专利名称：可线性化穿梭载体BmBacmid的构建方法
技术领域：
本发明属于生物技术中利用基因工程方法载体构建的技术领域。
背景技术：
家蚕是一种重要的经济动物，具有易于饲养、成本低廉等特点。以家蚕作为宿主的杆状病毒表达系统表达外源蛋白的产量高、成本低且质量好，因此具有广阔的市场开发前景。并且，这种表达系统安全性好，外源基因表达水平高，并可进行翻译后加工，是一种比较理想的真核表达系统，因此该系统已得到非常广泛的应用。通过改造杆状病毒载体，该系统在重组病毒的构建效率、外源基因的表达水平和表达通量方面不断得到提升。其中，以核型多角体病毒BmNPV为载体的家蚕杆状病毒表达系统也先后发展出可线性化病毒载体、Bacmid穿梭载体，但这些载体均无法用于外源基因的高通量表达。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可线性化穿梭载体BmBacmid的构建方法，本发明所得的BmBacmid既可作为Bac-to-Bac系统的穿梭载体使用，也可作为一种线性化病毒载体使用，并可用于建立一套新型的BmNPV高通量载体表达系统。为了解决上述技术问题，本发明提供一种可线性化穿梭载体BmBacmid的构建方法，包括如下步骤1)、构建pBacAvrII2载体在pBacPAK8载体上引入限制性内切酶位点FseI和AvrII ；从而构建成含两个AvrII位点的转移载体PBacAvrII2 (即，PBacAvrII2载体)；2)、构建含细菌人工染色体BAC的pBACAvrII2载体设计一对两端含FseI位点的引物，从DHlOBac Bacmid上扩增细菌人工染色体BAC片段，插入到pBacAvrII2中；得到pBACAvrII2载体；3)、家蚕杆状病毒表达载体-----可线性化穿梭载体BmBacmid的构建以pBACAvrII2载体为模板，PCR扩增BAC的片段，BAC的片段含两个AvrII和FseI酶切位点、且片段两端为多角体基因侧翼序列，然后将PCR产物和线性化的BmBacPAK共转染家蚕细胞，在家蚕细胞内通过同源重组产生重组病毒，从而获得BmBacmid载体，所述BmBacmid载体为可线性化穿梭载体BmBacmid。作为本发明的可线性化穿梭载体BmBacmid的构建方法的改进步骤1)为PBacAvrII2载体是在pBacPAK8载体的基础上进行改造，成功引入两个AvrII位点；依次进行以下步骤①、第一个AvrII位点的引入，构建pBacAvrlll载体对转移载体pBacPAKSDNA多角体基因启动子3'端侧翼的orfl6^基因进行定点突变，将TTTAGG突变为CCTAGG，为AvrII位点，从而在SnaBI和SwaI之间，即在orf 16 基因的3'端引入第一个AvrII酶切位点；
②、第二个AvrII位点的引入，构建pBacAvrII2载体在pBacAvrlll载体DNA上的EcoRV和BamHI位点之间引入一段DNA序列；序列包含FseI和AvrII两个酶切位点，从而构建成含两个AvrII位点的转移载体pBacAvrII2。作为本发明的可线性化穿梭载体BmBacmid的构建方法的进一步改进步骤3)为依次进行以下步骤①、扩增pBACAvrII2载体中BAC片段为了使BAC片段能与线性化BmBacPAK同源重组，故从pBACAvrII2上扩增两端含多角体基因侧翼序列的BAC片段；以pBACAVrII2为模板，用KOD-FX DNA聚合酶PCR扩增合成BAC片段；②、线性化BmBacPAK制备家蚕杆状病毒BmBacPAK先经蛋白酶K消化后通过苯酚氯仿抽提获得病毒DNA，所述病毒BmBacPAK DNA含有三个Bsu36I酶切位点，故通过Bsu36I酶切进行线性化，得到Bsu36I 线性化的 BmBacPAK DNA ；③、BmBacmid 的构建将上述步骤①中PCR产物与上述步骤②所得的Bsu36I线性化的BmBacPAK DNA按照2 1的分子数之比共转染家蚕BmN细胞，待细胞完全病变后收集培养上清分离病毒，并提取病毒基因组DNA ；以病毒基因组DNA电转化ElectroMAX