人促造血细胞增殖的细胞因子及其制备方法和用途的制作方法

专利名称：人促造血细胞增殖的细胞因子及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞因子，尤其是一种人促造血细胞增殖的细胞因子及其制备方法和用途。
背景技术：
后基因组时代是蛋白质结构与功能的研究时期。随着生命科学理论的的不断完善，实验技术的不断发展，越来越多的结构性蛋白被发现在机体内发挥着举足轻重的生理功能。pNH是结构蛋白糖蛋白4(PRG4，又称SZP，关节滑膜蛋白)的一个不同剪接体形式，由PRG4的部分第2外显子、完整的第3外显子和部分第6外显子组成；cDNA序列5’端两个外显子分别编码两个促细胞生成素B(SMB)结构域，3’端外显子编码PTT/XP黏液素样重复序列。其中第一个SMB结构域N端缺失15个氨基酸，此序列内包含一对二硫键。1972年一个依赖于生长激素发挥功能的血清生长因子被命名为促细胞生成素B(Somatomedin B，SMB)。它能够刺激神经胶质细胞DNA的合成。在人血浆和hemofiltrate中都能检测到游离的可溶性SMB蛋白。其后，不同的研究小组发现不少蛋白中含有与SMB同源的序列，称为人促细胞生成素B样结构域(SMB like domain)，含有39到51个氨基酸残基不等。
1999年Flannery从培养的牛软骨单层细胞，2001年Gregory等从人关节滑液成纤维细胞和关节软骨细胞中RT-PCR SZP序列时得到SZP第4、第5外显子缺失的全长产物，作为鉴定用，但是没有进行进一步的表达活性鉴定等工作。
SZP/MSF的SMB结构域Cys位点与玻连蛋白(Vitronectin，Vn)SBM结构域有同源性，但是Cys的旁侧序列完全不同。两者的这一结构域在功能上有很大的差异，后者能结合PAI-1，而MSF则不能；显示了两者在功能上的差别。为研究二硫键拓扑结构，2002年Kamikubo曾表达了人Vn的SMB结构域。
目前造血干细胞体外培养扩增技术尚未完全成熟。培养过程中干细胞数量不足，易分化等问题有待解决。在培养体系中加入一定的细胞因子成为手段之一。比如能刺激定向分化的祖细胞的扩增的IL-3，对巨噬祖细胞有刺激作用的GM-CSF，TPO作用于巨核祖细胞，SCF促进造血干细胞扩增。在血液病治疗药物研究过程中，红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)，粒细胞克隆形成刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)和粒细胞-巨核细胞刺激因子(granulocyte-macrophage stimulatingfactor，GM-CSF)是三个已被批准用于肿瘤治疗的细胞因子，在治疗化疗后的贫血和嗜中性白细胞减少症状中功效显著。人白介素3受体高亲合的配体类似物，(Synthokine)，人白介素3和G-CSF受体激活剂(myelopoietin MPO)，和刺激人IL-3、c-mpl受体的promegapoietin(PMP)能刺激多分化潜能的造血祖细胞的增殖，正在接受临床实验。其中，EPO是首个利用克隆技术基因重组表达的造血相关的生长因子，用于调节肿瘤相关的贫血。发现并研究新的细胞生长因子应用于血液细胞培养体系是当前的研究重点之一。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种人促造血细胞增殖的细胞因子及其制备方法和用途，即pNH。包括pNH cDNA的克隆及在原核中的表达，重组蛋白的制备纯化，物理化学特性和生物学功能的鉴定。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种人促造血细胞增殖的细胞因子，所述人促造血细胞增殖的细胞因子pNH由SEQ ID NO.2所列氨基酸序列的蛋白质组成。
编码pNH的cDNA分子，由SEQ ID NO.1所列核苷酸序列的全部或片段。
一种编码pNH的cDNA的克隆方法，包括以下步骤1)根据SEQ ID NO.2所列氨基酸序列，用已知的遗传密码推测出与这些氨基酸相应的核苷酸序列；2)设计特异性引物，以pfu DNA聚合酶进行PCR扩增，所述特异性引物为扩增pNH的片段的上游引物为5’-GCCATGGATGCCACCTGCAACTGTGAT-3’，下游引物为5’-gCCTCgAgAGTTGTGACCTTGAAGTCACCAT-3’。
