基于mRNA响应的循环水养殖系统变速流控制方法及系统的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于mRNA响应的循环水养殖系统变速流控制方法及系统，实现协同调控循环水养殖系统的生物滤器与微生物响应。通过获取功能微生物氨氧化菌AOB(Ammonia?Oxidizing?Bacteria)的mRNA实时表达量，在AOB的mRNA响应高表达时间段，提高系统流速，在响应低表达时间段，降低系统流速。本发明从工厂化养殖水处理工艺与微生物响应协同调控的角度出发，解决了现有养殖水处理生物滤器处理效率低、运行能耗偏大等问题。
【专利说明】基于mRNA响应的循环水养殖系统变速流控制方法及系统
【技术领域】
[0001] 本发明涉及水产养殖水处理技术，尤其涉及一种工厂化循环水养殖系统生物滤器 高效精准节能的变速流控制方法。
【背景技术】
[0002] 工厂化循环水养殖系统因具有资源节约、环境友好的特点，已成为世界范围内大 力推崇发展的水产养殖模式。在超高密度集约化养殖条件下，其系统的核心处理技术为生 物过滤，方式主要为通过配置生物滤器，利用定向富集在滤料表面的微生物完成水体主要 污染物总氨氮TAN(Total Ammonia Nitrogen)与亚硝酸盐（NOf-N)的去除。其过程主要 通过功能微生物群的硝化作用，将总氮氮TAN等通过氨氧化细菌AOB (Ammonia Oxidizing Bacteria)具有的氨单加氧酶催化氧化为羟胺，再由羟胺氧化为中间产物亚硝酸盐，最后由 亚硝酸盐氧化菌NOB (Nitrite Oxidizing Bacteria)将亚硝酸氧化成对养殖对象相对无害 的硝酸盐（NCV-N)，全反应限速步奏为式①，相关化学简式如下：
[0003] NH3+02+2H+ - ΝΗ20Η+Η20 ①
[0004] ΝΗ20Η+Η20 - Ν02>5Γ ②
[0005] N(T+C02+0· 502 - Ν(Γ ③
[0006] 在实际生产实践中，系统养殖规模（饵料投喂量）与生物滤器的有效容积均已固 定，其生物滤器总处理性能主要与流速有关。为维持高密度养殖负荷下较适宜的水质条 件，系统运行过程需要较高的流速，通常循环水养殖系统的水力停留时间HRT (Hydrau 1 ic Retention Time)为0· 5_lh，即生物滤器日均循环24-48次。
[0007] 然而上述生物滤器恒速运行方法仍然面临如下弊端：在稳定运行的循环水养殖系 统内，生物滤器内污染物总氨氮TAN主要源于养殖对象排氨，而相关的排氨速率则主要与 饲料量及投喂节律有关，系统水质日变化呈现相对"峰-谷"浓度，因此维持系统较高恒速 流动，虽可确保水质稳定，但在污染物浓度峰值时间段内，生物滤器基质来源因流速恒定受 限，在谷值时间段，则因低基质浓度使其处于低效运行，故生物滤器单次循环处理效率偏 低。为达到总污染物处理量，系统需维持较高流速，从而造成整体能耗偏高。
[0008] 由于循环水养殖系统水体始终处于内部循环，故其某时间节点的污染物浓度值为 养殖对象排氨、生物滤器处理后的最终结果，若以此为依据实现变速流控制，其信息来源滞 后，仅从表观层面被动改变系统流速，无法有效提高系统生物滤器单次处理效能，其需依靠 牺牲系统水质实现节能。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种基于mRNA响应的循环水养殖系 统变速流控制方法及系统，从而实现循环水养殖系统运行节能降耗。
[0010] 本发明通过检测单投喂周期内循环水养殖系统生物滤器内滤料表面功能微生物 Α0Β编码氨单加氧酶的amoA基因的mRNA响应表达量，在其高表达时间段提高系统流速，以 供应更多基质用于其mRNA转录，在低表达时间段，降低流速实现节能。由于amoA基因的 mRNA编码产物为氨单加氧酶（功能蛋白质），其作用为硝化过程催化总氨氮氧化为羟胺的 限速步奏关键酶，且蛋白质的半衰期长于mRNA半衰期，故通过提升mRNA高表达段的流速， 可促使功能微生物A0B实现氨单加氧酶的有效积累，从而可为降低流速时间段生物滤器仍 具有较高处理性能奠定物质基础。本发明依据上述原理，进行生物滤器精准调控与变速流 运行，通过提升其单次处理效能，实现循环水养殖系统总流量削减与节能。
[0011] 一种基于mRNA响应的循环水养殖系统变速流控制方法，协同调控循环水养殖系 统的生物滤器与微生物响应，获取功能微生物Α0Β的mRNA实时表达量，在Α0Β的mRNA响应 高表达时间段，提高系统流速,在响应低表达时间段，降低系统流速。
