用于同源重组的线性sumo载体的构建方法
【专利摘要】本发明公开了用于同源重组的线性SUMO载体的构建方法，包括如下步骤：(1)合成DNA片段，其中含有限制性内切酶识别位点和SUMO标签的核苷酸序列；(2)设计带有限制性内切酶识别位点的引物，扩增DNA片段，双酶切，回收；(3)PCR方法扩增pET表达载体,双酶切，回收；(4)产物连接，得到载体前体；用限制性内切酶SfoI或MscI消化载体前体，得到用于同源重组的线性SUMO载体。本发明可以以商品化pET表达载体为基础，基础载体选择面广，方便灵活，重复性强，获得的用于同源重组的线性SUMO载体使用方便，方法方便快捷，不会发生载体自连现象，是表达SUMO融合蛋白的有力工具。
【专利说明】用于同源重组的线性SUMO载体的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程【技术领域】，特别是涉及一种用于同源重组的线性SUM0载体 的构建方法。
【背景技术】
[0002] 基因重组技术是现代基因工程研究的一项基本技术，这种操作可把特定的基因整 合到载体上，并使之在受体细胞中增值表达。分离纯化供体生物遗传物质，用PCR扩增方法 在两端加上特定限制酶识别位点，酶切处理后与适当载体连接，形成重组分子，然后转入受 体细胞中增值表达。
[0003] 为了方便表达产物纯化，一般在目的蛋白之前加上特定标签，但有些蛋白的活性 受标签影响较大，需要在纯化后将标签切除。SUM0蛋白酶以非常特异的方式切割重组蛋白 的SUM0标签，因此含SUM0标签的表达载体应用广泛。但目前的使用方法均为在目的蛋白 基因两端设计与载体相同的酶切位点，载体和目的基因分别双酶切后纯化回收，再将目的 序列和载体经T4DNA连接酶连接，转入宿主细胞。操作繁琐，成本较高。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种用于同源重组的SUM0载体的构 建方法。
[0005] 本发明的技术方案概述如下：
[0006] -种用于同源重组的线性SUM0载体的构建方法，包括如下步骤：
[0007] (1)合成SEQ ID NO. 1所示的第一合成片段，所述第一合成片段的第439-444的 6个核苷酸为限制性内切酶Sfol识别序列，第151-441的291个核苷酸为改进后的第一种 SUM0标签的核苷酸序列；
[0008] (2)设计带有限制性内切酶识别位点的引物，PCR方法扩增第一合成片段，使第一 合成片段两端带有限制性内切酶识别位点，双酶切，回收；
[0009] (3)设计带有与步骤⑵相同的限制性内切酶识别位点的引物，PCR方法扩增pET 表达载体，得到两端带有限制性内切酶识别位点的? promoter、T7 terminator外侧的线 性PCR产物，双酶切，回收；
[0010] (4)将步骤（2)和步骤（3)回收的产物连接，得到第一种载体前体；用限制性内切 酶Sfol消化第一种载体前体，得到用于同源重组的线性SUM0载体。
[0011] pET 表达载体优选：pET28a、pET28b 或 pET42a。
[0012] 另一种用于同源重组的线性SUMO载体的构建方法，包括如下步骤：
[0013] (1)合成SEQ ID N0. 2所示的第二合成片段，所述第二合成片段的第438-443的 6个核苷酸为限制性内切酶MscI识别序列，第151-440的290个核苷酸为改进后的第二种 SUM0标签的核苷酸序列；
[0014] (2)设计带有限制性内切酶识别位点的引物，PCR方法扩增第二合成片段，使第二 合成片段两端带有限制性内切酶识别位点，双酶切，回收；
[0015] (3)设计带有与步骤⑵相同的限制性内切酶识别位点的引物，PCR方法扩增pET 表达载体，得到两端带有限制性内切酶识别位点的? promoter、T7 terminator外侧的线 性PCR产物，双酶切，回收；
[0016] (4)将步骤（2)和步骤（3)回收的产物连接，得到第二种载体前体；用限制性内切 酶MscI消化第二种载体前体，得到用于同源重组的线性SUM0载体。
[0017] pET 表达载体优选：pET28a、pET28b 或 pET42a。
[0018] 本发明的优点：本发明可以以商品化pET系列表达载体为基础，基础载体选择面 广，方便灵活，重复性强，可按照实验室现有载体情况选择限制性内切酶Sfol或限制性内 切酶MscI进行酶切。以pET28a载体为例，该载体上没有限制性内切酶MscI识别序列，因 此不用进行突变，将合成片段与PET表达载体PCR扩增产物连接获得质粒，用限制性内切酶 MscI酶切质粒即可获得用于同源重组的线性SUM0载体。
