一种人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体片段的分离方法
【专利摘要】本发明公开了一种人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体片段的制备方法：将温敏载体NHS-PNIPAM固定化木瓜蛋白酶于pH7.0，0.05mol/LPBS缓冲液中，加入人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体，20～60℃水浴反应2～24h，反应液于40℃，10000r/min离心15min，沉淀为NHS-PNIPAM固定化木瓜蛋白酶，回收利用，滤液为含抗体Fab片段的水解液，采用蛋白L亲和层析对含抗体片段的水解液进行分离纯化，获得抗体Fab片段；本发明方法操作简便、纯化步骤少、所得抗体片段纯度高；本发明中制备的抗体Fab片段只需经过一步纯化就可达到96.0％以上的纯度。
【专利说明】一种人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体片段的分离方法 (一）
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种单克隆抗体片段的制备方法，特别涉及一种人绒毛膜促性腺激素 单克隆抗体片段的制备方法。 (二）
【背景技术】
[0002] 人绒毛膜促性腺激素 （human chorionic gonadotrophin, HCG)是人类受孕后分 泌的一种维持正常妊娠所需的糖蛋白激素，检测尿中的HCG即可证实妊娠。此外，研究发现 HCG的合成与分泌还与妇科疾病及恶性肿瘤等疾病相关，因此，HCG单克隆抗体不仅可用于 早期妊娠诊断，同时对妊娠相关疾病以及恶性肿瘤等疾病的诊断、鉴定具有一定的参考价 值。但是，完整的HCG单克隆抗体分子量大且结构复杂，在组织中穿透力差，且Fc片段的存 在在疾病治疗中易引起异种间免疫原性以及在早孕检测中易产生假阳性，从而使抗体在诊 断和治疗方面存在局限，而将HCG单克隆抗体片段化后产生的Fab或F (ab) ' 2片段与完整 的抗体相比具有：分子量小，穿透性强；与HCG结合的特异性增加；免疫原性降低等优点，从 而使抗HCG单克隆抗体的应用更安全、有效。因此，若能研制出纯度高、稳定性好的活性HCG 抗体片段并应用于妊娠及相关疾病诊断试剂的开发，必将带来可观的社会与经济效益。
[0003] 根据目前国内外文献及专利报道，酶解抗体是获得抗体片段的主要方法，常用的 酶有木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰酶等，其中以木瓜蛋白酶、胃蛋 白酶应用最为广泛，而游离酶水解抗体使酶无法重复利用，同时增加了消化液中抗体片段 的分离纯化难度，不利于高纯度抗体片段的获得，将酶固定化不仅增加了酶的稳定性，更降 低了后续抗体片段分离纯化的难度。但是，传统的固定化载体均进行异相催化，使酶在催化 过程中存在一定的空间位阻，导致酶的催化效率降低，而智能型高分子载体固定化酶可通 过控制反应条件实现均相催化与异相分离，提高了酶的催化效率及重复使用率。 (三）
【发明内容】
[0004] 本发明目的是提供一种人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体片段的制备方法，该方法 操作简便、纯化步骤少、所得的抗体片段纯度高。
[0005] 本发明采用的技术方案是：
[0006] 本发明提供一种人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体片段的分离方法，所述方法为： 将固定化木瓜蛋白酶溶于PH7. 0、0. 05mol/L PBS缓冲液中得固定化木瓜蛋白酶溶液，加入 人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体，20?40°C水浴反应2?IOh (优选于30°C反应3h)，反应 液离心（优选于40°C，10000r/min离心15min)，沉淀为固定化木瓜蛋白酶，回收利用；上清 液为含人绒毛膜促性腺激素抗体片段的水解液；采用蛋白L亲和层析对含人绒毛膜促性腺 激素抗体片段的水解液进行分离纯化，获得人绒毛膜促性腺激素抗体片段；所述固定化木 瓜蛋白酶加入量以抗体体积计为〇. 1?I. 〇mg/ml (优选0. 1?0. 3mg/ml)，所述固定化木瓜 蛋白酶载酶量为〇. 03?0. 3g/g载体；所述人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体利用蛋白A亲 和层析法从小鼠腹水中纯化获得；
