专利名称：哺乳动物培养细胞提取液和其调制方法以及使用了该提取液的无细胞系蛋白质合成方法
技术领域：
本发明涉及一种使用了哺乳动物培养细胞提取液的无细胞系蛋白质合成方法以及上述提取液的调制方法。
背景技术：
近年来，以人基因组为代表，很多生物的遗传信息正在被破解。这其中，作为后基因组研究，注意力被集中在对应这些遗传信息的蛋白质的功能分析或基因组创药。将对应这些遗传信息的蛋白质应用、利用于医药品等中，需要短时间内简单地合成很多种蛋白质。
现在，蛋白质的生产方法中广泛利用的是通过基因重组技术，使用酵母或哺乳动物培养细胞等活细胞的表达系(下面有时称为“细胞系”)。但是，活细胞为了维持自身功能而有排除外来蛋白质的趋势，另外，活细胞如果表达细胞毒蛋白质，则由于细胞不能生育等，而有很多难以表达的蛋白质。
另一方面，作为不使用细胞系的蛋白质的生产方法，已知有如下所述的无细胞系的蛋白质合成系，即，进行向细胞裂解液或提取液中加入基质或酶等过程等，在试管内备齐生物的遗传信息翻译系，使用编码目的蛋白的mRNA，重新构建可以按照希望的顺序使氨基酸结合必要的残基数的合成系。在这样的无细胞系蛋白质合成中，难以受到上述细胞系的蛋白质合成之类的限制，能够不切断生物的生命进行蛋白质的合成，另外，由于在蛋白质的生产中不伴随培养等操作，所以与细胞系相比，能够在短时间内进行蛋白质的合成。进而，在无细胞系蛋白质合成中，由生命体不利用的氨基酸序列构成的蛋白质的大量生产也成为可能，所以被认为是有希望的表达方法。作为提供到这样的无细胞系的蛋白质合成中的细胞裂解液或提取液，探讨使用各种生物来源的提取液，其研究在进展。
作为无细胞系蛋白质合成用提取液，至今已知有很多，但是考虑到翻译后的糖链修饰等，由于可以在保持完全活性的状态下表达人蛋白质，所以希望是与人细胞在生物分类上血缘接近的哺乳动物培养细胞来源的提取液。目前，作为哺乳动物培养细胞来源的无细胞系蛋白质合成用提取液，报道有兔网织红细胞的系(例如，参照非专利文献1Pelham et al.，Eur.J.Biochem.67，247-256(1976))、中国仓鼠卵巢(CHO)系(例如，参照专利文献1特开2000-325076号公报)。
但是，在兔网织红细胞系中，伴随着向兔皮下注射乙酰苯肼溶液，投药4～5天后从兔耳采血，然后伴随所谓调制溶解产物(lysate)的非常繁琐的操作。另外，在CHO系中，是在惰性气体环境中，通过使加压下的CHO减压而使细胞破碎，调制其提取液，但该方法在制作提取液时需要特别的装置或器械。进而，由于提取液调制时的细胞数量或气压、加压时间对无细胞系中的蛋白质合成能力产生很大影响，所以在条件设定中需要繁琐的操作。另外，在通过这样的方法得到的提取液中，能够合成的蛋白质的量极少，是可以仅通过引进已进行放射性标记的氨基酸测量其蛋白质合成活性的程度。
所以，需要开发出调制容易且蛋白质合成量高的哺乳动物培养细胞来源提取液和其调制方法。
发明内容
本发明正是为了解决上述课题的发明，其目的在于，提供调制容易而且比以往蛋白质合成量高的无细胞系蛋白质合成用哺乳动物培养细胞提取液的调制方法和该哺乳动物培养细胞提取液、以及使用了该哺乳动物培养细胞提取液的无细胞系蛋白质合成方法。
本发明人等为了解决上述课题而进行潜心研究，结果已至完成本发明。即，本发明如下所述。
本发明之一是哺乳动物培养细胞提取液的调制方法，其至少包括使悬浮于提取用液中的哺乳动物培养细胞急剧冻结的工序。
本发明之二是在本发明之一的调制方法中，进而还包括在使其急剧冻结之后解冻哺乳动物培养细胞，并离心分离。
本发明之三是在本发明之一或二所述的调制方法中，急剧冻结是通过液氮进行的。
本发明之四是在本发明之二或三所述的调制方法中，已急剧冻结的哺乳动物培养细胞的解冻是在-10℃～20℃的水浴或冰浴中解冻的。
本发明之五是在本发明之一至四所述的任意调制方法中，提取用液是含有蛋白酶抑制剂。
本发明之六是在本发明之一至五所述的任意调制方法中，哺乳动物培养细胞是淋巴瘤来源的培养细胞。
本发明之七是在本发明之一至五所述的任意调制方法中，哺乳动物培养细胞是生殖巢来源的培养细胞。
本发明之八是在本发明之七所述的调制方法中，哺乳动物培养细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)来源的培养细胞。
本发明之九是在本发明之八所述的调制方法中，中国仓鼠卵巢(CHO)是CHO K1-SFM来源。
本发明之十是哺乳动物培养细胞提取液，是采用本发明之一至九所述的任意调制方法调制的。
本发明之十一是无细胞系蛋白质合成方法，使用了本发明之十所述的哺乳动物培养细胞提取液。
本发明之十二是在本发明之十一所述的无细胞系蛋白质合成方法中，在使无细胞系蛋白质合成反应液的组成中除了mRNA以外的反应液进行保温的工序之后，添加外来mRNA，进行合成反应。
本发明之十三是在本发明之十二所述的无细胞系蛋白质合成方法中，保温是在0℃～50℃下进行的。
