专利名称：具有增强活性的修饰的人酸性神经磷脂酶及其制备方法
背景技术：
酸性神经磷脂酶E.C.3.1.4.12，(ASM)是溶酶体中的磷酸二酯酶，其将在大脑、肝、肺、脾和淋巴结中发现的磷脂储存物质鞘磷脂水解为神经酰胺和胆碱磷酸。ASM活性的缺乏导致身体无法分解鞘磷脂，从而引起一种称为Niemann-Pick疾病的溶酶体贮积病。
Niemann-Pick疾病是一种遗传性的常染色体隐性脂类存储障碍，其特征是在诸如巨噬细胞和神经细胞的溶酶体中过量累积鞘磷脂，这损害了细胞的正常功能。Niemann-Pick A型疾病是在婴儿中的一种快速进行性的神经变性疾病，并典型地导致在两、三岁时死亡。Niemann-Pick B型疾病导致肝和脾增大和呼吸困难，并且通常会在成年的早期死亡。这两种都与ASM缺乏有关的Niemann-Pick疾病在本文统称为Niemann-Pick疾病。其它类型的Niemann-Pick疾病，例如C型，不包括ASM基因的突变并且不直接归因于ASM的功能。
酶替代疗法是一个众所周知的用于治疗溶酶体的存储疾病的方法。通过提供外源酶，酶替代疗法试图补充缺乏的酶活性。在使用酶替代疗法治疗Niemann-Pick疾病的情况中，目的是使得被治疗者能够加工处理鞘磷脂从而避免其在溶酶体中的累积。为了有效，该治疗的开始需要足够大量的代替酶以分解所累积的鞘磷脂，并且需要持续补给代替酶以避免随后进一步的鞘磷脂累积。
ASM是具有六个由氨基酸顺序编码的潜能的N-糖基化位点的糖蛋白(Schuchman，E.H.et al，(1991)，J.Biol.Chem，Vol.266，8531-8539)。定点诱变研究显示六个位点中的至少使用五个位点(Ferlina，K.，EtAl.，(1997)，Eur.J.Biochem.Vol.243，511-517)。该研究还发现删除近N端的4个位点，不破坏溶酶体定位、加工处理或酶活性。然而，研究显示删除两个C端的N糖基化位点导致迅速切断原始翻译产物或者导致形成一个没有活性的ASM前体(Ferlina，K.，Et Al.，(1997)，Eur.J.Biochem.Vol.243，511-517)。
通常接受在人体中，多种形式的ASM是有活性的观点，以及这些形式的特征在于具有不同的分子量和不同的糖基化模式。已描述了ASM循环发现的分泌型以及细胞内的溶酶体型都来自于相同的基因(Schissel.，S.L.，Et Al.(1998)J.Biol.Chem.Vol.273，18250-18259)。在存在锌的情况下，从胎牛血清(Spence，M.W.，Et Al.(1989)J.Biol.Chem.Vol.264，5358-5363)或不同的培养细胞(Schissel，S.L.，Et Al.(1996)，J.Biol.Chem.Vol.271，18431-18436)获得的分泌型显示出增加的特异活性。Bartelsen Et Al.还发现由昆虫sf21细胞分泌的用于重组ASM的依赖于铜的活性(Bartelsen O.，Et Al.(1998)J.Biotechnol.Vol 63，29-40)。然而，溶酶体型的ASM不需要加入外源的锌以便激活，并且被称为“不依赖于阳离子”(Schissel，S.L.，Et Al.(1996)，J.Biol.Chem.Vol.271，18431-18436，Levade，T.，(1986)J.Clin.Chem.Clin.Biochem.Vol.24，205-220)。Schissel等报道溶酶体型和分泌型两种形式都可以被锌特异的螯合剂和1，10-邻二氮杂菲失活，并且因此得出两种形式分子的酶活性都需要锌的结论(Schissel.，S.L.，Et Al.(1998)J.Biol.Chem.Vol.273，18250-18259)。这些显示锌已经紧密地与“不依赖于阳离子”的溶酶体型的分子结合，因而不需要外源的锌使其达到最大的活性。
分泌型和溶酶体型的ASM之间的差别显示为它们不同的糖基化以及N端的不同(Schissel.，S.L.，Et Al.(1998)J.Biol.Chem.Vol.273，18250-18259)。关于这两种形式的翻译后修饰，溶酶体型的ASM具有磷酸化和溶酶体定位所需的高的甘露糖型低聚糖，而分泌型的ASM含有复合型的N-连接的低聚糖。因为两种形式的ASM暴露于细胞的锌的不同以及因此对锌敏感性的不同的原因，而提出了两种形式的ASM的不同的转运途径(Schissel.，S.L.，Et Al.(1998)J.Biol.Chem.Vol.273，18250-18259)。由于溶酶体型ASM的蛋白水解过程，两种形式的ASM表现出不同的N端。两种形式的ASM的C端是否有不同还没有被测定出来，然而关于其它一些溶酶体酶的C端的加工过程已经报道，例如酸性α-葡萄糖苷酶(Wisseleaar.，H.A.，Et al，.(1993)J.Biol.Chem.Vol.268，16504-16511)和组织蛋白酶D(Yonezawa，S.，Et Al.，(1988)J.Biol.Chem.Vol.263，2223-2231；Lioyd，J.B.，Et Al.(1996)SubcellularBiochemistry(Harris，J.R.，Ed)Vol.27，Plenum Publishing Corp.，NewYork)。
据提议，ASM中的组氨酸和谷氨酸残基可能参与了金属结合位点，对ASM的初始序列和已知锌金属蛋白的比较显示有7个潜在的锌结合位点(Ferlinz，K.，et al，.(1997)Eur.J.Biochem.Vol.243 511-517)。AMS中的锌的结合和与对应于金属离子协同作用的特异氨基酸的准确化学计量还需要进一步的测定。，就二硫键和游离半胱氨酸数目而言，ASM中的17个半胱氨酸残基的状态也仍然没有研究清楚。据显示，二硫苏糖醇(DTT)，而不是还原型的谷胱苷肽，能以浓度依赖的方式抑制ASM的酶活性(Lioyd，J.B.，Et Al.(1996)Subcellular Biochemistry(Harris，J.R.，Ed)Vol.27，Plenum Publishing Corp.，New York)。然而，这种失活的机理也仍然不清楚。因为已经报道DTT对蛋白活性的影响与二硫化物还原没有关系，所以这种失活可能不是简单的由于二硫化物还原(Lansmann，S.，et al.(2003)Eur.J.Biochem.Vol.270，1076-1088)。相对于ASM这种失活，溶酶体脂质和鞘脂类激活剂蛋白SAP-C显示可以激发ASM的活性(Liu，B.，Et Al.(1997)J.Biol.Chem.Vol.272，16281-16287)。
如上文提及，已经证明酶替代疗法是治疗一些溶酶体贮积病的有效方法。关于ASM，在CHO细胞中表达的一种重组形式的此酶显示在包括酸性最适PH值、对巯基还原剂敏感性和被锌特异螯合剂抑制等方面和非重组形式的该酶一致的特性(Schuchman，E.H.，ET AL.(1992)Genomics Vol 12，197-205)。在纯化的重组人ASM(rhASM)蛋白的生化特性中，本研究发明者出乎意料的发现，当收获的细胞在-20℃冷冻储存几个星期，该蛋白的特异活性得到提高。对此未预料到的活性如本文描述的进行了鉴定，并且发现该活性涉及在多种人ASM的活性形式中出现的ASM蛋白的C端的半胱氨酸残基。
发明概述本发明涉及提高ASMs的活性的方法，特别关于其鞘磷脂水解活性，以及采用本方法制备的具有增强活性的ASMs。申请者发现对ASM中的自由半胱氨酸的修饰导致ASM的鞘磷脂活性的相当大的提高。如本文所列，本蛋白化学领域技术人员可以采用多种获得上述ASMs的方法。