DHlOB感受态细胞，涂含Kan、IPTG和X_gal的LB平板培养Mh，挑取状态良好的蓝斑接种LB液体培养基，振荡培养48小时后提取Bacmid DNA ；将提取的Bacmid DNA转染家蚕细胞，产生细胞病变的即为可线性化穿梭载体BmBacmid0综上所述，本发明首先提供了 pBaCAVrII2转移载体(即，pBaCAVrII2载体)的构建方法首先在pBacPAK8多克隆位点上游EcoRV和BamHI位点之间引入限制性内切酶位点FseI和AvrII (第一个)；第二步对多角体基因启动子3‘端侧翼的orf 16 基因进行定点突变，即在其基因的3'端引入另外一个AvrII位点(第二个)，从而构建成含两个AvrII位点的转移载体pBacAvrII2。本发明还提供了 pBACAVrII2的构建方法首先，设计引物(含FseI位点)利用PCR从商品化的DHlOBac Bacmid上扩增细菌人工染色体BAC片段，插入到pBacAvrII2中，从而构建含细菌人工染色体的转移载体pBACAvrII2。本发明还构建了一种新型家蚕杆状病毒穿梭载体BmBacmid 首先以pBACAvrII2为模板，PCR扩增合成两端为多角体基因侧翼序列，中间为BAC的片段(含两个AvrII和FseI酶切位点)，然后将此PCR产物和线性化的BmBacPAK DNA共转染家蚕细胞BmN，在家蚕细胞内通过同源重组产生重组病毒，从而获得BmBacmid载体。本发明所构建的BmBacmid载体既能线性化后同源重组构建重组病毒表达蛋白，又可作为穿梭载体构建重组病毒表达蛋白。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图1是重组质粒pBacAvrlll的鉴定5
左图M. 1 kb DNA Ladder ；1. AvrII酶切重组质粒pBacAvrlll ；右图为测序结果。图2是重组质粒pBaCAvrII2的鉴定图；左图M.Low DNA Ladder ；1. BamHI和AvrII双酶切重组质粒pBacAvrII2 ；2. EcoRV酶切重组质粒pBaCAvrII2 ；3. AvrII酶切重组质粒pBacAvrII2 ；右图为测序结果图。图3是PCR扩增结果图。图 4 是 BmBacPAK 的图谱。图5是BmBacPAK的线性化图。图6是PCR和酶切鉴定图，左图PBacPAK8-AcGFP；右图pFastBac HTB-AcGFP。图7是共转染后家蚕细胞的荧光情况图；A.透射光下线性化BmBacmid和PBacPAK8_AcGFP共转染的家蚕细胞；B. B.荧光显微镜下线性化BmBacmid和pBacPAK8_AcGFP共转染的家蚕细胞。图8是BmBacmid-AcGFP转染家蚕细胞后的荧光情况图；A.透射光下转染BmBacmid-AcGFP的家蚕细胞；B.荧光显微镜下转染BmBacmid-AcGFP的家蚕细胞。
具体实施例方式实施例1、pBacAvrII2载体的构建PBacAvrII2载体是在pBacPAK8载体的基础上进行改造，成功引入两个AvrII位点。分两步进行如下(1)第一个AvrII位点的引入，构建pBacAvrlll载体对载体pBacPAK8DNA多角体基因启动子3'端侧翼的orf 16 基因进行定点突变，将TTTAGG突变为CCTAGG——即AvrII位点，从而在SnaBI和SwaI之间，即在orfl6^基因的3'端引入第一个AvrII酶切位点。设计引物如下Pl 5 ‘ -CGGTACGTATTTTAATAATTCATTAAATTTATAATCCCTAGG-3 ‘(下划线部分为AvrII位点)P2 5' -GAGGATTTAATATTTAAATTCAG-3‘；以pBacPAK8 DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为
权利要求
