专利名称：一种l-色氨酸的发酵生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及了一种L-色氨酸的发酵生产工艺。
技术背景L-色氨酸在药品、食品、饲料、化工等行业中有重要应用。天然提取或化 学合成法生产色氨酸存在产量小，产品品质不稳定等诸多因素的影响，L-色氨 酸限制氨基酸使用。而且纯化学合成法，其工艺路线长而复杂，成本高。目前 的微生物发酵法工业化生产L-色氨酸工艺普遍也不成熟。发明内容为克服现有技术的不足之处，本发明的目的就是在于提供一种工艺简单、 成本低、无危险因素、工艺流程合理、自动化程度高、产品质量好、经济效益 高的L-色氨酸的发酵生产工艺。为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下一种L-色氨酸的发酵生产工艺，包括下述步骤-.(1) 种子制备-a、 首先将母种谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)接入装有斜面 培养基的斜面试管中，于28 30'C培养55~72h，斜面应生长丰满，制得斜面试 管菌种；b、 然后再将步骤a的斜面试管菌种接入种子培养基中进行斜面活化，于 28 30。C培养18 24h，制备成摇瓶种子，经镜检，挑选菌丝健壮，分枝多，染色 深，无空泡，无杂菌，效价高的种子备用；c、 将步骤b的摇瓶种子接入装有摇瓶培养基的摇瓶中，于22~26°C，以 250-300转/分的转速培养24~48h，成为一级种子， 一级种子菌丝健壮、稠、无 空泡、分支多；(2) 发酵生产工艺将步骤(1) c的一级种子按体积比计，以0.1 1%的接种量接种于装有发酵 培养基的发酵罐中发酵，发酵前12h通气量要小，风量按l: 0.5 0.8wm， 12h 后逐渐加大，最后风量达到l: 1.5 wm，发酵过程中，温度控制在22~26°C ，罐压保持在0.05 0.07Mpa， pH值控制在6.0~6.1，通过不断加料，维持碳、氮平衡， 经过45~60h后发酵培养成熟。步骤(1) c中，接种量按体积比计为0.5~1%。步骤(l)a中斜面培养基的组成为葡萄糖15g、琼脂粉20g、酵母粉0.08g、 KH2P042.6g、水1000ml，灭菌前pH值8.0-8.2。步骤(1) b中种子培养基和步骤(1) e中摇瓶培养基的组成为葡萄糖15g、 酵母粉0.08g、 KH2P045.6g、 MgS04'7H20 4.6g、 MnSO40.0013g、水lOOOml， 灭菌前pH值8.0 8.2。步骤(2)中发酵培养基的组成为葡萄糖85g、酵母粉0.05g、硫胺素 0.0013g、柠檬二酸钠1.6g、 (NH4) 2S044.2g、 KH2P045.6g、 MgS04.7H20 4.6g、 MnSO40.0013g、水1000ml，灭菌前pH值8.0-8.2。步骤(2)中，通过不断加料，维持碳、氮平衡时的具体操作为利用计量 泵，双路进料， 一路进糖、 一路进氮，保持发酵罐里碳、氮平衡。维持碳、氮平衡的具体操作为正因为通风量随着发酵培养时间的变化逐 渐增大，从原始的l: 0.5 0.8逐渐加大至1: 1.5的；相应的补糖的流量和补充 氨水的流量也会根据发酵培养的改变而进行调整，前期(12h前)，补糖的流量 为1201/h， 12h以后变为150 1/h,补氨水量根据工艺pH值要求变化进行调节， 总体维持碳、氮平衡，保证发酵菌种的正常生长，从而代谢出更多的目的产物。本发明主要是对菌种改良和新发酵工艺的开发，使菌种有谷氨酸棒杆菌， 采用基因工程菌进行生产L-色氨酸的，本发明产酸率达10%，转化率达60%。 本发明由于发酵生产所用的原辅材材料较少，大部分均为无机质材料，投入少， 产出高，另发酵周期短，各种能耗低，故本发明生产成本低，同时本发明发酵 法生产工艺简单、无危险因素、工艺流程合理、自动化程度高、产品质量好、 经济效益高。
具体实施方式
以下以具体实施例结合附图
对本发明作进一步的详细说明，但本发明的保 护范围并不局限于此以下实施中的谷氨酸棒杆菌(Coiynebacterium glutamicum)购买于中国农 业微生物研究所。 实施例1一种L-色氨酸的发酵生产工艺，包括下述步骤(1) 种子制备a、 首先将母种谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)接入装有斜面 培养基的斜面试管中，于28'C培养72h，斜面应生长丰满，制得斜面试管菌种；b、 然后再将步骤a的斜面试管菌种接入种子培养基中进行斜面活化，于 28'C培养24h,制备成摇瓶种子，经镜检，挑选菌丝健壮、分枝多、染色深、无 空泡、无杂菌、效价高的种子备用；c、 将步骤b的摇瓶种子接入装有摇瓶培养基的摇瓶中，接种量为0.5% (体 积比)，于22。