[0012] 其实施的基本流程为：
[0013] 1)、对投喂周期内的系统水质进行监测；
[0014] 2)、对投喂周期内生物滤器的滤料表面功能微生物Α0Β的mRNA响应表达水平进行 监测；
[0015] 3)、分析得到投喂周期内功能微生物Α0Β的mRNA高表达与低表达时间段；
[0016] 4)、综合水质数据，对功能微生物Α0Β的mRNA高表达峰值前后lh时间段提高系统 流速10-30%，对mRNA低表达时间段降低流速20-50%。
[0017] 所述的循环水养殖系统，主要采用固液分离-生物净化两级处理手段去除系统污 染物，且运行稳定。
[0018] 所述的循环水养殖系统，其单投喂周期内饵料投加量A(kg)与生物滤器有效容积 B(m3)间的比值，A/B彡6.67。
[0019] 所述的Α0Β的mRNA响应高表达与低表达判断依据，高表达值C与低表达值D间的 比值C/D彡5,或具有统计学差异（P〈0. 1)，所述的表达值单位为碱基拷贝数/yg RNA。
[0020] 所述的系统内水体总氨氮TAN(Total Ammonia Nitrogen)浓度彡3. Omg/L时，无 论生物滤器功能微生物Α0Β的mRNA响应表达情况，系统运行均不减速。
[0021] 一种采用所述方法的循环水养殖系统，采用变速流控制的装置。
[0022] 本发明的有益效果是，通过改变传统循环水养殖系统生物滤器的恒定流速策略， 基于单喂食周期内功能微生物Α0Β的mRNA表达响应水平为参考，以分别提升mRNA高表达 段流速及降低mRNA低表达段流速为控制措施，实现生物滤器单次循环处理效率提升。本发 明克服了传统循环水养殖系统运行过程生物滤器运行策略粗放、整体能耗偏高等弊端，具 有节能增效、可实现工程化运用等诸多优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1是基于mRNA响应的循环水养殖系统变速流控制方法实施流程图。
【具体实施方式】
[0024] 如附图1所示，本发明可以通过以下技术方案来实现的：
[0025] 1、本发明的实施对象为循环水养殖系统，其主要为系统污染物去除依靠固液分 离-生物净化两级处理手段，且运行稳定。系统内养殖生物量波动小，投喂周期与节律固 定。
[0026] 2、循环水系统单投喂周期水质状况监测，方法为至投喂时间点伊始，每间隔lh测 定水质中TAN含量，取样点一般建议需至少包括3处（养殖池2处、生物滤器1处），测定持 续时间24h，测定方法可采用萘氏试剂法等国标标准方法，要求测定精度为0. lmg/L。
[0027] 3、生物滤器内功能微生物Α0Β的mRNA响应表达监测，其实施方法为：
[0028] 一、样品前处理
[0029] (1)至投喂时间点伊始，每间隔lh取生物滤器内环装滤料3个或微珠滤料30ml， 并立即加入商用RNA保护液5ml。（2)将样品放直在磁力振汤器上震汤lOmin后，在尚心机 上高速离心5min后（运行条件4°C，12000转），弃去上清液后，将生物膜泥样重悬浮至2ml 商用RNA保护液，并存储在-80°C待用。
[0030] 二、样品RNA提取与反转录cDNA
[0031] (1)采用商用RNA试剂盒进行样品RNA提取，流程依照试剂盒说明书操作。（2)将 提取的总RNA采用商用试剂盒反转录为cDNA，反应条件为42°C，lh ;70°C，15min ;8°C，+ ->。
[0032] 三、功能微生物氨氧化细菌AOB的mRNA的绝对定量（Rt-qPCR)
[0033] (1)以功能微生物氨氧化细菌Α0Β的氨单加氧酶编码段amoA基因为目标区，选 用引物为 amoA-lF/amoA-2R(GGGGITTCTACTGGTGGT/CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC)进行扩增， PCR 反应条件为：（i)95°C，5min ;(ii)95°C，20s ;(iii)55°C，30s ;(iv)72°C，30s ;(v)重 复（ii)?（iv)步奏40个循环；(vi)72°C，7min ; (vii)8°C，+ 00 . (2)标准曲线制备方法 为；（i)在10μ1 DNA溶液中加入ΙΟΟμΙ感受态细胞中，冰上放置30min。