图1是表示实施例2的实验结果的图表，表示保温工序(在进行合成反应之前，在无细胞系蛋白质合成反应液中含有外来mRNA以外的成分的状态下的一定时间的保温)对合成量有无影响。
图2是表示实施例2的实验结果的图表，表示保温工序的反应液组成和保持时间对合成量的影响。
具体实施例方式
本发明是从哺乳动物培养细胞进行提取来调制哺乳动物培养细胞提取液的方法，其较大的特征在于，至少含有使悬浮于提取用液中的哺乳动物培养细胞急剧冻结的工序。通过利用这样的方法调制哺乳动物培养细胞提取液，来比较在上述专利文献1中记载的以往的方法，可以在更缓和的状态下进行细胞的破碎，可以在不破坏无细胞系蛋白质合成中所必需的成分的情况下取出到细胞外，所以能够在无细胞系中很容易地调制蛋白质的合成量比以往高的哺乳动物培养细胞提取液。进而，通过本发明的方法，也能够防止来自使用器械等的RNase混入等，另外，没有在使用了表面活性剂等的试剂的细胞破碎法的情况下所担心的翻译反应那样的物质进入。
在本发明的调制方法中，需要急剧地冻结在提取用液中悬浮的哺乳动物培养细胞。在本发明的调制方法中，“急剧冻结”是指在10秒以下、优选在2秒以下使哺乳动物培养细胞冻结。这是因为，在没有急剧地使哺乳动物培养细胞冻结的情况下，在蛋白质合成中所必需的成分有可能失活，所以不能达到本发明的上述效果。
作为如上所述使哺乳动物培养细胞急剧冻结的温度，通常为-80℃以下，优选为-150℃以下。这是因为，如果以超过-80℃的温度急剧冻结，蛋白质合成中必需的成分会失活，蛋白质合成能力降低。
上述哺乳动物培养细胞的急剧冻结，例如可以通过使用液氮或液氦等惰性气体等来实现，而优选使用得到容易、成本低的液氮进行。
在本发明的调制方法中，在从哺乳动物培养细胞进行提取时，只要至少包括使悬浮于提取用液中的哺乳动物培养细胞急剧冻结的工序，则对其它工序没有特别限制。例如，可以利用在研钵中使用研棒磨碎的方法、使用杜恩斯匀浆器(dounce homogenizer)的方法、使用玻璃珠的方法等在从大肠杆菌或小麦胚芽等得到无细胞系蛋白质合成用的提取液时一直以来进行的各种方法，破碎哺乳动物培养细胞后进行提取，但哺乳动物培养细胞与从大肠杆菌或小麦胚芽等得到无细胞系蛋白质合成用提取液的情况相比，细胞的破碎更容易，进而在通过仅利用这种冻结、解冻的破碎法得到的提取液中，含有蛋白质合成所必需的成分并保持其活性，出于这一理由，能够得到蛋白质合成能力高的提取液，因而优选在急剧冻结上述哺乳动物培养细胞之后，解冻，离心分离，由此破碎哺乳动物培养细胞。
将上述已急剧冻结的哺乳动物培养细胞解冻之后进行离心分离时，解冻例如可以通过在-10℃～20℃的水浴或冰浴中解冻、在室温(25℃)下放置等实现，因为防止蛋白质合成中必需的成分的失活，确实可靠地防止蛋白质合成能力的降低，所以优选在0℃～20℃(特别是4℃～10℃)的水浴或冰水浴中进行解冻。
已解冻的哺乳动物培养细胞的离心分离，可以在该领域通常进行的条件(10000×g～50000×g、0℃～10℃、10分钟～60分钟)下进行。
作为本发明中使用哺乳动物培养细胞，没有特别限制，例如，可以使用人、大鼠、小鼠、猴等以往公知的适当的哺乳动物来源的培养细胞。
另外，作为本发明中的哺乳动物培养细胞，可以是任何组织来源的细胞，例如，可以没有特别限制地使用血细胞、生殖巢来源细胞、淋巴瘤(lymphoma)来源细胞、其它肿瘤细胞、干细胞等。其中，由于悬浮培养是可能的，所以培养和传代容易，因而优选使用淋巴瘤来源细胞。另外，CHO细胞不只可以悬浮培养，还可以在无血清培养基中培养，培养和传代更加容易。进而，在细胞系中被广泛利用，具有高的蛋白质合成能力，在无细胞系中也可以期待产生相同的效果，所以优选使用CHO细胞。
另外，本发明只不限于单一种类的哺乳动物中的单一的组织来源的哺乳动物培养细胞，可以从单一种类的哺乳动物中的多种组织来源的哺乳动物培养细胞中进行提取，也可以从多种哺乳动物中的单一的组织来源的哺乳动物培养细胞中进行提取，当然也可以从多种哺乳动物中的多种组织来源的哺乳动物培养细胞中进行提取。
对用于本发明的调制方法中的提取用液没有特别限制，但优选至少含有蛋白酶抑制剂。如果使用含有蛋白酶抑制剂的提取用液，哺乳动物培养细胞来源的提取物中含有的蛋白酶的活性被抑制，可以防止该蛋白酶引起的提取物中的活性蛋白的不希望的分解，其结果，可以有效地引导出哺乳动物培养细胞来源的提取物具有的蛋白质合成能力。
作为上述蛋白酶抑制剂，只要可以抑制蛋白酶的活性，就没有特别限制，例如可以使用甲苯磺酰氟(phenylmethane sulphonyl fluorid，下面有时称为“PMSF”)、抑肽酶(aprotinin)、贝他定(bestatin)、亮肽素(leupeptin)、抑胃肽(pepstatin)A、E-64(L-转环氧琥珀酰亮氨酰酰胺-4-胍基丁烷L-trans-epoxysuccinylleucylamido-4-guanidinobutane)、乙二胺四乙酸、磷酸阿米酮等，但由于哺乳动物培养细胞来源的提取液中大多含有丝氨酸蛋白酶，所以优选使用在上述中作为相对于丝氨酸蛋白酶具有高特异性的抑制剂发挥作用的PMSF。另外，不只使用一种蛋白酶抑制剂，也可以使用多种的混合物(蛋白酶抑制剂混合物)。
