鉴定转基因植物中目标基因拷贝数并筛选低拷贝植株的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及转基因植物检测技术领域和作物育种领域，具体地说，涉及一种高通 量鉴定转基因植物中目标基因拷贝数并筛选低拷贝植株的方法。
【背景技术】
[0002] 目前，植物转基因领域应用较为成熟的转化方法包括基因枪法和农杆菌介导转化 法两种。在这两种方法中，外源基因均被随机地插入到植物基因组中，通常情况下一般会在 染色体上插入一个或多个外源基因拷贝。大量实验表明，多拷贝插入往往会造成转化植株 出现外源基因表达沉默现象，往往只有插入单拷贝或双拷贝的外源基因才会在转基因植物 中高水平表达。此外，对于转基因育种行业，能够筛选得到TO代外源基因单拷贝插入植株， 将使后续外源基因mRNA及蛋白层面上的筛选更加可靠，同时也更有利于筛选得到稳定遗 传的转基因纯合植株，加快植物育种进程。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种高通量鉴定转基因植物中目标基因拷贝数并筛选低拷 贝植株的方法。
[0004] 本发明采用Real-Time实时荧光定量PCR技术，选取合适的物种标准化基因（即 内参基因），与外源基因进行相对定量的检测，通过二者的扩增曲线，计算外源基因拷贝数， 再结合传统的Southern杂交技术，对获得的拷贝数进行校正。按照对转基因作物不同拷贝 数的需求，通过本方法，可以快速、高通量的检测和筛选到转基因作物中所需的拷贝植株。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明的一种高通量鉴定转基因植物中目标基因拷贝数并 筛选低拷贝植株的方法，包括以下步骤：
[0006] 1)提取待测转基因植物基因组DNA;
[0007] 2)筛选目标基因荧光定量PCR引物与内参基因荧光定量PCR引物，保证目标基因 和内参基因扩增效率一致；
[0008] 3)以转基因植物的基因组DNA为模板，分别用目标基因引物和内参基因引物进行 荧光定量PCR;指定一个荧光信号阈值，根据目标基因和内参基因的循环次数的差值，确定 待测转基因植物中的目标基因的拷贝数；
[0009] 4)筛选低拷贝转基因植株；
[0010] 5)通过Southern杂交技术，对获得的拷贝数进行校正。
[0011] 本发明中涉及的转基因植物是转基因水稻或玉米等。
[0012] 当所述转基因植物是转基因水稻时，所述目标基因是抗草甘膦基因 Epsps-CP4(SEQIDNo. 2)，所述内参基因是水稻Actin7基因（SEQIDNo. 7)。目标基因荧光 定量PCR引物包括正向引物和反向引物，其核苷酸序列分别如SEQIDNo. 5和6所示，内参 基因荧光定量PCR引物包括正向引物和反向引物，其核苷酸序列分别如SEQIDNo. 9和10 所示。
[0013] 对转基因水稻进行荧光定量PCR扩增时，反应体系为：FastStartUniversalSYBR GreenMaster[R0X]5iil，300nM的正、反向引物各I. 25iil、模板DNA2. 5iil;反应程序为： 95°CIOmin;95°C10sec，6(TC30sec，共 28 个循环。
[0014] 当所述转基因植物是转基因玉米时，所述目标基因是绿色荧光蛋白基因GFP(SEQ IDNo. 1)，所述内参基因是玉米Ivrl基因（SEQIDNo. 8)。目标基因荧光定量PCR引物包括 正向引物和反向引物，其核苷酸序列分别如SEQIDNo. 3和4所示，内参基因荧光定量PCR 引物包括正向引物和反向引物，其核苷酸序列分别如SEQIDNo. 11和12所示。
[0015] 对转基因玉米进行荧光定量PCR扩增时，反应体系为：FastStartUniversalSYBR GreenMaster[R0X]5iil，300nM的正、反向引物各I. 25iil、模板DNA2. 5iil;反应程序为： 95°CIOmin;95°C10sec，6(TC30sec，共 32 个循环。
[0016] 前述的方法，步骤3)中荧光信号阈值为0. 2,RQ值为0. 1-1. 5。
[0017] 前述的方法，步骤2)中筛选目标基因荧光定量PCR引物与内参基因荧光定量PCR 引物时所用的DNA模板为待测转基因植物基因组DNA。
[0018] 本发明技术方案中的要求及方法原理如下：
[0019]RQ值=2 (CtACtB)
[0020] 理想PCR反应中，PCR产物扩增随着循环数增加进行指数扩增。
[0021] Xn =X0*2n
[0022] 其中，
[0023]Xn :第n次循环后的产物量
[0024]X。：起始模板量
[0025]n:PCR循环数
[0026]因此，X。=Xn/2n
[0027] 对于进打突光定量PCR的两个基因，目标基因A和内参基因B :
[0028]A0 = An/2n
[0029]B0 = Bn/2n
[0030] 当PCR扩增特异时，荧光信号正好等于PCR产物的量。指定一个荧光信号阈值，此 时产物的量记为T。当荧光信号刚好达到设定的阈值时所经历的循环数称为Ct值，则：
[0031]A0 = T/2CtA
[0032]B0 = T/2CtB
[0033]RQ= A0/B0 = (T/2CtA) / (T/2CtB) = (l/2CtA) / (l/2CtB) = 2CtB/2CtA = 2CtB-CtA = 2(CtAct?