本发明的一个方面涉及增强ASM的鞘磷脂水解活性的方法，该方法包括修饰C端半胱氨酸残基。在可选择的实施方案中，修饰可以包括删除ASM蛋白的C端的半胱氨酸残基、取代ASM蛋白的C端的半胱氨酸残基或者ASM的二聚化。自由硫醇基团活性的丧失增强了ASM的特异活性。诸如硫醚、硫酯或不对称的二硫化物等硫醇保护物可以形成结合化合基团(attachment compound)。结合化合物可以被可逆或不可逆的修饰半胱氨酸，例如马来酰亚胺。C端的半胱氨酸残基的取代可以是保守取代，例如丝氨酸的取代。通过硫键的交联而完成二聚化。
本发明的另一个方面涉及ASM的修饰形式，特别是人ASM和rhAMS，其中的修饰是C端的半胱氨酸残基。如本文更详细的列出，该修饰可以包括(a)删除C端的半胱氨酸残基，并且任选地，从C端删除另外的氨基酸残基，(b)通过至少一个其它氨基酸残基取代此半胱氨酸残基，(c)化学修饰此半胱氨酸残基，特别修饰其中的自由硫醇基团，(d)通过在这些末端半胱氨酸残基中的自由硫醇基团之间形成二硫键而形成ASM蛋白的二聚化。这些ASM的修饰可以是SEQ INNO2或SEQ ID NO3。优选地，该修饰使得此残基中的自由硫醇基团的活性丧失。相对于未修饰的或者野生型的ASMs，根据本发明的这些ASM蛋白的修饰形式显示增加的特异活性。
本发明的另一个方面涉及编码这些修饰的ASM分子的核酸分子。本发明的此方面包括上述编码核酸，以及含有上述核酸的表达载体以及表达这些修饰形式的ASMs的细胞和细胞系。
在另一个方面，本发明涉及治疗具有ASM相关综合病症的被治疗者的方法，其包括给有效剂量的根据本发明的修饰形式的ASM。修饰的ASM可以是SEQ IN NO2或SEQ ID NO3。该综合病症可以是脂类组织细胞增多症或Niemann-Pick疾病。
附图简要说明
图1是表示不同甲基甲烷硫代磺酸盐(MMTS)浓度的硫醇被修饰的rhASM的特异性活性的图。对样品进行标准的ASM活性检测。
图2A和2B表示经过羧化酶Y(CPY)处理的ASM的活性的图。使用不同浓度的CPY对ASM处理，并且通过使用Oregon GreenR马来酰亚胺(OGM)标记的方法监测C末端半胱氨酸的丧失。图2A显示经SDS-PAGE分析的OGM得到处理样品的条带中所检测到的荧光水平。图2B显示在溶液反应中CPY处理样品的ASM活性。
发明详述本发明涉及增强ASM活性的方法，特别是关于其鞘磷脂水解活性和通过本方法而具有增强活性的ASMs。申请者发现修饰ASM蛋白的C端的半胱氨酸残基导致ASM的鞘磷脂水解活性的极大的提高。使用该方法制备具有增强活性的修饰的ASM蛋白的优点是可以治疗多种类型的Niemann-Pick疾病。
基于此发现，本发明提供了增强ASM活性的方法，特别是ASM直接关于鞘磷脂水解的活性。通过诸如删除、取代、衍生(derivatization)或二聚化等方法修饰C端的半胱氨酸，可以提高ASM的水解活性。本文使用的“ASM”是水解鞘磷脂的溶酶体的磷酸二酯酶。ASM可从许多来源被纯化并具有多个特点。从人尿纯化的一种形式的ASM显示是具有酸性最适PH的70-kD的糖蛋白(Quintern，L.E.，et al.，BiochimBiophys Acta 922323-336)。
从GENBANK接收号NP 000534获得的一个人ASM等位基因在此处复制并命名为SEQ ID NO1。此所谓的人ASM“全长”版本含有629个氨基酸残基，并由一个半胱氨酸残基结尾，本文记为CYS629。然而，相信在细胞中该翻译蛋白有显著的蛋白水解过程。ASM生物合成的研究显示在内质网/高尔基器的内部的一个75kDa的预前体蛋白的一步(step-wise)加工过程，而形成72kDa的中间体。该72kDa的中间体形式进一步加工成70kDa的成熟溶酶体酶。也在高尔基体和溶酶体中发现较小的形式。另外，相信体内可能存在多种多形态形式的活性人ASM蛋白。因此，术语“ASM”包括SEQ ID NO1的所有变种和等位基因。
一种活性形式的ASM通过重组的方式合成，并且包括SEQ IDNO1的“全长”的人ASM的C端的570个氨基酸残基组成的多肽。此所谓的“rhASM”在N端起始于组氨酸-脯氨酸-亮氨酸-丝氨酸-脯氨酸序列，其与从第60位的组氨酸HIS60(SEQ ID NO4)开始的全长的人ASM分子的序列相一致。为了清楚起见，本文所有的特殊氨基酸残基的参考号将使用对应于全长人ASM蛋白，SEQ ID NO1中位置的数字。因此，rhASM的C端半胱氨酸残基还是指定为CYS629。
本发明不限制任何修饰或删除(物理地或者功能地)一个ASM分子的CYS629残基或其附属的活性硫醇基团的特殊方法或技术。例如，并且如本文更完善的描述，可以通过在两个ASM分子的末端半胱氨酸残基之间形成二硫键而形成ASM二聚物。该二聚化有效的修饰了已经不在存在的自由硫醇基团的化学活性。可选择的，可以通过多种试剂中的任何一个对末端半胱氨酸残基的此自由硫醇进行化学修饰，包括MMTS(其提供硫醇残基的可逆改变)和Oregon GreenR马来酰亚胺(OGM)(其产生不可逆的改变)。可选择的，可以通过酶降解的方法删除该半胱氨酸残基。为了产生大量的重组修饰的ASM，可以设计相应cDNA的序列以删除合成产物中含有自由硫醇基团的C末端半胱氨酸。例如，可以使用定点突变以修饰(如，突变为诸如丝氨酸的另一个氨基酸残基)或删除(通过使用终止密码子取代)该残基。也使用任何能产生该半胱氨酸残基或其硫醇基团改变或删除从而产生所期望的ASM特异活性增强的方法或技术。
在第一个实施方案中，增强ASM活性的方法包括删除C末端的半胱氨酸残基。与ASM一起使用的术语“C末端半胱氨酸”指具有神经磷脂酶(sphingomyelinase)活性的任何ASM多肽或其片段的C末端的半胱氨酸残基，尤其是那些含有自由硫醇基团的半胱氨酸残基。在SEQ ID NO2中举例说明C末端半胱氨酸残基被删除的ASM。如本文描述，删除可以在翻译后完成或在翻译重组版本的ASM蛋白的过程中完成，在该过程中，对编码C末端半胱氨酸残基的部分进行修饰。
在第二个实施方案中，增强ASM活性的方法包括取代C末端的半胱氨酸残基。该取代可以是保守取代，例如使用丝氨酸、苏氨酸或丙氨酸取代。在SEQ ID NO3中举例说明C末端半胱氨酸残基被删除的ASM。
“保守取代”指使用另一个具有相同净电荷和大致相同大小和形状的氨基酸取代。当总的碳原子数和其侧链中的杂原子数的差别不超过4的时候，具有脂肪族或取代脂肪族氨基酸侧链的氨基酸具有大致相同的大小。当其侧链中的支链数目的差别不超过1时，这些氨基酸具有大致相同的形状。其侧链具有苯基或取代苯基基团的氨基酸被认为是具有大致相同的大小和形状。
“高度保守取代”指使用侧链含有相同官能团并且大小和形状几乎相同的氨基酸进行另一个氨基酸的取代。当总的碳原子数和其侧链中的杂原子数的差别不超过2的时候，具有脂肪族或取代脂肪族氨基酸侧链的氨基酸具有几乎相同的大小。当其侧链含有相同数目的支链时，这些氨基酸具有几乎相同的形状。高度保守取代的例子包括缬氨酸取代亮氨酸，苏氨酸取代丝氨酸，天门冬氨酸取代谷氨酸以及苯基甘氨酸取代苯基丙氨酸。
在第三个实施方案中，增强ASM活性的方法包括ASM的二聚化。优选，ASM二聚体在各自ASM C末端的半胱氨酸残基之间进行交联。更优选，ASM二聚体使用二硫键进行交联。
在第四个实施方案中，增强ASM活性的方法包括对C末端的半胱氨酸残基的衍生。典型地，衍生包括将一个化合物结合到C末端的半胱氨酸残基上。该化合物可以包括硫醇保护基团。增加的硫醇保护基团形成S-保护的半胱氨酸。优选，硫醇保护基团选自硫醚、硫酯或不对称的二硫化合物。该化合物也可以包括半胱氨酸的修饰物。该修饰物可以是半胱氨酸的可逆或不可逆修饰物。优选，该修饰物与C末端半胱氨酸生成混合的二硫化物。可逆的修饰物例如包括5，5’-二硫代-二-(2-硝基苯甲酸)(Ellman’s试剂，DTNB)和甲基甲烷硫代磺酸盐(MMTS)。不可逆修饰物例如包括N-乙基马来酰亚胺(NEM)或OREGON GREENR488马来酰亚胺(OGM)。