对在该提取用液中的蛋白酶抑制剂的含量没有特别限制，但从可以很好地发挥本发明的作用所必需的酶类的分解抑制能力的观点出发，优选含有1μM～50mM，更优选含有0.01mM～5mM。这是因为，如果蛋白酶抑制剂不到1μM，有不能充分抑制蛋白酶的分解活性的趋势，另外，如果蛋白酶抑制剂超过50mM，有抑制蛋白质合成反应的趋势。
另外，用于本发明的提取用液，除了上述蛋白酶抑制剂之外，优选至少含有钾盐、镁盐、二硫苏糖醇以及缓冲剂。
作为上述钾盐，只要不是抑制本发明的作用那样的钾盐，就没有特别限制，例如可以以醋酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾、氯化钾、磷酸氢二钾、柠檬酸氢二钾、硫酸钾、磷酸二氢钾、碘化钾、苯二甲酸钾等一样的形态进行使用，其中，优选使用醋酸钾。钾盐作为蛋白质合成反应中的辅助因子发挥作用。
对该提取用液中的钾盐的含量没有特别限制，但从保存稳定性的观点来看，当是例如醋酸钾等一价钾盐时，优选含有10mM～500mM，更优选含有20mM～300mM。这是因为，钾盐如果不到10mM或超过500mM，在蛋白质合成中所必需的成分有变得不稳定的趋势。
作为上述镁盐，只要是不抑制本发明的作用那样的镁盐，就没有特别限制，例如可以以醋酸镁、硫酸镁、氯化镁、柠檬酸镁、磷酸氢镁、碘化镁、乳酸镁、硝酸镁、草酸镁等一般的形态进行使用，其中优选使用醋酸镁。镁盐也可以作为蛋白质合成反应中的辅助因子发挥作用。
对该提取用液中的镁盐的含量没有特别限制，从保存稳定性的观点来看，当是例如醋酸镁等二价盐时，优选含有0.1mM～10mM，更优选含有0.5mM～5mM。这是因为，镁盐如果不到0.1mM或超过10mM，在蛋白质合成中所必需的成分有变得不稳定的趋势。
上述二硫苏糖醇(下面称为DTT)是为了防止氧化而配合的物质，在该提取用液中优选含有0.1mM～10mM，更优选含有0.5mM～5mM。这是因为，DTT如果不到0.1mM或超过10mM，在蛋白质合成中所必需的成分有变得不稳定的趋势。
上述缓冲剂是为了向提取用液赋予缓冲能力、例如为了防止在通过利用提取用液的提取而调制的提取液(＝提取用液+提取物)中，由酸性或碱性物质的添加等引起的pH的急剧变化所导致的提取物的变性而配合的。对这样的缓冲剂没有特别限制，例如可以使用HEPES-KOH、Tris-HCl、醋酸-醋酸钠、柠檬酸-柠檬酸钠、磷酸、硼酸、MES、PIPES等。
缓冲剂优选使用将得到的提取液的pH保持在4～10的缓冲剂，更优选使用pH被保持在6.0～8.5的缓冲剂。这是因为，如果提取液的pH不到4或pH超过10，本发明的反应中所必需的成分可能会变性。从这样的观点出发，在上述中特别优选使用HEPES-KOH(pH6～8.5)对该提取用液中的缓冲剂的含量没有特别限制，从保持适当的缓冲能力的观点出发，优选含有5mM～200mM，更优选含有10mM～100mM。这是因为，缓冲剂如果不到5mM，酸性或碱性物质的添加引起的pH的急剧变动，在使用该缓冲液而调制成的提取液中，有导致提取物变性的趋势，另外还因为，缓冲剂如果超过200mM，盐浓度变得过高，在蛋白质合成中所必需的成分有变得不稳定的趋势。
进而，在提取用液中，为了提高得到的提取液的蛋白质合成能力，优选进一步添加钙盐以及甘油。作为钙盐，只要是不抑制本发明的作用的物质，就没有特别限制，例如可以以氯化钙、醋酸钙、硫酸钙、柠檬酸钙、碘化钙、乳酸钙、硝酸钙、草酸钙等一般的形态进行使用，其中优选使用氯化钙。在这种情况下，对氯化钙的含量没有特别限制，但从可以有效地发挥提高蛋白质合成能力的效果的观点出发，优选含有0.1mM～10mM，更优选含有0.SmM～5mM。另外，对甘油的添加量没有特别限制，从可以有效地发挥提高蛋白质合成能力的效果的观点出发，优选添加成为5(v/v)％～80(v/v)％，更优选添加成为10(v/v)％～50(v/v)％。
在本发明的哺乳动物培养细胞提取液的调制方法中，对从细胞破碎后直至得到无细胞系蛋白质合成用的哺乳动物培养细胞提取液为止的步骤等，没有特别限制。
例如，当使已在提取用液中悬浮的哺乳动物培养细胞急剧地冻结的工序之后，进行解冻、离心分离时，也可以将该离心分离后的上清(上清1)直接作为哺乳动物培养细胞提取液。另外，也可以进一步离心分离上清1，将得到的上清(上清2)作为哺乳动物培养细胞提取液。作为上述上清1的离心分离的条件，可以在与上述相同的条件(10000×g～50000×g、0℃～10℃、10分钟～60分钟)下进行。