3)用特异性cDNA扩增产物作为探针，从人cDNA文库中筛选出pNH的cDNA，所述特异性cDNA扩增产物为编码1)所述的pNH氨基酸序列的核苷酸。
所述人cDNA文库为人胚胎肝细胞cDNA文库。
一种表达pNH的质粒，含上述方法所得到的cDNA。
所述质粒以pET32c(+)或pET22b(+)构成。
一种SEQ ID NO.2所列氨基酸序列的pNH的纯化方法，包括以Ni2+螯合层析柱纯化融合蛋白，肠激酶酶切融合蛋白，ResourceQ阴离子交换层析纯化，或以Ni2+螯合层析柱纯化分泌型蛋白，Superdex75凝胶过滤纯化。
一种药物组合物，包含SEQ ID NO.2所列氨基酸序列的pNH蛋白。
一种用于研究造血细胞增殖pNH的试剂，包含SEQ ID NO.2所列氨基酸序列的pNH蛋白。
用于制备抗pNH的单克隆或多克隆抗体的抗原，包含SEQ ID NO.2所列氨基酸序列的pNH蛋白。
本发明的有益效果是1、利用本发明克隆的pNH片段，构建工程菌表达体系，表达纯化目的蛋白，为研究SMB结构域功能提供技术支持。
2、pNH蛋白可作为造血细胞增殖的生长因子，可以用于造血细胞增殖分化中细胞与因子相互作用的机理性研究，亦可作为实验试剂大规模生产。
3、pNH及其各个结构域多肽片段可以作为低分子量生物制剂应用于临床造血功能障碍的疾病，具有分子量低免疫原性弱的优点。
4、pNH序列片段长度适中，可用于构建各类基因治疗载体，治疗造血功能障碍类疾病。
5、SMB结构域3D结构解析结果在各研究小组之间存在颇多争议。pNH蛋白为SMB结构域空间结构的解析提供了基础，通过蛋白晶体生长，X-Ray衍射获取空间结构信息和二硫键拓扑结构。
6、pNH及其多肽可用于制备多克隆抗体和单克隆抗体，用于ELISA实验。


图1A是pET32c(+)-重组pNH蛋白表达载体的构建。
图1B是pET22b(+)-重组pNH蛋白表达载体的构建。
图2A是SDS-PAGE分析pNH的诱导表达pNH融合蛋白表达带，其中1.未诱导pET32c(+)-pNH-BL21，2.诱导后pET32c(+)-pNH-BL21，3.超声破菌后的上清，4.镍柱洗涤，5.镍柱洗脱融合蛋白，M.Marker(单位kD)。
图2B是SDS-PAGE分析pNH的还原-非还原电泳纯化后的pNH蛋白，其中1.还原状态，2.非还原状态，M.Marker(单位kD)。
图3A是重组人pNH蛋白的Western Blot鉴定。
图3B是等电聚焦测定pNH等电点和纯度，其中1.pNH蛋白，M.pI标准Marker。
图4A与PBS对照，pNH对处于对数生长期的U937细胞生长增殖的影响。
图4B与PBS对照，pNH对PMA刺激3天的已分化贴壁的U937细胞生长增殖的影响。
图5A与PBS对照，pNH对处于对数生长期的K562细胞生长增殖的影响。
图5B与PBS对照，pNH对PMA刺激3天的K562细胞生长增殖的影响。
具体实施例方式
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细说明但是本发明并不仅仅局限以下实施例。
实施例1人pNH基因的克隆及原核表达载体的构建1.1人pNH基因的克隆取5个月大流产胎儿肝组织100mg，将组织置于研钵内，并加入少量液氮，磨成粉末，然后加入1ml Trizol(购自Invitrogen公司)，将此研钵中的混悬液转入1.5ml的离心管，然后加入0.2ml的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒；取上层液体于一新的离心管，加入0.5ml异丙醇，混匀，室温放置20分钟，12000g离心15分钟；弃去上清液，加入1ml的80％乙醇，4℃下7500g离心5分钟；小心弃去上清液，然后室温或真空干燥10-15分钟，然后将RNA溶于水中，用分光光度计测定A260/A280，计算RNA含量，并经12g/L琼脂糖凝胶电泳证实RNA完整。