术语“S-保护的半胱氨酸”包括硫醇的反应部分，-SH被保护基团封闭的半胱氨酸残基。合适的保护基团对于本领域技术人员是已知的，并且在例如T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groups in OrganicSynthesis，第三版，John Wiley & Sons(1999)，pp.454-493中描述，其公开的内容通过引用而整个并入本发明。合适的保护基团是无毒，在药方中稳定并且具有最小附加官能基。自由硫醇可以作为硫醚、硫酯或氧化为不对称的二硫化物而被保护。典型地，该硫醇作为硫醚而被保护。合适的硫醚包括但不局限于S-烷基硫醚(如，C1-C5烷基)，和S-苯甲基硫醚(如，半胱氨酸-S-S-t-Bu)。最典型地，保护基团是烷基硫醚或可选择的，S-保护的半胱氨酸是S-甲基半胱氨酸。
本发明进一步涉及通过本发明的方法制备的修饰的ASMs。术语“修饰的ASM”包括任何根据本发明的方法修饰的ASM。修饰的ASMs包括被修饰的或者其部分被修饰的全长的野生型的ASMs。该ASMs可以通过对从适当来源纯化的野生型的ASM修饰而制备。可选择的，该ASMs作为根据本发明的方法修饰的核酸所表达的产物而制备。修饰的ASMs也可以通过合成而制备，并且修饰可以发生在合成之前或之后。典型地，ASM是人源的，或者具有与人源之一序列相似的序列，然而，来自于其它物种的ASMs形式也是所期望的，包括但不局限于小鼠、牛、兔、大鼠、山羊和马。修饰的ASMs包括那些基于任何ASM等位基因或变种的分子。
本发明进一步涉及含有编码修饰的ASM的核苷酸序列的核酸分子或多聚核苷酸。
提取的核酸分子或核苷酸序列可以包括化学合成或重组方法获得的核酸分子或核苷酸序列。提取的核酸分子也可以包括在异源宿主细胞中的重组DNA分子，以及在溶液中部分或充分纯化的DNA分子。
本发明的核酸分子可以与其它编码或调控序列相融合，并且可以仍然被认为是分离的。因此，载体包含的重组DNA也包括在本发明所定义的“分离”的。
本发明进一步涉及包括本发明分离的核酸分子的载体，其中该核酸分子被有效的连接到调控序列上，以及本发明还涉及包括载体的重组宿主细胞。本发明还提供用于制备本发明描述的分离的核酸分子所编码的多肽(修饰的ASM多肽)的方法，包括在适合所述的核酸分子表达的条件下培养本发明的重组宿主细胞。
本发明的另一个方面适合含有本文描述的核酸分子的核酸的构建。该构建包括一个载体(如一个表达载体)，在该载体中，本发明的序列按正义和反义的方向插入。本文使用的术语“载体”或“构建”指能够转运与其连接的另外核酸的核酸分子。载体的已知类型是“质粒”，指可以将另外的DNA片段连接在其上的环行双链DNA环。载体的另一种类型是病毒载体，其中，另外的DNA片段可以被连接到病毒基因组中。一定的载体能够在其被导入的宿主细胞中自主复制(例如，含有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(如非附加型哺乳动物载体)一旦被导入宿主细胞则插入宿主的基因组中，并且因此随着宿主基因组的复制而复制。而且，一定的载体，表达载体能够指导能够被操作插入的基因的表达。通常，在重组DNA技术中使用的表达载体通常是质粒型的载体。然而，本发明计划包括诸如病毒载体等的那些起相同功能的其它形式的表达载体(例如，复制缺陷型反转录病毒，腺病毒和腺病毒相关病毒)。
本发明的优选的重组表达载体包括在宿主细胞中适合表达该核酸分子的形式存在的本发明的核酸分子。这意味着重组表达载体包括一个或多个为了用于表达在宿主细胞的基础上选择的调控序列，其通过操作而与将要表达的核酸序列相连。在重组表达载体中，“操作性的连接”指以一种方式将感兴趣的核酸序列连接到调控序列上，该方式允许核酸序列的表达(如，在体外转录/翻译系统中，或当载体导入宿主细胞后而在宿主细胞中)。术语“调控序列”将包括启动子、增强子和其它表达调控元件(例如，多聚腺苷酸信号)。例如上述调控序列在Goeddel，Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中描述。调控序列包括那些在多种类型的宿主细胞中调控核苷酸序列表达的必要序列以及那些仅仅在一定的宿主细胞中调控核苷酸序列表达的必要序列。
本领域技术人员将理解表达载体的设计取决于诸如将被转化的宿主细胞的选择以及期望的多肽的表达水平等因素。本发明的表达载体能够被导入宿主细胞因此而制备多肽，包括本发明描述的核酸分子编码的融合多肽。
本发明进一步涉及分离转染有本发明描述的载体的宿主细胞。本发明可以互换使用术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”。据理解，上述术语不仅指特别的被试细胞，还包括该细胞的后代和可那潜在的后代。因为由于突变或者环境影响而在随后制备中发生一定的修饰，所以该后代事实不能与亲代细胞一致，但是确仍然包括在本发明所使用的术语的范围内。
宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，本发明的核酸分子可以在细菌细胞中表达(例如大肠杆菌)，昆虫细胞，酵母或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞，人293T细胞，HeLa细胞或NIH 3T3细胞)。其它合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。通过常规的转化或转染技术可以将载体DNA导入原核细胞或真核细胞。
本发明进一步涉及治疗需要进行“ASM相关综合病征”治疗的被治疗者的方法。ASM相关综合病征包括任何与ASM水解能力有关的病征，例如，诸如Niemann-Pick A型和Niemann-Pick B型的溶酶体贮积病。治疗的方法包括给被治疗者治疗有效剂量的修饰的ASM的步骤。典型地，修饰的ASM是具有增强的神经磷脂酶水解活性的分子。
“被治疗者”典型地指人，但也可以是需要使用修饰的ASM治疗的动物，例如，陪伴动物(如狗、猫以及类似动物)，饲养动物(例如牛、猪、马及类似动物)和实验动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠及类似动物)。
需要使用修饰的ASM治疗的被治疗者是具有可以使用修饰的ASMs治疗以获得有益的治疗和/或预防效果的综合病征、疾病和/或情况。有益的结果包括综合病征严重性的降低或综合病征发作的延迟，寿命的增加和/或疾病或情况的更迅速或更完全消退或终止。
“有效剂量”指相对于没有用修饰的ASM治疗的情况，采用修饰的ASM治疗的病征的临床结果得到改善而所需要的修饰ASM的量。修饰的ASM的给药量将取决于疾病或情况的程度、严重性以及类型，期望治疗的量以及药方的释放特性。还取决于被治疗者的健康、体积、重量、年龄、性别和药物的耐要性。在酶替代治疗领域的技术人员能够设计用药方法，由此而使得修饰的ASM给药能维持足够长的时间以获得期望的治疗效果。例如，修饰的ASM的给药剂量的范围从0.1mg/kg到100mg/kg，优选从0.1mg/kg到10mg/kg，更优选从0.1mg/kg到2mg/kg。例如修饰的ASM可以按每日，一周两次，每周，隔周或每月的注射方法给药。
对于被治疗者，修饰的ASM可以与作为药物组合物一部分的药学可接受的载体联合给药。更加选自的给药途径，药物组合物的配方将有所改变。合适的药学可接受的载体可以含有不与化合物反应的惰性成分。载体应该是不会引起排斥的，既无毒、抗发炎、无免疫源性以及在给药部位没有其它不需要的反应性。药学上可接受的载体的例子例如包括盐、气溶胶、商业上可获得的惰性凝胶或含有清蛋白、甲基纤维素或胶原物质的液体补充物。可以使用标准的药方技术，例如在Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，PA.中描述的方法。
