一种最适pH在酸性范围的磷脂酶A2及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种最适pH在酸性范围的磷脂酶A2及其应用，属于酶工程领域。本发明是将来源于S.violaceoruber的磷脂酶A2序列进行优化，将优化后的序列片段克隆到表达载体pPIC9K得到重组载体，再将重组载体线性化后转化到毕赤酵母中进行表达。本发明得到的磷脂酶A2的最适pH降低到6.0，适于植物油的脱胶，可以应用在酶制剂生产、油脂脱胶以及面制品加工方面等方面。
【专利说明】一种最适pH在酸性范围的磷脂酶A2及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种最适pH在酸性范围的磷脂酶A2及其应用，属于酶工程领域。
【背景技术】
[0002] 磷脂酶A2 (PLA2 ;EC3. 1. 1. 4)能水解甘油磷脂第二位上的酯键生成游离脂肪酸和 溶血磷脂，并且在新陈代谢、宿主防御和信号传递方面发挥重要作用。在胰液和眼镜蛇的毒 液里首次发现了磷脂酶活性，随后，从不同种类的蛇、蜜蜂毒液和哺乳动物胰腺中提取出来 磷脂酶A2,在结构和机制等方面得到了广泛的研究。2002年，日本学者从土壤中分离到一 株细菌紫红色链霉菌StreptomycesviolaceoruberA-2688能够分泌磷脂酶A2。这是第一 次在原核生物中检测到磷脂酶A2活性。
[0003] 磷脂酶A2可用于植物油的脱胶工序。酶法脱胶是通过磷脂酶水解作用切掉非水 化磷脂的一个脂肪酸链生成溶血磷脂，而溶血磷脂具有很强的亲水性，可以通过水化作用 方便地去除，酶法脱胶适应性广，反应条件温和，可大大节约化学物质的消耗量，几乎不产 生废水，在环保、经济、质量等方面具有潜在的优势，利用酶法脱胶是油脂加工的发展趋势。
[0004] 脱胶是在酸性环境中，而来源于S.violaceoruber的磷脂酶A2的最适pH在碱性 范围7. 3?8.3,酶活是0. 5U/mL，该基因在变铅青链霉菌中得到表达，最适pH为8.0,酶活 为1. 04U/mL，在大肠杆菌中的表达产物在碱性环境中检测到活性，酶活是7. 45U/mL，将该 酶用于植物油脱胶时酶活力损失较大。来源于变铅青链霉菌的磷脂酶A2,最适pH为8. 0， 酶活是0. 2U/mL，在高于pH6. 3的条件下较稳定，低于该范围稳定性很低，不适于植物油脱 胶的应用。
[0005] 巴斯德毕赤酵母（Pichia.pastoris)是一种能高效表达外源蛋白的表达系 统，具有遗传稳定、表达水平高、蛋白可翻译后加工、产物可分泌、可高密度发酵等许多 优点，应用十分广泛，已有数百种外源蛋白在该系统中获得表达。用P.pastoris表达 S.violaceoruber来源的磷脂酶A2基因，使该酶的最适pH降低到6. 0,适于植物油的脱胶。
【发明内容】
[0006] 本发明提供一种最适pH在酸性范围的磷脂酶A2及其应用。
[0007] 本发明的第一个目的是提供一种磷脂酶A2的制备方法，是将编码氨基酸序列如 SEQIDNO. 1所示的序列的基因片段克隆到表达载体得到重组载体，再将重组载体后转化 到毕赤酵母菌中得到基因工程菌，诱导表达即得到磷脂酶A2。
[0008] 所述磷脂酶A2的最适pH在酸性范围。
[0009] 所述磷脂酶A2的的最适pH为6。
[0010] 编码所述磷脂酶A2的核苷酸序列如SEQIDN0. 2所示。
[0011] 所述表达载体是 pPIC9K、pPIC9、pPIC Za、pGAPZa、pPIC3. 5、pPIC3. 5K、pYAM75P6 中的任意一种。
[0012] 所述毕赤酵母菌可以是以下任意一种：GS115、KM71、SMD1168。
[0013] 所述表达载体，在本发明的一种实施方式中为pPIC9K。
[0014] 所述毕赤酵母菌，在本发明的一种实施方式中为P.pichiaGS115。
[0015] 本发明的第二个目的是提供一种根据上述方法得到的磷脂酶A2
[0016] 本发明的第三个目的是提供一种表达所述磷脂酶A2的基因工程菌。
[0017] 所述基因工程菌的构建方法，是将编码SEQIDNO. 1所示氨基酸序列的核苷酸片 段克隆到表达载体中构成重组载体，再将重组载体转化到宿主菌中，筛选阳性克隆，即得到 能表达所述磷脂酶A2的基因工程菌。
[0018] 所述核苷酸片段的基因序列如SEQIDN0. 2所示。
[0019] 所述基因工程菌的构建方法，具体为：（1)化学合成法合成SEQIDNO. 2所示的 基因片段；（2)使用引物80PLA2F(序列如SEQIDNO. 3所示）和81PLA2R(序列如SEQID NO. 4所示）扩增步骤1得到的片段，并连接到大肠杆菌克隆载体中得到重组质粒；（3)将重 组质粒和PPIC9K同时用EcoRI和NotI酶切连接得到重组载体pPIC9K-PLA2;(4)用Sal I将PPIC9K-PLA2线形化后电转入P.pichiaGS115,筛选阳性克隆。
[0020] 本发明的第四个目的是提供一种利用所述基因工程菌发酵生产所述磷脂酶A2的 方法，是将基因工程菌在BMGY培养基中，温度30°C、转速200rpm下培养至0D2?6，收集菌 体并重悬于BMMY培养基中，在温度28°C、转速200rpm下培养，添加甲醇诱导表达，发酵上清 即含有所述磷脂酶A2。