还有，如上所述分别进行调制之后，也可以实施凝胶过滤，从凝胶过滤后的滤液分出280nm处的吸光度最高的组分附近，调制成为提取液。但是，从蛋白质的合成效率的观点出发，优选不经过该凝胶过滤和组分的分取调制提取液。
还有，在实施上述凝胶过滤并从凝胶过滤后的滤液分出280nm处的吸光度最高的组分附近时，具体地说可以按照下述步骤进行。
例如，使用PD-10(Amersham Biosciences公司制)，在如下条件下进行即，按照常规方法，在用凝胶过滤用缓冲液对柱进行平衡化之后，提供样品，用上述提取用液洗脱。作为上述凝胶过滤用缓冲液，能够没有特别限制地使用以往公知的适当的组成的缓冲液，例如，可以使用含有10mM～100mM的HEPES-KOH(pH6～8.5)、20mM～300mM的醋酸钾、0.5mM～5mM的醋酸镁、0.5mM～5mM的DTT、0.01mM～5mM的PMSF的凝胶过滤用缓冲液。作为凝胶过滤后得到的滤液，为了利用通常的凝胶过滤进行，可以将0.1mL～1mL作为一个组分，从有效地分出具有高蛋白质合成能力的组分的观点出发，优选将0.4mL～0.6mL作为一个组分接着，从凝胶过滤后的滤液分出280nm处的吸光度为10以上的组分。该处理例如使用Ultrospec3300pro(Amersham Biosciences公司制)等仪器，对各组分测量上述280nm处的吸光度，分出其吸光度最高的组分附近，将其调制成为提取液。
还有，提供到调制方法中的哺乳动物培养细胞，为了避免培养中使用的培养基被带入到翻译反应液中，优选在进行上述急剧的冻结之前，预先用清洗液进行清洗。作为清洗液的组成，可以是组成与上述的提取用液相同的物质。用清洗液的清洗通过向哺乳动物培养细胞中添加清洗液并将其离心分离(例如，700×g、10分钟、4℃的条件)来进行。
从完全冲洗培养基的原因出发，清洗中使用的清洗液的量相对于湿重1g的哺乳动物培养细胞优选5mL～100mL，更优选为10mL～50mL。
清洗次数优选进行1次～5次，更优选进行2次～4次。
另外，对提供到本发明的调制方法中的哺乳动物培养细胞的量没有特别限制，而为了将提取效率保持在最佳，相对于提取用液1mL优选为0.1g～5g，更优选为0.5～2g。
用本发明的方法调制的哺乳动物培养细胞提取液，可以适合地用于无细胞系蛋白质合成。哺乳动物培养细胞提取液优选含有哺乳动物培养细胞来源的提取物且以蛋白质浓度计为1mg/mL～200mg/mL，更优选为10mg/mL～100mg/mL。这是因为，该提取物的含量如果以蛋白质浓度计不到1mg/mL，在本发明的作用中必需的成分的浓度则变低，有可能无法充分地进行合成反应，另外还因为，该提取物的含量如果以蛋白质浓度计超过200mg/mL，则提取液自身具有高粘性，有可能难以操作。
该提取液中的哺乳动物培养细胞来源的提取物的含量，可以利用蛋白质浓度测量来决定。例如使用BCA蛋白质检测试剂盒(BCA Protein assayKit)(PIERCE公司制)，通过测量蛋白质浓度来决定。具体地说，相对反应试剂2mL加入样品0.1mL，37℃下反应30分钟，使用分光光度计(Ultrospec330pro、Amersham Biosciences公司制)，测量562nm处的吸光度。作为对照，通常使用牛血清白蛋白(BSA)，作成检量线。可以通过这样的方法测量。
另外，提取液中含有的提取物是否来源于哺乳动物培养细胞，例如可以通过对提取液中的核糖体RNA的碱基序列进行分析来判断。
本发明的提取液优选含有哺乳动物培养细胞来源的提取物且以蛋白质浓度计为10mg/mL～100mg/mL，同时含有20mM～300mM的醋酸钾、0.5mM～5mM的醋酸镁、0.5mM～5mM的DTT、0.01mM～5mM的PMSF、10mM～100mM的HEPES-KOH(pH6～8.5)，从而得到实现。另外，除了上述之外，优选进一步含有0.5mM～5mM的氯化钙盐和10(v/v)％～50(v/v)％的甘油。
另外，本发明还提供使用上述提取液的无细胞系的蛋白质合成方法。通过使用利用本发明的方法得到的提取液，进行蛋白质合成反应，可以在短时间内合成任何蛋白质，例如在活细胞中为细胞毒的蛋白质。另外，因为使用作为真核生物的哺乳动物培养细胞来源的提取物，所以也可以在无细胞系中合成糖蛋白，没有特别限制，可以合成很多种蛋白质。此外，本发明中的无细胞系蛋白质合成反应是指只通过读取mRNA的信息来合成蛋白质的无细胞翻译系的蛋白质合成系。
对使用利用本发明的方法得到的提取液调制而成的无细胞系蛋白质合成反应液的组成没有特别限制，可以适当选择以往公知的组成，优选调制成含有上述提取液10(v/v)％～80(v/v)％、特别优选30(v/v)％～60(v/v)％。即，在上述反应液整体中，哺乳动物培养细胞来源的提取物的含量，优选调制成以蛋白质浓度计为0.1mg/mL～160mg/mL，更优选为3mg/mL～60mg/mL。这是因为，该提取物的含量如果以蛋白质浓度计不到0.1mg/mL或者超过160mg/mL，目的蛋白质的合成速度有降低的趋势。