可注射的给药药方(delivery formulation)可以通过静脉给药或直接在需要治疗的部位给药。可注射的载体可以是粘性溶液或凝胶。给药药方包括生理盐、抑细菌的盐(含有大约0.9％苯甲醇的盐)、磷酸盐缓冲液、Hank’s溶液、Ringer’s-lactate或含有清蛋白、甲基纤维素或透明质酸的液体补充物。可注射的基质包括聚(乙撑氧)的聚合物和乙烯和丙烯氧化物的共聚物(参见Cao等J.Biomater.Sci.9475(1998)和Sims Et Al.Plast Reconstr.Surg.98843(1996)，其整个的技术通过引用而并入本发明)。用于治疗溶酶体贮积病的重组酶的可注射药方在本领域是已知的。
实施例1制备rhASM使用转染有含有全长人ASM cDNA载体的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)制备重组人ASM蛋白(rhASM)，其中全长人ASM cDNA从LMAGE协会(GenBank接受号为AI587087)获得。将PCR产物克隆到含有DHFR选择标记的哺乳动物表达载体中。对质粒的整个开放阅读框进行测序以确保预期序列的忠实性。使用lipofectamine(Invitrogen)转染DHFR缺乏的CHO-DXB11细胞，在补充有10％透析的FBS和0.2μM氨甲蝶呤(CalBiochem)的核苷酸缺乏的培养基中筛选转染细胞。通过将未克隆的库在逐渐增加的氨甲蝶呤浓度中选择，而进一步激发rhASM的表达水平。该方法产生一些一旦撤离氨甲蝶呤之后仍然保持rhASM高表达的未克隆库。通过包括疏水相互作用和离子交换步骤的正交层析(orthogonal chromatographic)的方法从CHO条件培养基中纯化该蛋白。纯化的rhASM蛋白显示其N端从组氨酸-脯氨酸-亮氨酸-丝氨酸-脯氨酸(SEQ ID NO4)开始，相应于一个具有570个氨基酸残基的成熟蛋白，其信号肽在公布的人ASM序列的丙氨酸59和组胺撒60之间断裂(Quintern，L.E.，et al.，(1987)Biochim Biophys Acta 922323-336)。该蛋白的N端序列与从昆虫Sf21细胞(He，X.，et al.(1999)Biochim.Biophys.Acta.Vol.1432 251-264)中和CHO细胞中(Ferlina，K.，Et Al.，(1997)，Eur.J.Biochem.Vol.243，511-517)。制备的ASM重组蛋白的序列相同。
实施例2体外活性检测在稳定转染的重组CHO细胞系中表达rhASM蛋白。收获分泌的蛋白之后，观察到在一定的储存条件中，条件培养基中的rhASM的活性增强。通过在三个储存温度储存而实施对其活性改变的监测研究。发现如果收获的培养基储存在-80℃，则rhASM的活性稳定，在超过160天的时间里没有发现活性的改变。然而，一旦将收获的培养基储存在-20℃，则发现ASM活性的极大增强。当将培养基储存在4℃时，rhASM的活性只有微量的增加。
为了确定在-20℃活性的增加究竟是由于rhASM蛋白本身的特异活性的改变，还是由于与其它分子相互作用的结果(例如与激活剂的相互作用或者是抑制剂的丧失)，将rhASM从收获的培养基中纯化为均一的分子。一个产物从新鲜收获的培养基制备(指定为“低活性形式”的rhASM)，而第二个产物从已经在-20℃储存有3个月的培养基中制备(指定为“高活性形式的”rhASM)。对从这两种制备方法获得的纯化rhASM的活性检测，显示两个分子在特异活性上的显著的不同从新鲜收获的培养基制备的产物的17.3U/mg相对于从储存在-20℃的培养基制备的产物的80.2U/mg。因此，从收获的储存在-20℃的培养基纯化的酶的特异活性大约比从新鲜收获的培养基纯化的酶的活性高5倍。
对这两种“形式”的rhASM的动力学进行了分析。重组人ASM(rhASM)在37℃与一个额外的在pH5.5，含有0.1mM乙酸锌，0.25mg/mL BSA和0.15％Tween 20的250mM乙酸钠溶液中的2-(N-十六酰胺)-4-硝基苯磷酸胆碱(CalBiochem，San Diego，CA)，孵育。37℃孵育30分钟之后，加入0.2M含有50％乙醇的甘氨酸-氢氧化钠终止反应。通过计算在反应过程中(E415＝15.0mM-1cm-1)产生的被分解的底物2-(N-十六酰胺)-4-硝基苯酚盐)的量而测定活性。在设计检测金属离子依赖性的活性检测中，用相同的但是不含有金属例子的缓冲液稀释rhASM。然后在样品中加入不同量的二价金属例子，并在附加的由无金属例子的缓冲液制备的2-(N-十六酰胺)-4-硝基苯磷酸胆碱底物之前在37℃预孵育30分钟。使用在pH5.5，含有0.1mM乙酸锌，0.25mg/mL BSA和0.15％Tween 20的250mM乙酸钠溶液中的浓度变更的底物2-(N-十六酰胺)-4-硝基苯磷酸胆碱，在415nm对动力学参数进行评估。从结果数据的Eadie-Hofstee图确定动力学参数。
表1高和低活性的ASM蛋白的动力学分析
实施例3DTNB活性检测低活性形式和高活性形式的rhASM蛋白样品首先浓缩在20mM柠檬酸钠，150mM氯化钠，PH6.0溶液中。在412nm使用在变性和非变性缓冲液中0.8-1.2mg rhASM和0.5mM DTNB对自由硫醇浓度进行评估，并且在读取吸收值之前在室温孵育10分钟。所得结果与半胱氨酸标准曲线进行对比。结果确定低活性形式的rhASM含有一个自由硫醇，然而高活性形式不含有自由硫醇。
实施例4使用甲基甲烷硫代磺酸盐(MMTS)和Oregon GreenR马来酰亚胺(OGM)对rhASM的自由硫醇进行化学修饰因为自由半胱氨酸的消失呈现出与增强的活性间的联系，在高和低活性制备物的基础上，实施实验以检测是否通过化学封闭低活性形式中的自由半胱氨酸的硫醇基团而可以获得rhASM活性。硫醇的小分子量修饰物MMTS修饰半胱氨酸以形成混合的二硫键(S-S-CH3)。由于其小尺寸，其可以存在于获得的用于蛋白结构功能研究的最小混乱的半胱氨酸修饰的试剂中。使用MMTS修饰低活性形式的rhASM，然后使用标准的活性检测方法(参见图1)对其活性进行测定。如图1显示的，MMTS量的增加(因此增强了修饰的程度)导致rhASM的特异活性的增强，并且最大增强约为5倍。
也使用OGM修饰低活性形式的rhASM中的自由半胱氨酸。OGM代表具有大的分子量的修饰物，其不象MMTS的修饰而是不可逆的修饰。它还作为荧光标签以允许追踪修饰。OGM修饰导致的rhASM的特异活性的增强非常类似于在MMTS修饰中观察到的增强。这表明该修饰的本质以及修饰物的大小都是非常灵活的。
为了鉴定rhASM中参与此活性的自由半胱氨酸的位置，制备0.5mg OGM修饰的rhASM的而用于多肽作图和特性鉴定。该工作原理是利用Oregon GreenR488的吸收/荧光特性而鉴定在多肽图谱中半胱氨酸标记的多肽。经过胰岛素消化的多肽通过C4反相HPLC柱分离，并且通过在495nm的吸收而检测OGM-标记的多肽的洗脱液。多肽图谱中在此波长仅仅检测到一个主要的峰，与DTNB的结果相一致，表明在蛋白中仅存在一个自由的半胱氨酸。收集该峰并通过MALDI-TOF质谱测量对其分析。结果表明自由半胱氨酸存在于rhASM的C末端的胰蛋白酶肽。为了进一步确认就是C末端的肽被修饰，对具有标记的肽峰的MALDI-TOF靶分子进行源后衰变(PSD)分裂分析。结果清晰的鉴定出C末端的半胱氨酸作为自由的并被OGM修饰的半胱氨酸。