[0021] 所述方法中甲醇的添加方式为每24h添加1%的甲醇。
[0022] 所述1 %的甲醇，是指每100mL发酵液中添加lmL甲醇。
[0023] 本发明还提供一种所述磷脂酶A2用于植物油脱胶的方法，是取植物油50g，预热 至80°C，加入2. 5mol/L柠檬酸溶液0. 125mL，于该温度维持45min后将温度降为40°C，加入 5mol/LNa0H混合均匀使溶液pH为5. 0,加入4%pH5. 0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，253U 酶液，1. 0mmol/LCa2+，置于40°C震荡反应6h，即得到经磷脂酶A2脱胶的植物油。
[0024] 本发明提供的磷脂酶A2,相对于S.violaceoruber来源的磷脂酶A2,其最适pH从 8降低到6,适于植物油的脱胶。所得的酶的最适pH降低到6. 0,可能是由于表达产物发生 一定程度的糖基化修饰，糖基化修饰改变了整个蛋白的亲疏水性质，从而影响到活性中心 微观的电荷环境，进而改变最适pH。本发明的脂酶A2的最适温度为50°C，在低温条件下稳 定性较好，随温度的升高稳定性呈下降趋势，在PH6. 0时表现出最大活性和最为稳定，在最 适pH和温度条件下，酶活达到35U/mL。本发明的磷脂酶A2可以应用在酶制剂生产、油脂脱 胶以及面制品加工方面等方面。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1 :甲醇诱导毕赤酵母表达外源基因PLA2 ;A为菌体生长曲线（0D_)、B为胞外 蛋白浓度曲线、C为胞外上清磷脂酶活力曲线。
[0026] 图2:磷脂酶A2的氨基酸序列；下划线处为可能的糖基化位点。
[0027] 图3 :磷脂酶A2的酶学性质曲线；A:最适温度；B:温度稳定性；C:最适pH;D:pH 稳定性。
[0028]图 4:StreptomycesviolaceoruberA-2688 憐脂酶A2 结构（PDBID: 1IT4)，球形 所示氨基酸为N-糖基化位点，杆状所示氨基酸为活性中心位点。
【具体实施方式】
[0029] 实施例1
[0030]以NCBI数据库中S.violaceoruber的憐脂酶A2 序列（GenBankNO.AY359866. 1) 为基础，根据P.pastoris的密码子偏爱性对磷脂酶A2基因进行优化，优化序列的氨基酸序 列如SEQIDNO. 1所示，核苷酸序列如SEQIDN0. 2所示，由上海生工生物有限公司合成 SEQIDN0. 2所示序列的核苷酸片段。
[0031] 实施例2磷脂酶A2的毕赤酵母基因工程菌的构建
[0032] 根据磷脂酶A2的基因序列（SEQIDN0. 2所示），设计引物（如SEQIDN0. 3和 SEQIDNO. 4 所示）：
【权利要求】
1. 一种磷脂酶A2的制备方法，是将编码氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示序列的基因片 段克隆到表达载体得到重组载体，再将重组载体转化到毕赤酵母菌中得到的基因工程菌， 经诱导表达即得到磷脂酶A2 ;所述磷脂酶A2的最适pH在酸性范围。
2. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，编码所述磷脂酶A2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述表达载体是？？扣91(、？？扣9、？？扣2〇、 pGAPZa、pPIC3. 5、pPIC3. 5K、pYAM75P6 中的任意一种。
4. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述毕赤酵母菌是以下任意一种：GS115、 KM71、SMD1168。
5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述表达载体为pPIC9K。
6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述毕赤酵母菌为P.pichia GS115。
7. -种根据权利要求1所述方法得到的磷脂酶A2。
8. -种表达权利要求7所述磷脂酶A2的基因工程菌。
9. 根据权利要求8所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是将编码SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的基因片段克隆到表达载体中构成重组载体，再将重组载体转化到宿 主菌中，筛选阳性克隆，即得到能表达权利要求7所述磷脂酶A2的基因工程菌。
10. 权利要求7所述的磷脂酶A2在酶制剂生产、油脂脱胶以及面制品加工方面的应用。
【文档编号】C12N15/81GK104328095SQ201410504995
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年9月26日 优先权日:2014年9月26日
【发明者】喻晓蔚, 徐岩 申请人:江南大学