[0019] 若所选载体中含有相应的限制性内切酶识别序列，首先将合成片段与pET表达载 体PCR扩增产物连接获得质粒，再进行点突变，将多余限制性内切酶识别序列去除之后，用 限制性内切酶Sfol或限制性内切酶MscI酶切质粒即可获得用于同源重组的线性SUM0载 体。
[0020] 以本发明的构建方法获得的用于同源重组的线性SUM0载体使用方便，和带有多 克隆位点的SUM0环状载体相比省去了现有双酶切载体和目的蛋白核酸序列，然后回收酶 切产物，再进行载体和目的片段的体外连接等步骤，本发明只需将载体及目的片段以线性 的形式转入载体进行同源重组连接，方法方便快捷，不会发生载体自连现象，是表达SUM0 融合蛋白的有力工具。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1为实施例2同源重组菌落PCR检测。其中，第1道为200bp ladder第2至8 道为菌落PCR结果。
[0022] 图2为实施例4同源重组菌落PCR检测。其中，第1道为200bp ladder第2至8 道为菌落PCR结果。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0024] 下述的实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获 得的技术方案，均落在本发明的保护范围。
[0025] 为方便起见选择带有适合于后期目的蛋白表达标记基因的载体，载体中如果带有 T7promoter、T7 terminator基因则在其两端设计引物，PCR产物为除去T7 promoter、T7 terminator之外的全部序列，并在引物5'端设计限制性内切酶识别位点，如Hind III内切 酶识别位点AAGCTT和EcoRI内切酶识别位点GAATTC，PCR后回收纯化线性载体前体。
[0026] 下面各实施例中的合成片段和引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成。
[0027] 实施例1
[0028] -种用于同源重组的线性SUM0载体的构建方法，包括如下步骤：
[0029] (1)合成SEQ ID NO. 1所述的第一合成片段；第一合成片段的第439-444的6个 核苷酸为限制性内切酶Sfol识别序列，第151-441的291个核苷酸为改进后的第一种SUM0 标签的核苷酸序列；
[0030] (2)设计第一人工合成序列引物，第二上游引物为： CCAAGCTTCGATCCCGCGAAATT(SEQ ID N0. 5 所示）带有 Hind III 内切酶识别位点 AAGCTT，第 二下游引物为：
[0031] CGGAATTCCAAAAAACCCCTCAAGA(SEQ ID N0. 6 所示）带有 EcoRI 内切酶识别位点 GAATTC，用Phiision?超保真PCR Master Mix扩增目的片段。反应体系如下：
[0032] 第…人丨：介成)V段（SEQ丨DN0.丨）丨OOpg/μΙ ΙμΙ ΙΟμΜ第：丨游引物 ΙμΙ !?)μΜ第：下游引物 ΙμΙ 2x Phusion Master Mix 25μΙ 水 22μ1 总体枳 50μ1 反应程印：98 Γ 30s 981： 10s 70r 15s 72 Γ 30s 30个循'环 72'.C 5min
[0033] 用上海生工SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒，回收PCR产物。
[0034] (3)选择商品化载体pET28a，设计引物，第一上游引物为：
[0035] CCAAGCTTCGATCCTCTACGCC(SEQ ID N0. 3 所示），带有 Hind III 内切酶识别位点 AAGCTT ;第一下游引物：CGGAATTCCTGAAAGGAGGAACTAT(SEQ ID N0. 4 所示）。带有 EcoRI 内 切酶识别位点GAATTC，用Phusion?超保真PCR Master Mix扩增目的片段，Phusion?超保 真 PCR Master Mix 购自 NEW ENGLAND BioLabs，反应体系如下：