实施例5铜促进的二聚体的形成将上文描述的所制备的rhASM蛋白透析并用20mM Tris-HCl，150mM氯化钠，PH7.0的溶液将其稀释到终浓度为0.5mg/ml。将硫酸铜(除非是其它专用的，则为0.1mM)加入并且使得混合物在37℃孵育30分钟或者在冰上孵育1小时。在设计研究二聚体降解的实验中，在铜处理之后将100mM DTT或20mM EDTA加入到蛋白中，并且继续在37℃孵育30分钟。在4-20％预制的Tris-甘氨酸凝胶(Novex)上通过凝胶电泳以及考马斯兰染色对孵育的样品进行分析。
为了理解依赖于铜的活性的增加，将两种形式的rhASM蛋白与0.1mM的硫酸铜孵育然后在非还原条件下的4-20％的SDS-PAGE凝胶中检测。铜与低活性形式的rhASM孵育导致相应于rhASM二聚体大小(130-140kDa)的较高分子量条带的出现。在铜与高活性形式的rhASM孵育过程中没有出现单体转化为二聚体的现象。因此，铜促进了在低活性形式而非高活性形式的rhASM蛋白的二聚体的形成。以这种方式形成的二聚体对于DTT敏感，当填充缓冲液中含有DTT时，二聚体将消失。这表明在二聚体中包括二硫键，以及表明铜促进了这个分子间的二硫键的形成。这个结果与在常规的蛋白再折叠实验中，当加入铜离子将促进分子内二硫键形成的结果相一致。对于rhASM二聚体形成所需要的最小量的铜浓度大约为10mM。
实施例6羧肽酶Y处理使用羧肽酶Y(CPPY，从Roche Molecular Biochemicals获得)从rhASM蛋白的C末端断裂氨基酸。在20mM柠檬酸钠，200mM氯化钠，PH6.0的缓冲溶液中含有不同比例的CPY与rhASM(1∶1到1∶260000)的组合，将该溶液在冰上孵育8小时。然后对该样品进行活性检测以及用OGM进行荧光标记以检测剩余的自由半胱氨酸残基。使用SDS-PAGE在4-20％的凝胶中对标记的rhASM蛋白进行分析，并且在荧光测量仪上(来自GLYKO，inc.的FACE图像仪)观察以便量化条带的强度。也可以使用固定的CPY珠(Pierce)实施该CPY反应，以确认来自溶液降解的结果。简要的讲，1mg/ml rhASM(0.1ml)的等分试样与在0.45μm的旋转过滤器(来自Millipore的Ultrafree-MC)上的10μl的CPY珠混合。降解的蛋白通过旋转离心而通过过滤器，以在不同的时间点除去固定的CPY，然后对滤出液进行ASM活性的检测。
羧肽酶Y(CPY)从蛋白的C末端切割氨基酸序列。因为上文描述的标记结果显示正是C末端的自由半胱氨酸是造成rhASM活性的原因，进行CPY处理以观察是否除去C末端的半胱氨酸也可以产生rhASM的活性。将低活性形式的rhASM与CPY按不同的酶-蛋白比例混合孵育，并对每个反应的活性检测。在此反应中通过该蛋白对OGM标记的敏感性而检测C末端半胱氨酸的丧失。在将样品加到4-20％SDS-PAGE之前使CPY-降解的样品与OGM孵育，以检测OGM包括的程度。每个反应的荧光带的强度根据实验方法(图2A)的描述进行定量。显然，随着CPY浓度的增加，rhASM逐渐丧失被OGM标记的能力，反映了C末端自由半胱氨酸的丧失。活性检测显示随着在孵育过程中使用更多的CPY，rhASM的活性在增强(图2B)。在使用溶解的CPY进行降解的同时，使用固定的CPY的孵育过程也在进行，并且也观察到相似的rhASM活性模式(数据没有显示)。这些结果显示酶法删除C末端的半胱氨酸残基产生rhASM的活性，与对硫醇修饰所得到的结论相一致。
实施例7取代CYS629从IMAGE协会获得ASM的cDNA(GenBank号为AI587087)。使用PCR方法对开放阅读框进行扩增，其中所使用的反向引物中的末端半胱氨酸密码子TGC被删除或者被突变为TCC(丝氨酸)。将PCR产物克隆到含有DHFR选择标记的哺乳动物表达载体中。对质粒的整个开放阅读框进行测序以确保仅存在期望的突变。使用lipofectamine(Gibco)转染DHFR缺乏的CHO-DXB11细胞，在补充有10％透析的FBS和0.2μM氨甲蝶呤(CalBiochem)的核苷酸缺乏的培养基中筛选转染细胞。通过将未克隆的库在逐渐增加的氨甲蝶呤浓度中选择，而进一步激发rhASM的表达水平。
根据上文描述的数据，表明修饰或者删除C末端半胱氨酸导致rhASM活性的显著增强。为了确认C末端半胱氨酸在此激活过程中的作用，使用定点突变以产生ASM突变子，其中C末端的半胱氨酸(CYS629)通过使用终止密码子而删除(CYS670del)或者突变为丝氨酸(CYS629→Ser)。突变的蛋白在稳定转染的CHO细胞中过量表达并且纯化。对纯化的突变形式的蛋白的特异活性进行检测并且与野生型的全长rhASM蛋白进行比较(表II)。相比较于全长野生型的蛋白，两个突变蛋白显示平均增强大约5倍的特异活性。这些结果支持了对C末端半胱氨酸的硫醇集团的修饰或者删除导致ASM活性的结论。
表II野生型(WT)和突变rhASM蛋白的活性
当本发明通过引用其优选的实施方案进行详细说明的时候，本领域技术人员会理解在不脱离本发明范围的情况下可以在形式和细节上作许多改变。
序列表<110>建新公司<120>具有增强活性的修饰的人酸性神经磷脂酶及其制备方法<130>850735CP<140>
<141>
<150>60/478,124<151>2003-06-12<160>4<170>PatentIn Ver.3.2<210>1<211>629<212>PRT<213>人类(Homo sapiens)<400>1Met Pro Arg Tyr Gly Ala Ser Leu Arg Gln Ser Cys Pro Arg Ser Gly1 5 10 15Arg Glu Gln Gly Gln Asp Gly Thr Ala Gly Ala Pro Gly Leu Leu Trp20 25 30Met Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ser35 40 45Asp Ser Arg Val Leu Trp Ala Pro Ala Glu Ala His Pro Leu Ser Pro50 55 60Gln Gly His Pro Ala Arg Leu His Arg Ile Val Pro Arg Leu Arg Asp65 70 75 80Val Phe Gly Trp Gly Asn Leu Thr Cys Pro Ile Cys Lys Gly Leu Phe85 90 95Thr Ala Ile Asn Leu Gly Leu Lys Lys Glu Pro Asn Val Ala Arg Val
100 105 110Gly Ser Val Ala Ile Lys Leu Cys Asn Leu Leu Lys Ile Ala Pro Pro115 120 125Ala Val Cys Gln Ser Ile Val His Leu Phe Glu Asp Asp Met Val Glu130 135 140Val Trp Arg Arg Ser Val Leu Ser Pro Ser Glu Ala Cys Gly Leu Leu145 150 155 160Leu Gly Ser Thr Cys Gly His Trp Asp Ile Phe Ser Ser Trp Asn Ile165 170 175Ser Leu Pro Thr Val Pro Lys Pro Pro Pro Lys Pro Pro Ser Pro Pro180 185 190Ala Pro Gly Ala Pro Val Ser Arg Ile Leu Phe Leu Thr Asp Leu His195 200 205Trp Asp His Asp Tyr Leu Glu Gly Thr Asp Pro Asp Cys Ala Asp Pro210 215 220Leu Cys