C，以250转/分的转速培养48h，成为一级种子， 一级种子菌丝健 壮、稠、无空泡、分支多；(2) 发酵生产工艺将步骤(1) c的一级种子按体积比计，以0.1%的接种量接种于装有发酵 培养基的发酵罐中发酵，发酵前12h通气量要小，风量按l: 0.5~0.8wm， 12h 后逐渐加大，最后风量达到h 1.5 wm，发酵过程中，温度控制在22r，罐压 保持在0.05Mpa，用浓氨水控制pH值在6.0，利用计量泵，双路不断进料，一 路进糖、 一路进氮，发酵前12h,补糖的流量为1201/h, 12h以后变为1501/h， 补氨水量根据发酵液pH值进行调节，总体维持碳、氮平衡，经过60h后发酵培 养成熟。其中，步骤(1) a中斜面培养基的组成为葡萄糖15g、琼脂粉20g、酵 母粉0.08g、 KH2P042.6g、水1000ml，灭菌前pH值8.0;步骤(1) b中种子培 养基和步骤(1) c中摇瓶培养基的组成为葡萄糖15g、酵母粉0.08g、 KH2P04 5.6g、 MgS04.7H20 4.6g、 MnS04 0.0013g、水1000ml，灭菌前pH值8.1;步骤 (2)中，发酵培养基的组成为葡萄糖85g、酵母粉0.05g、硫胺素0.0013g、 柠檬二酸钠1.6g、 (NHf) 2S044.2g、 KH2P045.6g、 MgS04.7H20 4.6g、 MnS04 0.0013g、水1000ml，灭菌前pH值8.0;上述斜面培养基、种子培养基、摇瓶培 养基、发酵培养基的灭菌温度均为121'C，灭菌时间均为30分钟。 本实施例产酸率9.1%,转化率55%。实施例2一种L-色氨酸的发酵生产工艺，包括下述步骤 (1)种子制备a、 首先将母种谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumghitamicum)接入装有斜面 培养基的斜面试管中，于29-C培养63h，制得斜面试管菌种；b、 然后再将步骤a的斜面试管菌种接入种子培养基中进行斜面活化，于 29。C培养20h，制备成摇瓶种子，经镜检，挑选菌丝健壮、分枝多、染色深、无 空泡、无杂菌、效价高的种子备用；c、 将步骤b的摇瓶种子接入装有摇瓶培养基的摇瓶中，接种量为0.7% (体 积比)；于24'C，以270转/分的转速培养36h，成为一级种子， 一级种子菌丝健壮、 稠、无空泡、分支多；(2)发酵生产工艺将步骤(1) c的一级种子按体积比计，以0.5%的接种量接种于装有发酵 培养基的发酵罐中发酵，发酵前12h通气量要小，风量按l: 0.5~0.8wm， 12h 后逐渐加大，最后风量达到l: 1.5 wm，发酵过程中，i^度控制在24'C，罐压 保持在0.06Mpa，用浓氨水控制pH值在6.05，利用计量泵，双路不断进料，一 路进糖、 一路进氮，发酵前12h，补糖的流量为1201/h， 12h以后变为1501/h， 补氨水量根据发酵液pH值进行调节，总体维持碳、氮平衡，经过53h后发酵培 养成熟。其中，步骤(1) a中斜面培养基的组成为葡萄糖15g、琼脂粉20g、酵 母粉0.08g、 KH2P042.6g、水1000ml，灭菌前pH值8.1;步骤(1) b中种子培 养基和步骤(1) c中摇瓶培养基的组成为葡萄糖15g、酵母粉0.08g、 KH2P04 5.6g、 MgS04'7H20 4.6g、 MnS04 0,0013g、水1000ml，灭菌前pH值8.2;步骤 (2)中，发酵培养基的组成为葡萄糖85g、酵母粉0.05g、硫胺素0.0013g、 柠檬二酸钠1.6g、 (NHt) 2S044.2g、 KH2P045.6g、 MgS04.7H20 4.6g、 MnS04 O.OODg、水1000ml，灭菌前pH值8.1;上述斜面培养基、种子培养基、摇瓶培 养基、发酵培养基的灭菌温度均为121'C，灭菌时间均为30分钟。本实施例产酸率9.5%，转化率58%。实施例3一种L-色氨酸的发酵生产工艺，包括下述步骤 (1)种子制备a、 首先将母种谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum〉接入装有斜面 培养基的斜面试管中，于3(TC培养55h，制得斜面试管菌种；b、 然后再将步骤a的斜面试管菌种接入种子培养基中进行斜面活化，于 30'C培养18h，制备成摇瓶种子，经镜检，挑选菌丝健壮、分枝多、染色深、无 空泡、无杂菌、效价高的种子备用；c、 将步骤b的摇瓶种子接入装有摇瓶培养基的摇瓶中，接种量为1.0% (体 积比)；于26。C，以300转/分的转速培养24h，成为一级种子， 一级种子菌丝健 壮、稠、无空泡、分支多；(2)发酵生产工艺将步骤(1) c的一级种子按体积比计，以1°/。