20μl逆转录反应体系含2μg总RNA，4μl RT缓冲液，50pmol/L oligo(dT)16，1μmol/L dNTPs，0.1μmol/L DTT，15U RNA酶抑制剂(Takara)，200U M-MLV(购自Invitrogen公司)，于65℃水浴5min，冰浴5min，37℃水浴60min，70℃15min终止反应，所得cDNA-20℃保存备用。根据人PRG4基因序列(NM_005807)利用gene runner软件设计引物，分别于正义链5′端加NcoI反义链5′端加Xho I酶切位点，pNH正义链引物5’-GCCATGGATGGCATGGAAAACACTTCCCA-3’；反义链引物5’-GGCTCGAGCTAAGGACAGTTGTACCAGACTTTGG-3’，PCR产物全长3937bp，预计PCR片段长度3952bp。应用Pyrobest DNA聚合酶(购自Takala公司)扩增人pNH基因，PCR反应条件95℃预变性5min，94℃45s，68℃5min，32个循环，72℃15min。回收纯化后的PCR产物克隆入pMD18-T载体(购自Takala公司)中，命名为pMD18-PRG4Δ。
1.2 pNH改构体原核表达载体的构建上述细胞因子可以通过多种方法制备。其中包括将cDNA序列装入pET32c(+)和pET22b(+)原核表达载体中构建成原核表达系统。
pMD18-PRG4Δ经测序鉴定正确，以其为模板，用上游引物5’-GCCATGGATGCCACCTGCAACTGTGAT-3’和下游引物5’-gCCTCgAgAGTTGTGACCTTGAAGTCACCAT-3’上下游酶切位点分别为Nco I和Xho I。以pfu DNA聚合酶(购自上海生工)进行PCR扩增，反应条件为95℃预变性5min，94℃ 30s，59℃ 30s，72℃ 50s，25个循环后72℃延伸15min，循环完毕72℃延伸2min后，加入1U Taq DNA聚合酶继续延伸13min。扩增的片段读码框长度为336bp(SEQ ID NO.1)。将PCR产物用凝胶回收试剂盒回收后，连接入pMD18-T载体中，命名为pMD18-pNH。转化E.coli DH5α菌株，在LB平皿中进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆，提取质粒用Nco I和Xho I双酶切，跑1％的琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒(购自博大泰克公司)回收目的片段。与经Nco I和Xho I双酶切原核融合蛋白表达载体pET32c连接后，转化E.coli DH5α菌株，通过酶切鉴定得到含目的片段的重组克隆，并命名为pET32c-pNH，见图1A。将Nco I和Xho I酶切好的pNH-1与经Nco I和Xho I双酶切原核分泌型蛋白表达载体pET22b连接后，转化E.coli DH5α菌株，通过酶切鉴定得到含目的片段的重组克隆，并命名为pET22b-pNH，见图1B。
实施例2重组人pNH蛋白的诱导表达与纯化(方法一)2.1 pNH融合蛋白的制备将实施例1.2中获得的pET32c-pNH转化Rosetta(DE3)(购自Novagen公司)原核表达菌株，在氨卞青霉素和氯霉素双抗性LB培养基琼脂平板上筛选阳性克隆。挑取单个克隆接种于含有氨卞青霉素(50mg/L)和氯霉素(34mg/L)的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600达到0.6-0.8。以1∶100比例接种于含有相同浓度抗生素的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600达到0.6-0.8后，加入IPTG至终浓度为1mmol/L进行诱导表达。4小时后，4℃离心收集菌体。重悬于适量的1×SDS上样缓冲液中，置沸水浴3～5min，取50μl进行SDS-PAGE电泳分析。
2.2 pNH-1融合蛋白的裂解和纯化3ml LB Amp+培养基接种阳性单克隆菌落，37℃摇床培养过夜。以1∶100(v/v)倒管入新鲜培养基，37℃摇床培养至OD600＝0.6，加入IPTG至终浓度1mM。25℃诱导表达7.5h后，8000rpm离心30min收集菌体沉淀。1/10菌液体积的50mM Tris pH8.0混悬菌体，超声破碎菌体.12000rpm离心30min收集上清，内含融合蛋白。