Cys Arg Arg Gly Ser Gly Leu Pro Pro Ala Ser Arg Pro Gly225 230 235 240Ala Gly Tyr Trp Gly Glu Tyr Ser Lys Cys Asp Leu Pro Leu Arg Thr245 250 255Leu Glu Ser Leu Leu Ser Gly Leu Gly Pro Ala Gly Pro Phe Asp Met260 265 270Val Tyr Trp Thr Gly Asp Ile Pro Ala His Asp Val Trp His Gln Thr275 280 285Arg Gln Asp Gln Leu Arg Ala Leu Thr Thr Val Thr Ala Leu Val Arg290 295 300Lys Phe Leu Gly Pro Val Pro Val Tyr Pro Ala Val Gly Asn His Glu305 310 315 320Ser Thr Pro Val Asn Ser Phe Pro Pro Pro Phe Ile Glu Gly Asn His325 330 335
Ser Ser Arg Trp Leu Tyr Glu Ala Met Ala Lys Ala Trp Glu Pro Trp340 345 350Leu Pro Ala Glu Ala Leu Arg Thr Leu Arg Ile Gly Gly Phe Tyr Ala355 360 365Leu Ser Pro Tyr Pro Gly Leu Arg Leu Ile Ser Leu Asn Met Asn Phe370 375 380Cys Ser Arg Glu Asn Phe Trp Leu Leu Ile Asn Ser Thr Asp Pro Ala385 390 395 400Gly Gln Leu Gln Trp Leu Val Gly Glu Leu Gln Ala Ala Glu Asp Arg405 410 415Gly Asp Lys Val His Ile Ile Gly His Ile Pro Pro Gly His Cys Leu420 425 430Lys Ser Trp Ser Trp Asn Tyr Tyr Arg Ile Val Ala Arg Tyr Glu Asn435 440 445Thr Leu Ala Ala Gln Phe Phe Gly His Thr His Val Asp Glu Phe Glu450 455 460Val Phe Tyr Asp Glu Glu Thr Leu Ser Arg Pro Leu Ala Val Ala Phe465 470 475 480Leu Ala Pro Ser Ala Thr Thr Tyr Ile Gly Leu Asn Pro Gly Tyr Arg485 490 495Val Tyr Gln Ile Asp Gly Asn Tyr Ser Gly Ser Ser His Val Val Leu500 505 510Asp His Glu Thr Tyr Ile Leu Asn Leu Thr Gln Ala Asn Ile Pro Gly515 520 525Ala Ile Pro His Trp Gln Leu Leu Tyr Arg Ala Arg Glu Thr Tyr Gly530 535 540Leu Pro Asn Thr Leu Pro Thr Ala Trp His Asn Leu Val Tyr Arg Met545 550 555 560Arg Gly Asp Met Gln Leu Phe Gln Thr Phe Trp Phe Leu Tyr His Lys565 570 575
Gly His Pro Pro Ser Glu Pro Cys Gly Thr Pro Cys Arg Leu Ala Thr580 585 590Leu Cys Ala Gln Leu Ser Ala Arg Ala Asp Ser Pro Ala Leu Cys Arg595 600 605His Leu Met Pro Asp Gly Ser Leu Pro Glu Ala Gln Ser Leu Trp Pro610 615 620Arg Pro Leu Phe Cys625<210>2<211>628<212>PRT<213>人类(Homo sapiens)<400>2Met Pro Arg Tyr Gly Ala Ser Leu Arg Gln Ser Cys Pro Arg Ser Gly1 5 10 15Arg Glu Gln Gly Gln Asp Gly Thr Ala Gly Ala Pro Gly Leu Leu Trp20 25 30Met Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ser35 40 45Asp Ser Arg Val Leu Trp Ala Pro Ala Glu Ala His Pro Leu Ser Pro50 55 60Gln Gly His Pro Ala Arg Leu His Arg Ile Val Pro Arg Leu Arg Asp65 70 75 80Val Phe Gly Trp Gly Asn Leu Thr Cys Pro Ile Cys Lys Gly Leu Phe85 90 95Thr Ala Ile Asn Leu Gly Leu Lys Lys Glu Pro Asn Val Ala Arg Val100 105 110Gly Ser Val Ala Ile Lys Leu Cys Asn Leu Leu Lys Ile Ala Pro Pro115 120 125
Ala Val Cys Gln Ser Ile Val His Leu Phe Glu Asp Asp Met Val Glu130 135 140Val Trp Arg Arg Ser Val Leu Ser Pro Ser Glu Ala Cys Gly Leu Leu145 150 155 160Leu Gly Ser Thr Cys Gly His Trp Asp Ile Phe Ser Ser Trp Asn Ile165 170 175Ser Leu Pro Thr Val Pro Lys Pro Pro Pro Lys Pro Pro Ser Pro Pro180 185 190Ala Pro Gly Ala Pro Val Ser Arg Ile Leu Phe Leu Thr Asp Leu His195 200 205Trp Asp His Asp Tyr Leu Glu Gly Thr Asp Pro Asp Cys Ala Asp Pro210 215 220Leu Cys Cys Arg Arg Gly Ser Gly Leu Pro Pro Ala Ser Arg Pro Gly225 230 235 240Ala Gly Tyr Trp Gly Glu Tyr Ser Lys Cys Asp Leu Pro Leu Arg Thr245 250 255Leu Glu Ser Leu Leu Ser Gly Leu Gly Pro Ala Gly Pro Phe Asp Met260 265 270Val Tyr Trp Thr Gly Asp Ile Pro Ala His Asp Val Trp His Gln Thr275 280 285Arg Gln Asp Gln Leu Arg Ala Leu Thr Thr Val Thr Ala Leu Val Arg290 295 300Lys Phe Leu Gly Pro Val Pro Val Tyr Pro Ala Val Gly Asn His Glu305 310 315 320Ser Thr Pro Val Asn Ser Phe Pro Pro Pro Phe Ile Glu Gly Asn His325 330 335Ser Ser Arg Trp Leu Tyr Glu Ala Met Ala Lys Ala Trp Glu Pro Trp340 345 350Leu Pro Ala Glu Ala Leu Arg Thr Leu Arg Ile Gly Gly Phe Tyr Ala355 360 365