的接种量接种于装有发酵培 养基的发酵罐中发酵，发酵前12h通气量要小，风量按l: 0.5-0.8 wm， 12h后 逐渐加大，最后风量达到l: 1.5 wm，发酵过程中，温度控制在26'C,罐压保 持在0.07Mpa，用浓氨水控制pH值在6.1，利用计量泵，双路不断进料， 一路 进糖、 一路进氮，发酵前12h，补糖的流量为1201/h， 12h以后变为1501/h,补 氨水量根据发酵液pH值进行调节，总体维持碳、氮平衡，经过45h后发酵培养 成熟。其中，步骤(1) a中斜面培养基的组成为葡萄糖15g、琼脂粉20g、酵 母粉0.08g、 KH2P042.6g、水1000ml，灭菌前pH值8.2;步骤(1) b中种子培 养基和步骤(1) c中摇瓶培养基的组成为葡萄糖15g、酵母粉0.08g、 KH2P04 5.6g、 MgS04'7H20 4.6g、 MnS04 0.0013g、水1000ml，灭菌前pH值8.0;步骤 (2)中，发酵培养基的组成为葡萄糖85g、酵母粉0.05g、硫胺素0.0013g、 柠檬二酸钠1.6g、 (NHt) 2S044.2g、 KH2P045.6g、 MgS04.7H20 4.6g、 MnS04 0.0013g、水1000ml，灭菌前？11值8.2;上述斜面培养基、种子培养基、摇瓶培 养基、发酵培养基的灭菌温度均为121'C，灭菌时间均为30分钟。 本实施例产酸率10%，转化率60%。
权利要求
1.一种L-色氨酸的发酵生产工艺，其特征在于包括下述步骤(1)种子制备a、首先将母种谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)接入装有斜面培养基的斜面试管中，于28～30℃培养55～72h，制得斜面试管菌种；b、然后再将步骤a的斜面试管菌种接入种子培养基中进行斜面活化，于28～30℃培养18～24h，制备成摇瓶种子；c、将步骤b的摇瓶种子接入装有摇瓶培养基的摇瓶中，于22～26℃，以250～300转/分的转速培养24～48h，成为一级种子；(2)发酵生产工艺将步骤(1)c的一级种子按体积比计，以0.1～1％的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中发酵，发酵前12h通气量要小，风量按1∶0.5～0.8vvm，12h后逐渐加大，最后风量达到1∶1.5vvm，发酵过程中，温度控制在22～26℃，罐压保持在0.05～0.07Mpa，pH值控制在6.0～6.1，通过不断加料，维持碳、氮平衡，经过45～60h后发酵培养成熟。
2. 如权利要求1所述的L-色氨酸的发酵生产工艺，其特征在于步骤(1) c 中，接种量按体积比计为0.5~1%。
3. 如权利要求l或2所述的L-色氨酸的发酵生产工艺，其特征在于步骤(l) a中斜面培养基的组成为葡萄糖15g、琼脂粉20g、酵母粉0.08g、 KH2P04 2.6g、水1000ml，灭菌前pH值8.0-8.2。
4. 如权利要求3所述的L-色氨酸的发酵生产工艺，其特征在于步骤(1) b 中种子培养基和步骤(1) c中摇瓶培养基的组成为葡萄糖15g、酵母粉 0.08g、 KH2P045.6g、 MgS04.7H20 4.6g、 MnS04 0.0013g、水1000ml，灭菌 前pH值8.0 8.2。
5. 如权利要求4所述的L-色氨酸的发酵生产工艺，其特征在于步骤(2)中 发酵培养基的组成为葡萄糖85g、酵母粉0.05g、硫胺素0.0013g、柠檬 二酸钠1.6g、 (NH4) 2S04 4.2g、 KH2P04 5.6g、 MgS04,7H20 4.6g、 MnS04 0.0013g、水1000ml，灭菌前pH值8.0 8.2。
6. 如权利要求5所述的L-色氨酸的发酵生产工艺，其特征在于步骤(2)中， 利用计量泵，双路进料， 一路进糖、 一路进氮，保持发酵罐里碳、氮平衡。
7. 如权利要求6所述的L-色氨酸的发酵生产工艺，其特征在于维持碳、氮平衡 的具体操作为发酵前12h,补糖的流量为120 l/h， 12h以后变为150 1/h，补氨水量根据发酵液pH值进行调节，总体维持碳、氮平衡。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域，具体公开了一种L-色氨酸的发酵生产工艺首先将母种谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)培养成斜面试管菌种，然后再将斜面试管菌种培养成摇瓶种子，再将摇瓶种子培养成为一级种子，最后将一级种子接种于装有发酵培养基的发酵罐中发酵。本发明发酵法生产工艺产酸率达10％，转化率达60％，且工艺简单、成本低、无危险因素、工艺流程合理、自动化程度高、产品质量好、经济效益高。
文档编号C12P13/00GK101565723SQ20091006501
公开日2009年10月28日 申请日期2009年5月25日 优先权日2009年5月25日
发明者孟军虎, 涛 武, 王进全 申请人:河南孟成生物药业股份有限公司