在无细胞系蛋白质合成反应液中，作为除了用本发明的方法得到的提取液之外的成分，优选至少含有外来mRNA、钾盐、镁盐、DTT、三磷酸腺苷、三磷酸鸟苷、磷酸肌酸、肌酸激酶、氨基酸成分、RNase抑制剂、tRNA、缓冲剂。通过使用该反应液进行翻译反应，可以在短时间内合成大量的蛋白质。
用于上述反应液的外来mRNA，是指用于调制提取液的非哺乳动物培养细胞来源的mRNA，只要是这种非哺乳动物培养细胞来源的mRNA，对编码的蛋白质(包括肽)没有特别限制，可以编码具有毒性的蛋白质，也可以编码糖蛋白。另外，就反应液中含有的mRNA是外来mRNA，还是来源于用于调制提取液的哺乳动物培养细胞的mRNA这一点，首先从反应液中分离纯化mRNA之后，通过逆转录酶合成cDNA，分析得到的cDNA的碱基序列，与已知的外来mRNA的碱基序列进行比较，由此来判断。
还有，用于反应液中的外来mRNA在其碱基数方面没有特别限制，只要可以合成目的蛋白质，即使mRNA的碱基数不全部相同也可以。另外，如果是在可以合成目的蛋白质的程度下的相同的序列，各mRNA也可以缺失、置换、插入或添加多个碱基。
在本发明中使用的外来mRNA可以是市售的，也可以使用如下得到的mRNA，即将目的蛋白质的ORF(开放读码框，Open reading frame)插入到市售的载体、例如pTNT载体(Promega公司制)的5’-β球蛋白前导(globin leader)序列的下游，使用该序列通过转录反应得到mRNA。另外，也可以使用具有通过在转录反应时加入甲基化的核糖核苷酸等而添加的帽子结构的外来mRNA。
在反应液中，从蛋白质合成的速度的观点出发，外来mRNA优选含有1μg/mL～1000μg/mL，更优选含有10μg/mL～500μg/mL。这是因为，外来mRNA如果不到1μg/mL或超过1000μg/mL，蛋白质合成的速度有降低的趋势。
作为该反应液中的钾盐，作为提取用液的成分，可以优选使用上述的各种钾盐，最好是醋酸钾。从与上述的提取用液中的钾盐的情况相同的观点出发，在该反应液中，钾盐优选含有10mM～500mM，更优选含有20mM～300mM。
作为该反应液中的镁盐，作为提取用液的成分，可以优选使用上述的各种镁盐，最好是醋酸镁。从与上述的提取液中的镁盐的情况相同的观点出发，在该反应液中，镁盐优选含有0.1mM～10mM，更优选含有0.5mM～5mM。
从与上述的提取用液中的DTT的情况相同的观点出发，该反应液中的DTT优选含有0.1mM～10mM，更优选含有0.5mM～5mm。
从蛋白质合成的速度的观点出发，该反应液中的三磷酸腺苷(下面有时称为“ATP”)在该反应液中优选含有0.01mM～10mM，更优选含有0.1mM～5mM。这是因为，ATP如果不到0.01mM或超过10mM，蛋白质合成的速度有降低的趋势。
从蛋白质合成的速度的观点出发，该反应液中的三磷酸鸟苷(下面有时称为“GTP”)在该反应液中优选含有0.01mM～10mM，更优选含有0.05mM～5mM。这是因为，GTP如果不到0.01mM或超过10mM，蛋白质合成的速度有降低的趋势。
该反应液中的磷酸肌酸是用于持续合成蛋白质的成分，配合目的是再生ATP和GTP。从蛋白质合成的速度的观点出发，磷酸肌酸在该反应液中优选含有1mM～200mM，更优选含有10mM～100mM。这是因为，磷酸肌酸如果不到1mM，则难以再生充分量的ATP和GTP，其结果是蛋白质的合成速度有降低的趋势，另外，磷酸肌酸如果超过200mM，则成为抑制物质，蛋白质的合成速度有降低的趋势。
该反应液中的肌酸激酶是用于持续合成蛋白质的成分，配合目的是连同磷酸肌酸一起再生ATP和GTP。从蛋白质合成的速度的观点出发，肌酸激酶在该反应液中优选含有1μg/mL～1000μg/mL，更优选含有10μg/mL～500μg/mL。这是因为，肌酸激酶如果不到1μg/mL，则难以再生充分量的ATP和GTP，其结果是蛋白质的合成速度有降低的趋势，另外，肌酸激酶如果超过1000μg/mL，则成为抑制物质，蛋白质的合成速度有降低的趋势。
该反应液中的氨基酸成分至少含有20种氨基酸，即缬氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、色氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、胱氨酸、精氨酸的20种氨基酸。该氨基酸中也含有放射性同元素标记的氨基酸。进而，根据需要，也可以含有修饰氨基酸。该氨基酸成分通常以大致等量含有各种氨基酸而成。
在本发明中，从蛋白质合成的速度的观点出发，该反应液中优选含有上述的氨基酸成分1μM～1000μM，更优选含有10μM～200μM。这是因为，氨基酸成分如果不到1μM或超过1000μM，蛋白质的合成速度有降低的趋势。