Leu Ser Pro Tyr Pro Gly Leu Arg Leu Ile Ser Leu Asn Met Asn Phe370 375 380Cys Ser Arg Glu Asn Phe Trp Leu Leu Ile Asn Ser Thr Asp Pro Ala385 390 395 400Gly Gln Leu Gln Trp Leu Val Gly Glu Leu Gln Ala Ala Glu Asp Arg405 410 415Gly Asp Lys Val His Ile Ile Gly His Ile Pro Pro Gly His Cys Leu420 425 430Lys Ser Trp Ser Trp Asn Tyr Tyr Arg Ile Val Ala Arg Tyr Glu Asn435 440 445Thr Leu Ala Ala Gln Phe Phe Gly His Thr His Val Asp Glu Phe Glu450 455 460Val Phe Tyr Asp Glu Glu Thr Leu Ser Arg Pro Leu Ala Val Ala Phe465 470 475 480Leu Ala Pro Ser Ala Thr Thr Tyr Ile Gly Leu Asn Pro Gly Tyr Arg485 490 495Val Tyr Gln Ile Asp Gly Asn Tyr Ser Gly Ser Ser His Val Val Leu500 505 510Asp His Glu Thr Tyr Ile Leu Asn Leu Thr Gln Ala Asn Ile Pro Gly515 520 525Ala Ile Pro His Trp Gln Leu Leu Tyr Arg Ala Arg Glu Thr Tyr Gly530 535 540Leu Pro Asn Thr Leu Pro Thr Ala Trp His Asn Leu Val Tyr Arg Met545 550 555 560Arg Gly Asp Met Gln Leu Phe Gln Thr Phe Trp Phe Leu Tyr His Lys565 570 575Gly His Pro Pro Ser Glu Pro Cys Gly Thr Pro Cys Arg Leu Ala Thr580 585 590Leu Cys Ala Gln Leu Ser Ala Arg Ala Asp Ser Pro Ala Leu Cys Arg
595 600 605His Leu Met Pro Asp Gly Ser Leu Pro Glu Ala Cln Ser Leu Trp Pro610 615 620Arg Pro Leu Phe625<210>3<211>629<212>PRT<213>人类(Homo sapiens)<400>3Met Pro Arg Tyr Gly Ala Ser Leu Arg Gln Ser Cys Pro Arg Ser Gly1 5 10 15Arg Glu Gln Gly Gln Asp Gly Thr Ala Gly Ala Pro Gly Leu Leu Trp20 25 30Met Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ser35 40 45Asp Ser Arg Val Leu Trp Ala Pro Ala Glu Ala His Pro Leu Ser Pro50 55 60Gln Gly His Pro Ala Arg Leu His Arg Ile Val Pro Arg Leu Arg Asp65 70 75 80Val Phe Gly Trp Gly Asn Leu Thr Cys Pro Ile Cys Lys Gly Leu Phe85 90 95Thr Ala Ile Asn Leu Gly Leu Lys Lys Glu Pro Asn Val Ala Arg Val100 105 110Gly Ser Val Ala Ile Lys Leu Cys Asn Leu Leu Lys Ile Ala Pro Pro115 120 125Ala Val Cys Gln Ser Ile Val His Leu Phe Glu Asp Asp Met Val Glu130 135 140Val Trp Arg Arg Ser Val Leu Ser Pro Ser Glu Ala Cys Gly Leu Leu145 150 155 160
Leu Gly Ser Thr Cys Gly His Trp Asp Ile Phe Ser Ser Trp Asn Ile165 170 175Ser Leu Pro Thr Val Pro Lys Pro Pro Pro Lys Pro Pro Ser Pro Pro180 185 190Ala Pro Gly Ala Pro Val Ser Arg Ile Leu Phe Leu Thr Asp Leu His195 200 205Trp Asp His Asp Tyr Leu Glu Gly Thr Asp Pro Asp Cys Ala Asp Pro210 215 220Leu Cys Cys Arg Arg Gly Ser Gly Leu Pro Pro Ala Ser Arg Pro Gly225 230 235 240Ala Gly Tyr Trp Gly Glu Tyr Ser Lys Cys Asp Leu Pro Leu Arg Thr245 250 255Leu Glu Ser Leu Leu Ser Gly Leu Gly Pro Ala Gly Pro Phe Asp Met260 265 270Val Tyr Trp Thr Gly Asp Ile Pro Ala His Asp Val Trp His Gln Thr275 280 285Arg Gln Asp Gln Leu Arg Ala Leu Thr Thr Val Thr Ala Leu Val Arg290 295 300Lys Phe Leu Gly Pro Val Pro Val Tyr Pro Ala Val Gly Asn His Glu305 310 315 320Ser Thr Pro Val Asn Ser Phe Pro Pro Pro Phe Ile Glu Gly Asn His325 330 335Ser Ser Arg Trp Leu Tyr Glu Ala Met Ala Lys Ala Trp Glu Pro Trp340 345 350Leu Pro Ala Glu Ala Leu Arg Thr Leu Arg Ile Gly Gly Phe Tyr Ala355 360 365Leu Ser Pro Tyr Pro Gly Leu Arg Leu Ile Ser Leu Asn Met Asn Phe370 375 380Cys Ser Arg Glu Asn Phe Trp Leu Leu Ile Asn Ser Thr Asp Pro Ala