Ni2+螯合层析柱纯化融合蛋白50mM Tris·HCl pH8.0，0.5M NaCl，2mM咪唑平衡镍柱后上样。
50mM Tris·HCl pH8.0，0.5M NaCl，80mM咪唑洗涤，50mM Tris·HCl pH8.0，0.5M NaCl，160mM咪唑洗脱融合蛋白。
以50mM Tris pH8.0缓冲液充分透析融合蛋白，脱盐。超滤浓缩读取280nm紫外吸光度，利用xPASy-ProtParam(http://kr.expasy.org/tools/protparam.html)软件预测的消光系数换算，进行蛋白定量。SDS-PAGE检测融合蛋白，见图2A。
以1mg蛋白3U肠激酶(Invitrogen公司)4℃酶切16h。向酶切体系中加入1M NaCl至终浓度为0.5M.以Resource Q阴离子交换柱、20mM TrispH8.0 0.5M-0M NaCl浓度梯度洗脱分离载体蛋白和目的蛋白及肠激酶。目的蛋白过Superdex200凝胶过滤，进一步纯化并换缓冲液至PBS。SDS-PAGE检测纯品蛋白，见图2B。pNH蛋白含有112个氨基酸残基(SEQ ID NO.2)，包括N末端两个载体氨基酸和C末端的6个组氨酸构成的分离纯化标签，蛋白理论分子量为12.9kD，因N端SMB结构域为半胱氨酸丰富序列，而电泳迁移率偏慢。
纯品超滤浓缩后，Bio-Rad’s DC Protein Assay试剂盒进行蛋白定量，分装，-80℃冻存。
实施例3重组人pNH蛋白的诱导表达与纯化(方法二)3.1 pNH-1分泌型蛋白的制备将实施例1.2中获得的pET22b-pNH-1质粒转化Rosetta(DE3)原核表达菌株，在氨卞青霉素和氯霉素双抗性LB培养基琼脂平板上筛选阳性克隆。挑取单个克隆接种于含有氨卞青霉素(50mg/L)和氯霉素(34mg/L)的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600达到0.6-0.8。以1∶100比例接种于含有相同浓度抗生素的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600达到0.6-0.8后，降温到28℃后加入IPTG至终浓度为1mmol/L进行诱导表达。8小时后，4℃离心收集菌体。重悬于适量的1×SDS上样缓冲液中，置沸水浴3～5min，取50μl进行SDS-PAGE电泳分析。
3.2pNH分泌型蛋白的纯化将高密度发酵(方法参考分子克隆)得到的发酵液离心得到湿菌称重，按重量体积比1∶20加入纯水，将菌体充分悬浮，4℃放置30分钟，12500转离心30分钟，取上清，过镍柱制备出pNH-1粗品。
50mM Tris·HCl pH8.0，0.5M NaCl，2mM咪唑平衡镍柱后上样，50mM Tris·HCl pH8.0，0.5M NaCl，40mM咪唑洗涤，50mM Tris·HCl pH8.0，0.5M NaCl，160mM咪唑洗脱目的蛋白。Vivaspin3000MWCO超滤浓缩离心浓缩样品后过1×PBS缓冲液平衡的Superdex 75凝胶过滤柱，进一步纯化蛋白。根据保留时间收集目的蛋白峰，纯品蛋白超滤浓缩后，以Lowry法进行蛋白定量，分装，-80℃冻存。
实施例4重组人pNH蛋白的鉴定4.2 Western Blotting纯化的目的蛋白浓缩后定量调整浓度为1mg/ml，Western Blot法鉴定目的蛋白。
1)SDS-PAGE电泳参考《分子克隆》所述方法进行。分离胶与浓缩胶浓度分别为15％和5％。


60ul目的蛋白溶液加入10ul6×上样缓冲液，100℃煮沸3min。浓缩胶电泳时电压80V，分离胶电泳时电压为120V。电泳结束，用转移缓冲液浸泡数分钟。
2)蛋白印迹反应PVDF膜剪SDS-PAGE胶大小，纯甲醇浸泡1min，DDW冲洗SDS-PAGE胶、Whatman滤纸、PVDF膜，与衬绒一起在转移缓冲液中浸泡5min。按顺序安装转移装置正极板、衬绒、Whatman滤纸、硝酸纤维素膜、SDS-PAGE胶、Whatman滤纸、衬绒、负极板，夹紧夹子。
电泳槽内倒1×电泳缓冲液，放预冻的冰盒。转移装置垂直置入电泳槽，有胶的一面通阴极。