1.可线性化穿梭载体BmBacmid的构建方法，其特征是包括如下步骤1)、构建pBacAvrII2载体在pBacPAK8载体上引入限制性内切酶位点FseI和AvrII； 从而构建成含两个AvrII位点的转移载体pBacAvrII2 ；2)、构建含细菌人工染色体BAC的pBACAvrII2载体设计一对两端含FseI位点的引物，从DHlOBac Bacmid上扩增细菌人工染色体BAC片段，插入到pBacAvrII2中；得到pBACAvrII2载体；3)、家蚕杆状病毒表达载体——可线性化穿梭载体BmBacmid的构建以pBACAVrII2载体为模板，PCR扩增BAC的片段，所述BAC的片段含两个AvrII和 FseI酶切位点、且片段两端为多角体基因侧翼序列，然后将PCR产物和线性化的BmBacPAK 共转染家蚕细胞，在家蚕细胞内通过同源重组产生重组病毒，从而获得BmBacmid载体，所述BmBacmid载体为可线性化穿梭载体BmBacmid。
2.根据权利要求1所述的可线性化穿梭载体BmBacmid的构建方法，其特征是所述步骤1)为PBacAvrII2载体是在pBacPAK8载体的基础上进行改造，成功引入两个AvrII位点；依次进行以下步骤①、第一个AvrII位点的引入，构建pBacAvrlll载体对转移载体PBacPAKSDNA多角体基因启动子3'端侧翼的orf 16 基因进行定点突变， 将TTTAGG突变为CCTAGG，为AvrII位点，从而在SnaBI和SwaI之间，即在orf 16 基因的 3'端引入第一个AvrII酶切位点；②、第二个AvrII位点的引入，构建pBacAvrII2载体在pBacAvrlll载体DNA上的EcoRV和BamHI位点之间引入一段DNA序列；所述序列包含FseI和AvrII两个酶切位点，从而构建成含两个AvrII位点的转移载体pBacAvrII2。
3.根据权利要求2所述的可线性化穿梭载体BmBacmid的构建方法，其特征是所述步骤幻为依次进行以下步骤①、扩增pBACAvrII2载体中BAC片段为了使BAC片段能与线性化BmBacPAK同源重组，故从pBACAVrII2上扩增两端含多角体基因侧翼序列的BAC片段；以pBACAVrII2为模板，用KOD-FX DNA聚合酶PCR扩增合成 BAC片段；②、线性化BmBacPAK制备家蚕杆状病毒BmBacPAK先经蛋白酶K消化后通过苯酚氯仿抽提获得病毒DNA，所述病毒BmBacPAK DNA含有三个Bsu36I酶切位点，故通过Bsu36I酶切进行线性化，得到Bsu36I 线性化的BmBacPAK DNA ；③、BmBacmid的构建将上述步骤①中PCR产物与上述步骤②所得的Bsu36I线性化的BmBacPAK DNA按照 2 1的分子数之比共转染家蚕BmN细胞，待细胞完全病变后收集培养上清分离病毒，并提取病毒基因组DNA ；以病毒基因组DNA电转化ElectroMAX DHlOB感受态细胞，涂含Kan、IPTG和X_gal 的LB平板培养Mh，挑取状态良好的蓝斑接种LB液体培养基，振荡培养48小时后提取 Bacmid DNA ；将提取的Bacmid DNA转染家蚕细胞，产生细胞病变的即为可线性化穿梭载体BmBacmid0
全文摘要
本发明公开了一种可线性化穿梭载体BmBacmid的构建方法，包括如下步骤1)构建含两个AvrII位点的pBacAvrII2载体；2)构建含细菌人工染色体BAC的pBACAvrII2载体设计一对两端含FseI位点的引物，从DH10Bac Bacmid上扩增细菌人工染色体BAC片段，插入到pBacAvrII2中；得到pBACAvrII2载体；3)可线性化穿梭载体BmBacmid的构建以pBACAvrII2载体为模板，PCR扩增BAC的片段，然后将PCR产物和线性化的BmBacPAK共转染家蚕细胞，在家蚕细胞内通过同源重组产生重组病毒，从而获得可线性化穿梭载体BmBacmid。
文档编号C12N7/01GK102559760SQ201210037290
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月17日 优先权日2012年2月17日
发明者吕正兵, 张耀洲, 陈倩, 陈健, 陈琴 申请人:浙江理工大学