[0036] pET28a lOOpg/μΙ ΙμΙ 10μΜ第--上游引物 ΙμΙ 10μΜ第--下游引物 1神 2x Phusion Master Mix 25μΙ 水 22μ1 总体枳 50μ1 反应程序：98 °C 30s 98 °C 10s 65 °C 15s
[0037] 72 ? 3min 30个循环 1TC 5mm
[0038] 用上海生工SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒，回收PCR产物（两端带有限制性 内切酶识别位点的T7 promoter、T7 terminator外侧的线性PCR产物）。
[0039] (4)用限制性内切酶Hind III和EcoR I分别对步骤（2)、（3)的PCR产物进行酶 切，反应体系如下：
[0040] NEBuffcr(10x) 5μΙ HindM(10U4il) Ιμ? EcoR I (lOU/μ!) ΙμΙ 步骤（2)产物（步骤（3)产物） 10μΙ 水 33μΙ 总体积 50μ1
[0041] 反应条件为37°C 3小时。用上海生工SanPr印柱式PCR产物纯化试剂盒，回收酶 切产物。
[0042] (5)用T4 DNA连接酶将酶切产物连接，T4 DNA连接酶购自NEW ENGLAND BioLabs， 反应体系如下：
[0043] 10x T4 DNA ligase Buffer 2μ1 瞻切后的步 (2)产物 5μ1 _切后的步_ (3)产物 2μ1 Τ4 DNA ligase ΙμΙ 水 10μ! 总体积 20μΙ
[0044] 反应条件为16°C 16小时，得到连接产物（第一种载体前体）。
[0045] (6)将连接产物转化大肠杆菌DH5a菌株感受态细胞，先在液体LB培养基中 37°C，300rpm培养1小时后，在50ng/ml kan抗性LB固体平板培养基上进行筛选，获得阳性 转化子。并将阳性转化子接种于含有50ng/ml kan的液体LB培养基中，在37°C摇床中振荡 培养过夜。利用生工生物工程（上海）有限公司所生产的"SanPrep柱式质粒DNA小量抽 提试剂盒"按照其操作说明提取质粒DNA。
[0046] (7)序列中除了第一种SUM0标签核苷酸序列末端的限制性内切酶Sfol识别序 列外，还有4个限制性内切酶Sfol识别序列GGCGCC，依次设计引物将这4个GGCGCC改为 GGAGCC，用高保真DNA聚合酶扩增，回收扩增产物，平末端连接。引物序列如下：
[0047] 第三上游引物：TCCCAATACGCAAACCGCC(SEQ ID N0. 7)
[0048] 第三下游引物：GCCAGGGTGGTTTTTCTTTTC(SEQ ID Ν0· 8)
[0049] PCR反应体系及程序参照步骤（3)(用第三上、下游引物替换第一上、下游引物）， 纯化回收PCR产物，用T4 PNK酶进行磷酸化修饰，T4 PNK购自NEW ENGLAND BioLabs，再 用T4 DNA连接酶连接，连接反应参照步骤（5)，将连接产物转化大肠杆菌DH5a菌株感受 态细胞，先在液体LB培养基中37°C，300rpm培养1小时后，在50ng/ml kan抗性LB固体平 板培养基上进行筛选，获得阳性转化子。并将阳性转化子接种于含有50ng/ml kan的液体 LB培养基中，在37°C摇床中振荡培养过夜。利用生工生物工程（上海）有限公司所生产的 "SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒"按照其操作说明提取质粒DNA。
[0050] T4 PNK磷酸化修饰反应条件如下：
[0051] T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer 10x 5μ1 PCR 产物 10μ1 ΑΤΡΙΟηιΜ 5μ! T4 Polynucleotide Kinase Ιμ? 水 29μ1 总体积 50μ1
[0052] 反应条件为37°C，30min，产物可直接用于连接。
[0053] (8)继续修改内切酶Sfol识别序列GGCGCC，引物如下：
[0054] 第四上游引物：TCCATCTCCTTGCATGCACCA(SEQ ID N0. 9)
[0055] 第四下游引物：GCCCAACAGTCCCCCGG(SEQ ID Ν0· 10)
[0056] 第五上游引物：TCCTATATCGCCGACATCACCG(SEQ ID Ν0· 11)