120V电压200mA电流(8mM/cm2)恒压转移1h转移结束，去除滤纸，SDS-PAGE胶用考马斯亮蓝染液染色检测蛋白转移质量20ml封闭液封闭PVDF膜1h1∶1000加入一抗，孵育1h20mlPBS-T洗膜三次，每次10min10mlPBS-T，1∶1000加入二抗，孵育1h20mlPBS-T洗膜三次，每次10min显色液10ml加50ulH2O2，放膜显色，大约2-5min。
待蛋白带显色清晰，水洗膜，晾干，避光保存，见图3A。
4.2等电聚焦电泳xPASy-ProtParam(http://kr.expasy.org/tools/protparam.html)用于预测蛋白的理论等电点为6.47。
等电聚焦实验鉴定目的蛋白实际等电点。
按照实验手册Instruction 1818-A操作(LKB-Produkter AB公司)0.55mm聚丙烯酰氨薄层胶，pH3.5-9.5载体两性电解质，Marker为宽范围等电点标准试剂盒(pI 3.5-9.3)(Amersham Biosciences公司)。
样品脱盐到水，调整浓度为1mg/ml。
制胶上平板洗净后，DDW冲洗晾干；均匀涂硅烷于玻板，晾干；DDW冲洗，晾干。下平板铺疏水膜。两板疏水面相对。
配碱性胶(T＝5％C＝3％)AB 2.5mlLKB0.9mlDDW11.5mlTEMED 8ul抽气10min 加AP 75ul灌胶。40℃烘箱促凝。
剥胶，0.5cm宽厚滤纸条，长度略短于胶长；加电极缓冲液，阴极NaOH阳极H3PO4；滤纸略吸干，置于胶两极。
煤油均匀铺于电泳板上，放胶，放点样滤纸。
点样20ul，1500V，50mA，20W预聚焦30min后，去除点样滤纸。
电泳至电流趋于0mA。
固定，考马斯亮蓝染液显色，见图3B。
根据电泳条带的位置和等电点数据画出pH梯度曲线，测算目的蛋白pI实施例5促细胞增殖实验5.1体外促U937细胞增殖实验人急性单核细胞白血病细胞系U937以IMDM，10％FCS，1％为培养体系进行培养，至生长状态最佳时接种于96孔培养板，每孔接种5×103个细胞，培养体系采用IMDM，1％FCS，1％青、链霉素。5h后加入不同浓度的pNH，培养72h后每孔加5mg/mlMTT20ul，继续培养4h，1000rpm离心10min，小心弃去上清，每孔加DMSO150ul，震荡10min，490nM测定光吸收值A。
计算细胞增殖率(％)细胞增殖率(％)＝[(实验组A值-PBS组A值)/(PBS组A值-不含细胞的对照组A值)]×100％。
A值的高低可以反映活细胞的数量，实验结果以细胞增殖百分率表示。实验结果证明pNH对U937细胞具有增殖促进作用，细胞生长增加26％-31％，见图4A。
人急性单核细胞白血病细胞系U937以IMDM，10％FCS，1％青、链霉素为培养体系进行培养，至生长状态最佳时接种于6孔培养板，培养体系采用IMDM，15％FCS，1％青、链霉素，每孔接种1×106个细胞/5ml培养基。佛波酯(PMA，Sigma公司)以DMSO溶解成终浓度为162mM，加入K5626孔板培养体系成终浓度为50nM。培养3d时，弃上清，PBS清洗已贴壁分化的细胞后，以终浓度为0.25％的胰酶消化，收集细胞接种于96孔板，以每孔接种5×103个细胞，培养体系采用IMDM，1％FCS，1％青、链霉素。5h后加入不同浓度的pNH，培养72h后MTT检测活细胞数量。
计算细胞增殖率(％)细胞增殖率(％)＝{1-[(PBS组A值-实验组A值)/(PBS组A值-不含细胞的对照组A值)]}×100％。
实验结果证明pNH对已分化的U937细胞略有增殖抑制但差异不明显，见图4B。
5.2体外促K562细胞增殖实验人红白血病细胞系K562以IMDM，10％FCS，1％青、链霉素为培养体系进行培养，至生长状态最佳时接种于96孔培养板，每孔接种5×103个细胞，培养体系采用IMDM，1％FCS，1％青、链霉素。5h后加入不同浓度的pNH，培养72h后每孔加5mg/mlMTT20ul，继续培养4h，1000rpm离心10min，小心弃去上清，每孔加DMSO150ul，震荡10min，490nM测定光吸收值A。
计算细胞增殖率(％)细胞增殖率(％)＝[(实验组A值-PBS组A值)/(PBS组A值-不含细胞的对照组A值)]×100％。