385 390 395 400Gly Gln Leu Gln Trp Leu Val Gly Glu Leu Gln Ala Ala Glu Asp Arg405 410 415Gly Asp Lys Val His Ile Ile Gly His Ile Pro Pro Gly His Cys Leu420 425 430Lys Ser Trp Ser Trp Asn Tyr Tyr Arg Ile Val Ala Arg Tyr Glu Asn435 440 445Thr Leu Ala Ala Gln Phe Phe Gly His Thr His Val Asp Glu Phe Glu450 455 460Val Phe Tyr Asp Glu Glu Thr Leu Ser Arg Pro Leu Ala Val Ala Phe465 470 475 480Leu Ala Pro Ser Ala Thr Thr Tyr Ile Gly Leu Asn Pro Gly Tyr Arg485 490 495Val Tyr Gln Ile Asp Gly Asn Tyr Ser Gly Ser Ser His Val Val Leu500 505 510Asp His Glu Thr Tyr Ile Leu Asn Leu Thr Gln Ala Asn Ile Pro Gly515 520 525Ala Ile Pro His Trp Gln Leu Leu Tyr Arg Ala Arg Glu Thr Tyr Gly530 535 540Leu Pro Asn Thr Leu Pro Thr Ala Trp His Asn Leu Val Tyr Arg Met545 550 555 560Arg Gly Asp Met Gln Leu Phe Gln Thr Phe Trp Phe Leu Tyr His Lys565 570 575Gly His Pro Pro Ser Glu Pro Cys Gly Thr Pro Cys Arg Leu Ala Thr580 585 590Leu Cys Ala Gln Leu Ser Ala Arg Ala Asp Ser Pro Ala Leu Cys Arg595 600 605His Leu Met Pro Asp Gly Ser Leu Pro Glu Ala Gln Ser Leu Trp Pro610 615 620
Arg Pro Leu Phe Ser625<210>4<211>5<212>PRT<213>人类(Homo sapiens)<400>4His Pro Leu Ser Pro1 权利要求
1.一种增强人酸性神经磷脂酶(ASM)活性的方法，其包括修饰人ASM的C末端半胱氨酸残基。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述的ASM是rhASM。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述的ASM包括SEQ IDNO1的氨基酸序列。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述的修饰包括删除C末端的半胱氨酸残基。
5.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述的修饰包括使用其它的氨基酸残基取代C末端的半胱氨酸残基。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于，所述的取代是保守取代。
7.根据权利要求5的方法，其特征在于，所述的C末端半胱氨酸残基被丝氨酸残基取代。
8.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述的修饰包括所述的ASM的二聚化。
9.根据权利要求8的方法，其特征在于，所述的ASM二聚体由二硫键交联。
10.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述的修饰包括将一个化合物结合在所述的C末端的半胱氨酸残基上。
11.根据权利要求10的方法，其特征在于，所述的化合物包括硫醇保护集团。
12.根据权利要求11的方法，其特征在于，所述的硫醇保护集团选自硫醚、硫酯或非对称的二硫化合物。
13.根据权利要求10的方法，其特征在于，所述的化合物包括半胱氨酸的修饰物。
14.根据权利要求13的方法，其特征在于，所述的半胱氨酸的修饰物是不可逆修饰物。
15.根据权利要求14的方法，其特征在于，所述的不可逆修饰物是马来酰亚胺。
16.一种增强人ASM的酸性鞘磷脂活性的方法，其包括修饰该ASM分子的C末端半胱氨酸残基，其中修饰选自(a)删除C末端的半胱氨酸残基；(b)使用其它的氨基酸残基取代C末端的半胱氨酸残基；(c)ASM的二聚化；(d)在C末端半胱氨酸残基上结合一个化合物，其中所述的修饰使半胱氨酸残基中的自由硫醇集团的活性丧失，因此增强了所述的ASM的酸性鞘磷脂活性。
17.根据权利要求16的方法，其特征在于，所述的ASM包括rhASM。
18.根据权利要求16的方法，其特征在于，所述的ASM包括SEQID NO1。
19.具有增强的鞘磷脂活性的修饰的ASM，其包括C末端氨基酸残基被删除的人ASM。
20.具有增强的鞘磷脂活性的修饰的ASM，其包括C末端半胱氨酸残基被取代的人ASM。
21.根据权利要求20的修饰的ASM，其特征在于，所述的取代是保守取代。
22.根据权利要求20的修饰的ASM，其特征在于，所述的C末端的半胱氨酸残基被丝氨酸残基取代。
23.具有增强的鞘磷脂活性的修饰的ASM，其包括含有二聚体的人ASM。
24.根据权利要求23的修饰的ASM，其特征在于，所述的ASM二聚体通过二硫键交联。
25.具有增强的鞘磷脂活性的修饰的ASM，其包括一个化合物结合在C末端氨基酸残基上的人ASM。
26.根据权利要求25的修饰的ASM，其特征在于，所述的化合物包括硫醇保护集团。
27.根据权利要求26的修饰的ASM，其特征在于，所述的硫醇保护集团选自硫醚、硫酯或非对称的二硫化合物。
28.根据权利要求25的修饰的ASM，其特征在于，所述的化合物包括半胱氨酸的修饰物。
29.根据权利要求28的修饰的ASM，其特征在于，所述的半胱氨酸的修饰物是不可逆修饰物。
30.根据权利要求29的修饰的ASM，其特征在于，所述的不可逆修饰是马来酰亚胺。
31.提取的编码选自SEO ID NO2或SEO ID NO3的氨基酸的核酸。
32.用于治疗具有ASM相关综合病征的人的方法，其包括给有效剂量的如权利要求19，20，23或25任何之一中的修饰的ASM。
33.根据权利要求32的方法，其特征在于，所述的综合病征是Niemann-Pick疾病。
34.根据权利要求32的方法，其特征在于，所述的综合病征在类脂类组织细胞增多症。
全文摘要
酸性神经磷脂酶(ASM)活性的缺乏导致Niemann－Pick疾病。许多删除ADM的C末端半胱氨酸氨基上的自由硫醇的活性的修饰导致该酶特异活性的显著增强。用于改变该残基活性的方法包括删除或改变该残基的定点突变，除去该残基的对该ASM的酶降解，铜促进的ASM的二聚化(通过末端半胱氨酸残基)和对该残基上的自由硫醇集团的化学修饰。
文档编号C12N15/00GK101027388SQ200480016235
公开日2007年8月29日 申请日期2004年6月10日 优先权日2003年6月12日
发明者S·M·文帕腾, K·P·卡列耶, H·邱 申请人:建新公司