性菌种接种于产酶培养基上，28°C培养5 7d。 加入IOOmL pH 5. 0醋酸-醋酸钠缓冲液，搅拌1 2h。用纱布过滤，滤液在8000r/min下 离心lOmin，取上清液加入300mL 95%冰乙醇，4°C沉淀4h，8000r/min下离心lOmin，倒掉上 清液，沉淀溶于IOmL缓冲液中。在该缓冲液中透析，离心收集上清液即为酶液。取0. ImL 与等体积的单体皂苷溶液(溶剂是上述醋酸-醋酸钠缓冲液，浓度10mg/ml)混合，40°C下反应Mh，加入0. 2mL正丁醇萃取lh，取上清液进行TLC检测。所述产酶培养基是麦麸15g，豆粕5g，20mL去离子水，经121°C，1. OkPa高压灭菌 30mino3、菌株保存及活化培养筛选出的菌株接种于PDA斜面培养基上，于4°C冰箱内短期保存。需长期保存的菌株采用低温冷冻干燥法保存，使用前活化SMA培养基 DextroselOg, Asparagine 2g, KH2PO4O. 5g, MgSO4· 7H20 0. 25g,Thiamine chlorideO. 5mg, 琼脂15g，蒸馏水1000ml ；温度:20°C。经过鉴定，分离筛选到的真菌(CGMCC No. 4315)是莫勒接霉菌，拉丁名 Zygorhynchus moelIeri，其形态学特征如附图2所示。实施例2 转化单一性试验采用实施例1步骤2 (2)的方法，试验筛选得到的莫勒接霉菌(CGMCCNo. 4315)对 人参皂苷底物及产物的转化选择性，经TLC检测，结果如附图3所示可以看出，对原二醇类皂苷RbpRtvR^Rd为底物的转化反应中，本发明筛得的莫 勒接霉菌(CGMCC No. 4315)仅对底物Rb1发生反应，且转化产物仅为一种，根据Rf值可以 初步判断该产物为Rd。具有很好的底物选择性及产物单一性。实施例3 固体转化法制备Rd①配制固体转化培养基(PDA)每IOOmL培养基中含马铃薯20g，葡萄糖1. Sg,琼 脂1. 8g,人参皂苷Rb^Og ；去离子水配制，121°C，1. OkPa高压灭菌30min。②将活化的莫勒接霉菌(CGMCC No. 4315)点种至上述含有人参皂苷Rb1的PDA培 养基上，于25°C静置培养5 7天。③产物提取分离以正丁醇浸泡培养物，充分提取；提取液在lOOOOr/min，离心 Imin,用直径为0. 22 μ m的微孔滤膜过滤后，HPLC分离目标产物，HPLC条件流速0. 6mL/min ；检测波长203nm ；柱温35°C ；流动相A为乙腈，B为
高纯水；梯度洗脱流动相的比例Omin，A 为 20%，B 为 80% ；18min，A 为 40%，B 为 60% ；38min，A 为 80%，B 为 20% ；48min，A 为 100%，B 为 0% ；58min，A 为 80%，B 为 20% ；78min，A 为 40%，B 为 60% ；78 90min，A 为 20%，B 为 80%。收集M 27min洗脱液，脱除溶剂即可得产物Rd。经检测，产物Rd的纯度93%， 底物转化率64%。实施例4 微生物酶法制备Rd①配制产酶培养基麦麸15g，豆粕5g，20mL去离子水，经121°C，1. OkPa高压灭菌 30mino②将活化的莫勒接霉菌(CGMCC No. 4315)接种于产酶培养基上，于培养5 7天；③收集酶液加入与产酶培养基等体积的pH 5. 0醋酸-醋酸钠缓冲液，搅拌1 2h ；纱布过滤，滤液在8000r/min下离心IOmin ；取离心上清液，加入3倍产酶培养基体积 的95%冰乙醇(0 4°C )，4°C沉淀4h ；8000r/min下离心lOmin，去掉上清液，沉淀溶于pH 5. O醋酸-醋酸钠缓冲液并在该缓冲液中透析，离心收集上清液即得酶液；④将所得酶液与等体积人参皂苷Rb1溶液混合，于40°C下反应Mh，该人参皂苷Rb1 溶液溶剂为步骤③所述及的醋酸-醋酸钠缓冲液，浓度10mg/ml⑤以正丁醇为溶剂萃取反应液中的产物，按照实施例3步骤③的操作提取分离产 物。经检测，产物Rd的纯度92 %，底物转化率70 %。
权利要求
1.一种人参内生莫勒接霉菌(CGMCC No. 431 ，其特征在于该菌具有转化底物人参皂 苷Rb1制备Rd的能力。
2.权利要求1所述的人参内生莫勒接霉菌(CGMCCNo. 431 ，其特征在于该菌专一性 作用于底物人参皂苷Rb1,将其转化为人参皂苷Rd。
3.权利要求2所述的人参内生莫勒接霉菌(CGMCCNo. 431 ，其特征在于该菌与人参 皂苷Rb1反应产物只有Rd，无副产物生成。
4.制备人参皂苷Rd的方法，其特征在于利用权利要求1、2或3所述的莫勒接霉菌 (CGMCC No. 4315)
5.权利要求4所述的制备人参皂苷Rd的方法，其特征在于是将活化的莫勒接霉菌 (CGMCC No. 4315)点种至含有人参皂苷Rb1的PDA培养基上，于25°C静置培养5 7天。
6.权利要求4所述的制备人参皂苷Rd的方法，其特征在于是将活化的莫勒接霉菌 (CGMCC No. 4315)接种于产酶培养基上，于培养5 7天；收集酶液并将其与人参皂苷 Rb1混合后，于40°C下反应24h ；其中所述的产酶培养基是每20mL去离子水中加入麦麸15g和豆粕5g，经121 °C， 1. OkPa高压灭菌30min。
7.权利要求6所述的制备人参皂苷Rd的方法，其特征在于所述的酶液收集方法是 加入与产酶培养基等体积的PH 5.0醋酸-醋酸钠缓冲液，搅拌1 ；纱布过滤，滤液在 8000r/min下离心IOmin ；取离心上清液，加入3倍产酶培养基体积的95%乙醇，4°C沉淀 4h ；8000r/min下离心lOmin，去掉上清液，沉淀溶于pH 5. O醋酸-醋酸钠缓冲液并在该缓 冲液中透析，离心收集上清液即可。
8.权利要求7所述的制备人参皂苷Rd的方法，其特征在于所述的乙醇温度O 4°C。
全文摘要
一种人参内生莫勒接霉菌(CGMCC No.4315)，该菌具有转化底物人参皂苷Rb1制备Rd的能力，并且具有很高的底物单一性和产物单一性。利用该菌制备人参皂苷Rd可以采用原位转化，将其点种至含有人参皂苷Rb1的PDA培养基上，于25℃静置培养5～7天。或者采用微生物酶法，将其接种于产酶培养基上，于28℃培养5～7天；收集酶液并将其与人参皂苷Rb1混合后，于40℃下反应24h。采用本发明的技术方案生产人参皂苷Rd，具有专一性强、简单方便、安全可靠、成本低且无副产物的特点。发酵产物Rd的纯度在90％以上，转化率可达到60％以上。
文档编号C12N1/14GK102080049SQ20101057200
公开日2011年6月1日 申请日期2010年12月3日 优先权日2010年12月3日
发明者吕国忠, 孙晓东, 张薇 申请人:大连民族学院