A值的高低可以反映活细胞的数量，实验结果以细胞增殖百分率表示。实验结果证明pNH对K562细胞具有增殖促进作用，细胞生长增加10％-26％，见图5A。
人红白血病细胞系K562以IMDM，10％FCS，1％青、链霉素为培养体系进行培养，至生长状态最佳时接种于6孔培养板，培养体系采用IMDM，15％FCS，1％青、链霉素，每孔接种1×106个细胞/5ml培养基。佛波酯(PMA，Sigma公司)以DMSO溶解成终浓度为162mM，加入K5626孔板培养体系成终浓度为50nM。培养3d、5d后分别收集细胞，PBS洗涤细胞后接种于96孔培养板，每孔接种5×103个细胞，培养体系采用IMDM，1％FCS，1％青、链霉素。5h后加入不同浓度的PNH，培养72h后每孔加5mg/mlMTT20ul，继续培养4h，1000rpm离心10min，小心弃去上清，每孔加DMSO150ul，震荡10min，490nM测定光吸收值A。
计算细胞增殖率(％)细胞增殖率(％)＝{1-[(PBS组A值-实验组A值)/(PBS组A值-不含细胞的对照组A值)]}×100％。
实验结果证明pNH对已分化的K562细胞略有增殖抑制但差异不明显，见图5B。
实施例6重组人pNH多克隆抗体的制备选择优质的2周大新西兰大耳白兔子4-6只，适应性喂养、观察无病一个星期。常规用卡介苗进行基础免疫兔子。一定量的抗原SDS-PAGE电泳考马斯亮蓝染色(或250Mm KCl染色)，将目的带切下，用液氮在研钵中将胶磨碎，与佐剂(1∶1)混合，继续研磨成糊状，免疫家兔。时间为基础免疫一星期后，1-2mg抗原/只。制备的胶为1mg抗原/1g胶。
两周(或三周后)后加强免疫1-2mg抗原/只。
一周后加强免疫1-2mg抗原/只。可用双扩法监测有无抗体产生。
一周后进行第三次加强免疫1-2mg抗原/只。
2周后，取家兔耳缘静脉血，用琼脂双扩散法检测抗HAPO抗体。用ELISA法测定抗体效价。血清中目的抗体为阳性后，大量抽取兔血，收集的血液37℃放置1-2小时，4℃过夜，在无菌的条件下，离心收集血清，分装(0.2ml)，储存于-70℃。
上述实施例证明，本发明所得到的pNH对于幼稚的血细胞的生长有刺激作用，而且不影响已分化的细胞的生长。本发明研究发现含有促细胞生成素B样结构域和少量黏液素样重复序列的pNH蛋白对于幼稚的早期血液细胞具有促进增殖的功能，并且不影响已分化细胞的生长，显示其功能发挥的特异性。临床存在有造血或血管功能性障碍疾病，本发明为pNH因子成为治疗此类疾病的辅助药物提供平台。
SEQUENCE LISTING
<110>中国医学科学院血液学研究所，中国医学科学院血液学研究所泰达尘命科学技术研究中心<120>人促造血细胞增殖的细胞因子及其制备方法和用途<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>336<212>DNA<213>人类(Homo sapiens)<400>1gccatggatg ccacctgcaa ctgtgattat aactgtcaac actacatgga gtgctgccct 60gatttcaaga gagtctgcac tgcggagctt tcctgtaaag gccgctgctt tgagtccttc 120gagagaggga gggagtgtga ctgcgacgcc caatgtaaga agtatgacaa gtgctgtccc 180gattatgaga gtttctgtgc agaagtaaaa gataacaaga agaacagaac taaaaagaaa 240cctaccccca aaccaccagt tgtagatgaa gctggaagtg gattggacaa tggtgacttc 300aaggtcacaa ctctcgagca ccaccaccac caccac336<210>2<211>112<212>PRT<213>人类(Homo sapiens)
<220>