该反应液中配合RNase抑制剂的目的在于，防止通过提取液中混在的哺乳动物培养细胞来源的RNase，在本发明的无细胞系蛋白质合成时使外来mRNA或tRNA被不希望地消化而妨碍蛋白质的合成，在该反应液中，优选含有0.1U/μL～100U/μL，更优选含有0.5U/μL～10U/μL。如果RNase抑制剂不到0.1U/μL时，有无法充分抑制RNase的分解活性的趋势，另外，如果RNase抑制剂超过100U/μL，有抑制蛋白质合成反应的趋势。
该反应液中的tRNA各大致等量地含有对应上述20种氨基酸的种类的tRNA而成。在本发明中，从蛋白质合成的速度的观点出发，在该反应液中，优选含有1μg/mL～1000μg/mL，更优选含有10μg/mL～500μg/mL。这是因为，如果tRNA不到1μg/mL或超过1000μg/mL，蛋白质的合成速度有降低的趋势。
作为反应液中含有的缓冲剂，可以适合使用与上述的本发明的提取液相同的缓冲剂，从相同的理由出发，优选使用HEPES-KOH(pH6～8.5)。另外，从与上述的提取液中的缓冲剂的情况相同的观点出发，缓冲剂优选含有5mM～200mM，更优选含有10mM～100mM。
进而，为了提高翻译反应速度，在反应液中优选进一步添加亚精胺(spermidine)。在反应液中，亚精胺优选含有0.01mM～10mM，更优选含有0.05mM～5mM。这是因为，如果亚精胺不到0.01mM，有可能不具有充分的翻译促进能力，另外，如果亚精胺超过10mM，有抑制蛋白质合成反应的趋势。
进而，优选在反应液中进一步添加钙盐。作为钙盐，可以优选使用上述的各种钙盐作为提取用液的成分，最好是氯化钙。从与上述的提取用液中的钙盐的情况相同的观点出发，在该反应液中，钙盐优选含有0.05mM～10mM，更优选含有0.1mM～5mM。
即，作为使用了用本发明的方法得到的提取液的反应液，优选含有该提取液为30(v/v)％～60(v/v)％，同时含有20mM～300mM的醋酸钾、0.5mM～5mM的醋酸镁、0.5mM～5mM的DTT、0.1mM～5mM的ATP、0.05mM～5mM的GTP、10mM～100mM的磷酸肌酸、10μg/mL～500μg/mL的肌酸激酶、10μM～200μM的氨基酸成分、0.5U/μL～10U/μL的RNase抑制剂、10μg/mL～500μg/mL的tRNA、10μg/mL～500μg/mL的外来mRNA、10mM～100mM的HEPES-KOH(pH6～8.5)，从而得到实现。另外，除了上述之外，更优选进一步含有0.05mM～5mM的亚精胺、0.1mM～5mM的氯化钙而得到实现。
使用了上述反应液的无细胞系蛋白质合成反应，在以往公知的例如低温恒温槽中进行。反应温度通常为10℃～40℃、优选为20℃～30℃的范围内。这是因为，如果反应温度不到10℃，蛋白质的合成速度有降低的趋势，另外如果反应温度超过40℃，必需成分有变性的趋势。反应时间通常为1小时～72小时，优选为3小时～24小时。
另外，在进行反应之前，在向提取液中加入mRNA以外的反应液组成的成分的状态下，优选进行一定时间的保温。保温在以往公知的例如低温恒温槽中进行。保温温度通常为0℃～50℃、优选为15℃～37℃的范围。这是因为，如果保温温度不到0℃，难以得到保温的效果，另外如果保温温度超过50℃，必需成分有变性的趋势。保温时间通常为1分钟～120分钟，优选为10分钟～60分钟。
对可以使用上述反应液进行合成的蛋白质没有特别限制。已合成的蛋白质的量可以通过酶的活性的测量、SDS-PAGE、免疫检测法等进行测量。
对利用本发明的无细胞系蛋白质合成方法合成的蛋白质没有特别限制。
实施例下面，利用实施例对本发明进行具体的说明，但本发明不被这些实施例所限定。
参考例1哺乳动物培养细胞(淋巴瘤来源)的培养在37℃、5％的CO2环境下，在已加入含有10％牛胎儿血清(Invitrogen公司制)的RPMI1640培养基(Invitrogen公司制)的培养烧瓶(2100cm2)内，培养细胞数2.1×106个的哺乳动物培养细胞L5178Y-S(由东北大学加龄医学研究所附属医用细胞资源中心分让)79小时。结果细胞数变为4.2×108个、湿重变为0.57g。
实施例1哺乳动物培养细胞(淋巴瘤来源)提取液的调制首先，通过离心分离(700×g，10分钟)收集在上述参考例1中培养的动物培养细胞，用下述组成的清洗液清洗3次(在700×g、10分钟的条件下离心分离)。
·50mM HEPES-KOH(pH7.4)·100mM 醋酸钾·2mM 醋酸镁·1mM DTT然后，在向上述组成的清洗液中添加0.57mL的0.5Mm PMSF和20％甘油而调制成的提取用液(冷却至4℃)中，悬浮。