[0007] 所述固定化木瓜蛋白酶是以NHS-PNIPAM为载体，以木瓜蛋白酶为底物，以pH 8. 5,0. lmol/L的硼酸缓冲液和N，N-二甲基甲酰胺为反应介质，在10?25°C水浴振荡2? l〇h，离心，取沉淀即为固定化木瓜蛋白酶；所述NHS-PNIPAM为N-羟基琥珀酰亚胺酯活化的 聚N-异丙基丙烯酰胺（平均分子量（M n)为2000,购自Sigma公司）；所述NHS-PNIPAM与 木瓜蛋白酶的质量比为1:0. 1?1。
[0008] 所述NHS-PNIPAM固定化的原理为：
[0009]
【权利要求】
1. 一种人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体片段的分离方法，其特征在于所述方法为：将 固定化木瓜蛋白酶溶于PH7. 0,0. 05mol/L PBS缓冲液中得固定化木瓜蛋白酶溶液，加入人 绒毛膜促性腺激素单克隆抗体，20?40°C水浴反应2?10h，反应液离心，沉淀为固定化木 瓜蛋白酶，回收利用；上清液为含人绒毛膜促性腺激素抗体片段的水解液；采用蛋白L亲和 层析对含人绒毛膜促性腺激素抗体片段的水解液进行分离纯化，获得人绒毛膜促性腺激素 抗体片段；所述固定化木瓜蛋白酶加入量以抗体体积计为〇. 1?I. 〇mg/ml，所述固定化木 瓜蛋白酶载酶量为〇. 03?0. 3g/g载体；所述人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体利用蛋白A 亲和层析法从小鼠腹水中纯化获得； 所述固定化木瓜蛋白酶是以NHS-PNIPAM为载体，以木瓜蛋白酶为底物，以pH 8.5， 0. lmol/L的硼酸缓冲液和N，N-二甲基甲酰胺为反应介质，在10?25°C水浴振荡2?10h， 离心，取沉淀即为固定化木瓜蛋白酶；所述NHS-PNIPAM为N-羟基琥珀酰亚胺酯活化的聚 (N-异丙基丙烯酰胺）；所述NHS-PNIPAM与木瓜蛋白酶的质量比为1:0. 1?1。
2. 如权利要求1所述人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体片段的分离方法，其特征在于所 述固定化木瓜蛋白酶溶液是将固定化木瓜蛋白酶溶于含终浓度5?20mmol/L半胱氨酸和 终浓度 I. 〇 ?2. Ommol/L EDTA 的 pH7. 0、0? 05mol/LPBS 缓冲液，制成 0? 1 ?3. Omg/ml 的固 定化木瓜蛋白酶溶液。
3. 如权利要求1所述人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体片段的分离方法，其特征在于 所述固定化木瓜蛋白酶按如下方法制备：将NHS-PNIPAM溶于预先用活化后的4A分子筛 干燥过夜的N，N-二甲基甲酰胺中，加入木瓜蛋白酶溶液，15°C水浴振荡2h，将所得反应 液用pH7.0、0. 05mol/LPBS缓冲液稀释，在40°C、11000r/min离心30min，收集沉淀，沉 淀用4°C、pH7.0,0. 05mol/L磷酸缓冲液溶解后再在40°C、llOOOr/min离心30min，重复3 次，最后获得的沉淀即得固定化木瓜蛋白酶；所述木瓜蛋白酶溶液是将木瓜蛋白酶用pH 8. 5、0. lmol/L的硼酸缓冲液溶解配制成2. 0?20. 0mg/ml的溶液，所述木瓜蛋白酶活力 为570. 3U/mg ;所述NHS-PNIPAM的质量用量以N，N-二甲基甲酰胺体积计为100mg/ml，所 述木瓜蛋白酶溶液的用量以木瓜蛋白酶质量计，所述木瓜蛋白酶与NHS-PNIPAM质量比为 0? 1:1。
4. 如权利要求1所述人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体片段的分离方法，其特征在于所 述含人绒毛膜促性腺激素抗体片段的水解液分离纯化的方法为：将含人绒毛膜促性腺激素 抗体片段的水解液上蛋白L层析柱，用pH3. 0、0. IM柠檬酸缓冲液洗脱，流速lml/min，收集 洗脱液，立即用pH 9. 0、I. OM的Tris-HCl缓冲液调pH至7. 0,以Millipore超滤管脱盐浓 缩，收集截留液即为人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体片段。
【文档编号】C12P21/06GK104313091SQ201410505048
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年9月27日 优先权日:2014年9月27日
【发明者】易喻, 应国清, 高虹, 王鸿, 梅建凤, 陈建澍 申请人:浙江工业大学