<221>mat_peptide<222>(1)..(112)<400>2Ala Met Asp Ala Thr Cys Asn Cys Asp Tyr Asn Cys Gln His Tyr Met1 5 10 15Glu Cys Cys Pro Asp Phe Lys Arg Val Cys Thr Ala Glu Leu Ser Cys20 25 30Lys Gly Arg Cys Phe Glu Ser Phe Glu Arg Gly Arg Glu Cys Asp Cys35 40 45Asp Ala Gln Cys Lys Lys Tyr Asp Lys Cys Cys Pro Asp Tyr Glu Ser50 55 60Phe Cys Ala Glu Val Lys Asp Asn Lys Lys Asn Arg Thr Lys Lys Lys65 70 75 80Pro Thr Pro Lys Pro Pro Val Val Asp Glu Ala Gly Ser Gly Leu Asp85 90 95Asn Gly Asp Phe Lys Val Thr Thr Leu Glu His His His His His His100 105 110
权利要求
1.一种人促造血细胞增殖的细胞因子，其特征在于，所述人促造血细胞增殖的细胞因子pNH由SEQ ID NO.2所列氨基酸序列的蛋白质组成。
2.编码pNH的cDNA分子，其特征在于，由SEQ ID NO.1所列核苷酸序列的全部或片段。
3.一种权利要求2所述编码pNH的cDNA的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤1)根据SEQ ID NO.2所列氨基酸序列，用已知的遗传密码推测出与这些氨基酸相应的核苷酸序列；2)设计特异性引物，以pfu DNA聚合酶进行PCR扩增，所述特异性引物为扩增pNH的片段的上游引物为5’-GCCATGGATGCCACCTGCAACTGTGAT-3’，下游引物为5’-gCCTCgAgAGTTGTGACCTTGAAGTCACCAT-3’。3)用特异性cDNA扩增产物作为探针，从人cDNA文库中筛选出pNH的cDNA，所述特异性cDNA扩增产物为编码1)所述的pNH氨基酸序列的核苷酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述人cDNA文库为人胚胎肝细胞cDNA文库。
5.一种表达pNH的质粒，其特征在于，含权利要求3方法所得到的cDNA。
6.根据权利要求5所述表达pNH的质粒，其特征在于，所述质粒从pET32c(+)或pET22b(+)构成。
7.一种SEQ ID NO.2所列氨基酸序列的pNH的纯化方法，其特征在于，包括以Ni2+螯合层析柱纯化融合蛋白，肠激酶酶切融合蛋白，ResourceQ阴离子交换层析纯化目的蛋白，或以Ni2+螯合层析柱纯化分泌型蛋白，Superdex75凝胶过滤纯化目的蛋白。
8.一种药物组合物，其特征在于，包含SEQ ID NO.2所列氨基酸序列的pNH蛋白。
9.一种用于研究造血细胞增殖pNH的试剂，其特征在于，包含SEQ ID NO.2所列氨基酸序列的pNH蛋白。
10.用于制备抗pNH的单克隆或多克隆抗体的抗原，其特征在于，包含SEQ ID NO.2所列氨基酸序列的pNH蛋白。
全文摘要
本发明公开了一种人促造血细胞增殖的细胞因子及其制备方法和用途，所述细胞因子由SEQ ID NO.2所列氨基酸序列的蛋白质组成，编码pNH的cDNA分子，由SEQ ID NO.1所列核苷酸序列的全部或片段。以pfu DNA聚合酶进行PCR扩增，扩增pNH的片段的上游引物为5’－GCCATGGATGCCACCTGCAACTGTGAT－3’，下游引物为5’－gCCTCgAgAGTTGTGACCTTGAAGTCACCAT－3’。通过Nco I和Xho I双酶切位点，克隆到原核表达载体上，在工程菌中高效表达，表达纯化目的蛋白，为研究SMB结构域功能提供技术支持。亦可作为实验试剂大规模生产，应用于临床造血功能障碍的疾病，具有分子量低免疫原性弱的优点。
文档编号C12N15/63GK101077887SQ200610013828
公开日2007年11月28日 申请日期2006年5月23日 优先权日2006年5月23日
发明者韩忠朝, 王黎芳, 韩之波 申请人:中国医学科学院血液学研究所, 中国医学科学院血液学研究所泰达生命科学技术研究中心