在液氮中急剧(2秒)冻结该悬浮液。充分冻结后，在约10℃的水浴中解冻。完全解冻后，在4℃、30000×g下进行10分钟离心分离(himacCR20B3、日立工机公司制)，除去残渣，回收上清。将得到的上清进一步离心分离(4℃、30000×g、30分钟)，回收上清，将回收的上清作为哺乳动物培养细胞提取液。
参考例2外来mRNA的制作(1)载体DNA的构建将pFEM-luc载体(Promega公司制)5ng作为模板，使用具有序列表序列号1所示的碱基序列的引物(Luc T7-F3-Kpn)、具有序列表序列号2所示的碱基序列的引物(Luc T7-R4-Kpn)、和KOD plus(东洋纺织公司制)，进行97℃15秒、55℃30秒、68℃120秒、30个循环的PCR。通过乙醇沉淀纯化DNA片断之后，用Kpn I消化。另外，还用Kpn I消化消化pTNT载体(Promega公司制)。用琼脂糖凝胶电泳分离这些反应液之后，使用Gen洗脱凝胶纯化试剂盒(Gen Elute Gel Purification Kit)(Sigma公司制)，纯化DNA片断。使用Ligation High(东洋纺织公司制)连接这些DNA片断之后，转化大肠杆菌DH5α。使用碱-SDS法，从已转化的大肠杆菌调制质粒DNA，使用具有序列表序列号3所示的碱基序列的引物(T7启动子)和大染料终止子循环测序法(Big Dye TerminatorCycle Sequencing)FS(Applied biosystems公司制)，对上述质粒进行测序反应(96℃10秒、50℃5秒、60℃4分钟、30个循环)。将该反应液提供到ABI PRISM 310遗传分析器(Genetic Analyzer)(Applied biosystems公司制)，进行碱基序列分析。将荧光素酶基因的起始密码子被插入到pTNT载体来源的5’-β球蛋白前导序列的下游的质粒命名为pTNT-Luc。
(2)体外转录反应用BamH I消化在上述(1)中制作的pTNT-Luc之后，通过苯酚-氯仿抽提、乙醇沉淀进行纯化。将得到的DNA片断1μg作为模板，使用RiboMax大规模RNA生产系统(RiboMax Large Scale RNA ProductionSystem)-T7(Promega公司制)，以20μl的体系(scale)在37℃下4小时合成mRNA。
(3)mRNA的纯化在上述转录反应后的反应液20μL中，添加1U的RQ1 RNase FreeDNase(Promega公司制)，37℃孵育15分钟，消化模板DNA。通过苯酚-氯仿抽提除去蛋白质之后，添加醋酸钾并使终浓度为0.3M，进行乙醇沉淀。将得到的沉淀溶解于100μL的无菌水，加入到Nick column(Amersham Biosciences公司制)中。用400μL的无菌水洗脱。回收洗脱组分，添加醋酸钾并使终浓度为0.3M，进行乙醇沉淀。已合成的mRNA的定量通过测量260nm的吸光度来进行。
实验例1使用哺乳动物培养细胞(淋巴瘤来源)提取液的无细胞系蛋白质合成使用在实施例1中调制的哺乳动物培养细胞提取液以及在参考例2中合成的外来mRNA，调制下述组成的反应液，进行在无细胞系中的蛋白质合成。
·50(v/v)％ 哺乳动物培养细胞提取液·25mM HEPES-KOH(pH7.4)·150mM 醋酸钾·1mM醋酸镁·1mMDTT·0.5mM ATP·0.1mM GTP·20mM 磷酸肌酸·200μg/mL 肌酸激酶·0.25mM 亚精胺·40μM 氨基酸(20种)
·1U/μL RNase抑制剂(人胎盘来源)·200μg/mL tRNA(酵母来源)·240μg/mL 外来mRNA·10(v/v)％ 甘油分别使用ATP(Sigma公司制)、GTP(Sigma公司制)、氨基酸(20种)(Sigma公司制)、RNase抑制剂(宝酒造公司制)、tRNA(RocheDiagnostics公司制)。作为反应装置，使用低温铝封闭(aluminum block)恒温槽MG-1000。反应液量为25μL，反应温度为20℃，在每个反应时间进行取样，测量合成的荧光素酶。已合成的荧光素酶使用荧光素酶检测试剂盒(E-1500、Promega公司制)进行定量。在荧光素酶检测试剂50μL中添加2.5μL反应液，使用照度计(Tuner Designs TD-20/20、Promega公司制)，测量荧光素酶的发光。
结果，在反应开始一个小时，成功地合成了约0.5μg/mL的无细胞系蛋白质。
比较例1使用与实施例1相同的清洗液，清洗与参考例1同样培养的哺乳动物培养细胞L5178L-S之后，在与实施例1同样的冷却至4℃的提取用液中悬浮。之后，剧烈搅拌5分钟，进行提取，除此以外，以与实施例1相同的操作进行。无细胞系蛋白质合成反应使用在参考例2中制作的mRNA，以与实验例1相同的反应液组成进行。
结果，荧光素酶为10ng/mL，为实验例1的约50分之1左右。