[0057] 第五下游引物：GCCAGCAACCGCACCTGTG(SEQ ID NO. 12)
[0058] 第六上游引物：TCCACAGGTGCGGTTGCTG(SEQ ID NO. 13)
[0059] 第六下游引物：GCCGGTGATGCCGGCC(SEQ ID NO. 14)
[0060] 用上述引物依次替换步骤（7)中的引物，其它同步骤（7)。
[0061] (9)经过步骤（7)和步骤⑶的突变过程，只剩下第一种SUM0标签核苷酸序列末 端的限制性内切酶Sfol识别序列GGCGCC，用Sfol酶切质粒DNA即得到第一种用于同源重 组的线性SUM0载体。
[0062] Sfol反Μ体系如卜： NEBuiTer(lOx) 5μΙ Slol I μ丨 步骤（8)产物 10μΙ 水 3φ1 总钵积 50μ1
[0063] 反应条件为37°C 3小时。用上海生工SanPr印柱式PCR产物纯化试剂盒，回收酶 切产物即得到第一种用于同源重组的线性SUM0载体。
[0064] pET表达载体选用pET28b时，设计相应的引物，采作本实施例的方法，可以制备得 到相应的用于同源重组的线性SUM0载体。
[0065] pET表达载体选用pET42a时，设计相应的引物，采作本实施例的方法，可以制备得 到相应的用于同源重组的线性SUMO载体。
[0066] 实施例2
[0067] 以绿色荧光蛋白GFP为例，以同源重组的方式构建SUM0-GFP融合蛋白。
[0068] (1)设计引物扩增GFP基因，并在两端带有线性SUM0载体的同源区域，第七上游引 物为：AGATTGGTGGCATGGTGAGCAAG(SEQ ID N0. 15 所示），第七下游引物为：AGATCCGGCTGCTA TTACTTGTACAGCT(SEQ ID N0. 16 所示）
[0069] PCR反应体系如下：
[0070]
【权利要求】
1. 一种用于同源重组的线性SUMO载体的构建方法，其特征是包括如下步骤： (1) 合成SEQ ID NO. 1所示的第一合成片段，所述第一合成片段的第439-444的6个 核苷酸为限制性内切酶Sfol识别序列，第151-441的291个核苷酸为改进后的第一种SUMO 标签的核苷酸序列； (2) 设计带有限制性内切酶识别位点的引物，PCR方法扩增第一合成片段，使第一合成 片段两端带有限制性内切酶识别位点，双酶切，回收； (3) 设计带有与步骤（2)相同的限制性内切酶识别位点的引物，PCR方法扩增pET表 达载体，得到两端带有限制性内切酶识别位点的? promoter、T7 terminator外侧的线性 PCR产物，双酶切，回收； (4) 将步骤（2)和步骤（3)回收的产物连接，得到第一种载体前体；用限制性内切酶 Sfol消化第一种载体前体，得到用于同源重组的线性SUMO载体。
2. 根据权利要求1所述的一种用于同源重组的线性SUMO载体的构建方法，其特征是所 述 pET 表达载体为 pET28a、pET28b 或 pET42a。
3. -种用于同源重组的线性SUMO载体的构建方法，其特征是包括如下步骤： (1) 合成SEQ ID NO. 2所示的第二合成片段，所述第二合成片段的第438-443的6个 核苷酸为限制性内切酶MscI识别序列，第151-440的290个核苷酸为改进后的第二种SUMO 标签的核苷酸序列； (2) 设计带有限制性内切酶识别位点的引物，PCR方法扩增第二合成片段，使第二合成 片段两端带有限制性内切酶识别位点，双酶切，回收； (3) 设计带有与步骤（2)相同的限制性内切酶识别位点的引物，PCR方法扩增pET表 达载体，得到两端带有限制性内切酶识别位点的? promoter、T7 terminator外侧的线性 PCR产物，双酶切，回收； (4) 将步骤（2)和步骤（3)回收的产物连接，得到第二种载体前体；用限制性内切酶 MscI消化第二种载体前体，得到用于同源重组的线性SUMO载体。
4. 根据权利要求3所述的一种用于同源重组的线性SUMO载体的构建方法，其特征是所 述 pET 表达载体为 pET28a、pET28b 或 pET42a。
【文档编号】C12N15/66GK104140976SQ201410389646
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年8月8日 优先权日:2014年8月8日
【发明者】田方, 张涛, 徐彬 申请人:天津謙泰生物技术有限公司