[0034] 如果是双倍体物种，选择的内参基因在基因组上是单拷贝的，此时RQ值为0. 5,则 表示检测的样品外源基因在基因组上为单拷贝，RQ值为1则表示为双拷贝。本发明中的转 基因植物，水稻和玉米均为双倍体，内参基因在基因组上是单拷贝。
[0035] 本发明中定量PCR采用384孔板模块，10ill扩增体系，每个基因做双重重复，在 30个循环左右完成扩增，既准确又高效。利用本发明方法，每人每天可以检测1000个样品。
[0036] 本发明的方法简单易行，可高通量的检测并筛选到含低拷贝目标基因的转基因植 株，为高效的大规模商业化生产高质量转基因植物提供了鉴定基础。
[0037] 与传统拷贝数鉴定方法相比，本发明方法具有简便、快速、准确的优点。本方法无 需绘制标准曲线，只需要计算RQ值，采用本发明描述步骤，整体流程简化便捷；采用本发明的 突光定量PCR技术，水稻仅需进行28个反应循环，玉米仅需32个循环，定量反应速度得到明 显提升；本方法所得拷贝数结果，通过Southern杂交鉴定进一步验证了结果的可靠性。
[0038] 采用本发明提供的方法可以大规模、高通量、稳定地检测出多种转基因作物插入基 因的拷贝数，通过本发明可以建立一整套高效可靠的转基因作物筛选工业标准，具有很高的 准确性及通用性，尤其适合大规模检测转基因样品的生物技术企业以及分子育种单位。
【附图说明】
[0039] 图1为本发明实施例1中水稻内参基因Actin7和外源基因Epsps-CP4的扩增效 率检测图。
[0040] 图2为本发明实施例2中玉米内参基因Ivrl和外源基因GFP的扩增效率检测图。
[0041] 图3为本发明实施例1中水稻外源基因Epsps-CP4的Southern杂交检测图；其 中，M:MarkerIII分子量标准；1-7:本发明制备的转基因植株编号；N:阴性对照。
[0042] 图4为本发明实施例2中玉米外源基因GFP的Southern杂交检测图；其中，M: MarkerIII分子量标准；1-7:本发明制备的转基因植株编号；N:阴性对照。
【具体实施方式】
[0043]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:alaboratorymanual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。 [0044]实施例1鉴定转基因水稻中目标基因拷贝数并筛选低拷贝植株
[0045] 一、高通量抽提水稻基因组DNA
[0046] 本实施例中转基因水稻（含目标基因Epsps-CP4基因）来源于中国种子集团有限 公司。
[0047] 1、取约0. 5g的转基因植物幼嫩叶片分别装入96孔取样管中，于_70°C保存备用；
[0048] 2、每个取样管中加入2颗钢珠，然后加入300iU2XCTABDNA提取缓冲液（试剂配 制方法参见），盖紧管盖，将整板样品放置于上磨样机上打样，1400rpm，90s;
[0049] 3、检查样品破碎情况，将打碎后的样品放置于水浴锅或烘箱中，65°C，水浴 3〇-60m；
[0050] 4、取下管盖，每管样品加300ill氯仿，盖紧取样管盖，脱色摇床上200rpm震荡 IOmin；
[0051] 5、4000rpm，4°C离心 5min;
[0052] 6、准备96孔PCR板，加入70ill异丙醇，小心从离心好的取样管中取70ill上清 液加入PCR板中，枪头轻轻吸打2-3次，-20°C静置30min以上，或沉淀过夜；
[0053] 7、4000rpm，4°C离心 30min;
[0054] 8、小心弃去上清液，吸水纸吸干96孔PCR板表面残液，加入50iU75%酒精；
[0055]9、4000rpm，4°C离心 2〇_3〇min，弃上清液，瞭干；
[0056] 10、每孔样品加 70UlddH2O溶解DNA，-20°C保存。
[0057]二、目标基因与内参基因引物筛选
[0058] 在利用荧光定量PCR检测拷贝数的操作中，首先需要选择一或两个内参基因作为 物种内标准化基因，来对定量PCR数据进行归一化分析。本实施例中选择水稻Actin7基因 作为内参基因。最终通过与物种内已知拷贝数的内参基因比较来分析目标基因的拷贝数。
[0059] 1、引物设计
[0060] (I)PCR产物长度应在 80-250bp之间，100-150bp最佳。
[0061] (2)引物的长度通常为18-27bp，退火温度一致。
[0062] (3)引物GC含量在40-60% (最好45-55% )。序列应避免碱基的连续重复出现， 个别部分避免GCrich或ATrich(特别是3'端）。
[0063] (4)引物内部或两条引物之间避免3个碱基以上的互补序列。
[0064] (5)使用BLAST检索，确认引物特异性，避免引物二聚体或非特异性扩增的存在。
[0065] 2、反应性能确认
[0066] 引物扩增效率E值在0? 8-1. 2之间，决定系数R2在0? 999-1之间。荧光定量PCR 在30个循环内可得到好的定量结果，40个循环内无非特异性产物扩增和引物二聚体产生。
[0067] (1)标准曲线分析目标基因与标准化基因的扩增效率
[0068] 通过浓度梯度稀释的方法确定PCR扩增效率，将标准品DNA稀释5~6个梯度。 理想的标准品扩增曲线：基线平整、阴性为水平线、指数区较明显，陡度大、平台区汇于一 起、线性范围宽。目标基因与标准化基因扩增效率一致。水稻内参基因Actin7和外源基因 Epsps-CP4的效率检测如图1所示，Efficiency达到0? 999,即效率为99. 9%，证明该定量引 物达到检测要求，内参和外源基因扩增效率一致。
[0069] (2)融解曲线分析
[0070] 产物单一的溶解曲线仅出现单峰。
[0071] 三、拷贝数的定量检测
[0072] 1、定量反应体系的制备
[0073] 本实施例中进行荧光定量PCR反应，采用的试剂为Roche公司生产的FastStart UniversalSYBRGreenMaster[ROX] (Cat.