然后42°C加热 45s后，再在冰中放置lmin ; (ii)加入890 μ 1 S0C培养基，37°C振荡培养60min ; (iii)取 100 μ 1细菌培养液均匀涂布在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基平板上，37°C倒置过夜培 养；（iv)挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。（v)采用商用质粒提 取试剂盒提取克隆质粒，并用微量紫外外分光光度计测定质粒浓度，以梯度稀释的克隆质 粒制备标注曲线。（3)以标准曲线计算各样品氨氧化功能菌Α0Β的mRNA绝对丰度，单位为 (碱基拷贝数/ μ g RNA)。
[0034] 4、单喂食周期内样品功能菌Α0Β的mRNA表达程度鉴定
[0035] (1)将各时间节点监测的功能菌Α0Β的mRNA绝对表达量以时间序列绘制曲线图， 寻找曲线上的"高表达值"与"低表达值"。（2)将高表达值C(碱基拷贝数/μ g RNA)与低表 达值D (碱基拷贝数/ μ g RNA)间的比值进行计算，若C/D彡5，或具有统计学差异（P〈0. 1)， 则认为该时间点即为高表达值与低表达值。连续2个以上高表达值或低表达值即可认为是 高表达时间段或低表达时间段。
[0036] 5、基于mRNA响应的生物滤器流速调节
[0037] (1)综合水质数据，对功能微生物Α0Β的mRNA高表达峰值前后lh时间段提高系统 流速约10-30%，对mRNA低表达时间段降低流速约20-50%。⑵当系统内水体总氨氮TAN 浓度彡3. 0mg/L时，无论生物滤器功能微生物mRNA响应表达情况，系统运行均不减速。
[0038] 实施例
[0039] 依据本发明方法，对养殖对象为尼罗罗非鱼（Oreochromis Niloticus)的循环水 养殖系统进行了效果检验。其中恒速运行时间33天，变速运行时间36天，变速控制以某变 频器（VFD-015M)实现，效果如表1所示。
[0040] 表1实际循环水养殖系统变速流实施效果
[0041]
【权利要求】
1. 一种基于mRNA响应的循环水养殖系统变速流控制方法，其特征在于，协同调控循环 水养殖系统的生物滤器与微生物响应，获取功能微生物AOB的mRNA实时表达量，在AOB的 mRNA响应高表达时间段，提高系统流速，在响应低表达时间段，降低系统流速。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，实施的基本流程为： 1) 、对投喂周期内的系统水质进行监测； 2) 、对投喂周期内生物滤器内滤料表面功能微生物AOB的mRNA响应表达水平进行监 测； 3) 、分析得到投喂周期内功能微生物AOB的mRNA高表达与低表达时间段； 4) 、综合水质数据，对功能微生物AOB的mRNA高表达峰值前后lh时间段提高系统流速 10-30%，对mRNA低表达时间段降低流速20-50%。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的循环水养殖系统，主要采用固液分 离-生物净化两级处理手段去除系统污染物，且运行稳定。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的循环水养殖系统，其单投喂周期内 饵料投加量A (kg)与生物滤器有效容积B (m3)间的比值，A/B < 6.67。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的AOB的mRNA响应高表达与低表达 判断依据，高表达值C与低表达值D间的比值C/D > 5,或具有统计学差异（P〈 0.1)，所 述的表达值单位为碱基拷贝数/ μ g RNA。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的系统内水体总氨氮TAN(Total Ammonia Nitrogen)浓度彡3. Omg/L时，无论生物滤器功能微生物AOB的mRNA响应表达情 况，系统运行均不减速。
7. -种采用如权利要求1所述方法的循环水养殖系统，其特征在于，采用变速流控制 的装置。
【文档编号】C12Q1/68GK104145874SQ201410389617
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月8日 优先权日:2014年8月8日
【发明者】阮贇杰, 朱松明 申请人:浙江大学