参考例3哺乳动物培养细胞(CHO)的培养在130rpm、37℃、5％CO2环境下，在已加入CHO无血清培养基(SERUM-FREE MEDIUM)(SIGMA公司制)200mL的三角烧瓶(500mL)内，培养细胞浓度4.9×105个细胞/mL的中国仓鼠卵巢细胞CHO K1-SFM(东北大学加龄医学研究所附属医用细胞资源中心分让)120小时。结果细胞浓度变为8.8×106个细胞/nL、湿重变为3.2g。
实施例2哺乳动物培养细胞(CHO)提取液的调制首先，通过离心分离(700×g，10分钟)收集在上述参考例3中培养的动物培养细胞，用下述组成的清洗用缓冲液清洗3次(在700×g、10分钟条件下离心分离)。
·40mM HEPES-KOH(pH7.9)·100mM 醋酸钾·2mM 醋酸镁·2mM 氯化钙·1mM DTT然后，测量重量，每1g细胞中添加0.8mL的下述组成的提取用缓冲液，悬浮细胞。
·40mM HEPES-KOH(pH7.9)·100mM 醋酸钾·2mM 醋酸镁·2mM 氯化钙·20(v/v)％ 甘油·1mM DTT在液氮中急剧冻结该细胞悬浮液。充分冻结后，在约4C的冰浴中解冻。完全解冻后，在4℃、30000×g下离心分离10分钟(himacCR20B3、日立工机公司制)，除去细胞残渣，回收上清S1。将得到的上清S1进一步离心分离(4℃、30000×g、30分钟)，然后回收上清S2。在已用下述组成的脱盐用缓冲液平衡化的PD-10(Amersham公司制)中，加该上清S2。加入后，用脱盐用缓冲液洗脱，使用分光光度计(Ultrospec3300pro、Amersham Biosciences公司制)，回收280nm处的吸光度为30以上的组分，作为哺乳动物培养细胞(CHO)提取液。
·40mM HEPES-KOH(pH7.9)·100mM 醋酸钾·2mM 醋酸镁·1mM DTT实验例2使用哺乳动物培养细胞(CHO)提取液的无细胞系蛋白质合成在实施例2中调制的哺乳动物培养细胞(CHO)提取液，首先与下述组成中反应液组成当中外来mRNA以外的成分混合，在25℃下保温30分钟。然后，添加在参考例2中合成的外来mRNA，进行在无细胞系中的蛋白质合成。
·50％[v/v] 哺乳动物培养细胞提取液·50mM HEPES-KOH(pH7.9)·175mM 醋酸钾·1mM醋酸镁·0.5mM 氯化钙·2mMDTT·0.5mM ATP·0.25mM GTP·30mM 磷酸肌酸·200μg/mL 肌酸激酶·80μM 氨基酸(20种)·160μg/mL mRNA(编码荧光素酶基因)分别使用ATP(Sigma公司制)、GTP(Sigma公司制)、氨基酸(20种)(Sigma公司制)。作为反应装置，使用低温铝封闭恒温槽MG-1000。反应液量为25μL，反应温度为20℃，在每个反应时间进行取样，测量合成的荧光素酶。已合成的荧光素酶使用荧光素酶检测试剂盒(E-1500、Promega公司制)进行定量。在荧光素酶检测试剂50μL中添加2.5μL反应液，使用照度计(Tuner Designs TD-20/20、Promega公司制)，测量荧光素酶的发光。结果，在反应开始2小时后的蛋白质合成量为约27μg/mL(图1■)，与没有进行蛋白质合成之前的保温(25℃、30分钟)的情况(图1□)相比显著提高。
从以上说明可知，利用本发明，调制容易，而且能够提供比以往蛋白质合成量高的无细胞系蛋白质合成用哺乳动物培养细胞提取液的调制方法、和该哺乳动物培养细胞提取液以及使用该哺乳动物培养细胞的无细胞系蛋白质合成方法。
此外，在序列表free text中(人工序列的记载(Description of ArtificialSequence))中，序列号1为引物Luc T7-F3-Kpn，序列号2为引物LucT7-R4-Kpn，序列号3为引物T7启动子。
序列表<110>株式会社岛津制作所<120>哺乳动物培养细胞提取液和其调制方法，以及使用了该提取液的蛋白质合成方法<130>G104052 WO<150>JP 2003-165390<151>2002-6-10<160>3<210>1<211>7<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Luc T7-F3-Kpn<400>1ggggtaccat ggaagacgcc aaaaacataa 30<210>2
<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Luc T7-R4-Kpn<400>2ggggtacctt acaatttgga ctttccgcc29<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>T7启动子<400>3taatacgact cactataggc 20
权利要求
1.一种哺乳动物培养细胞提取液的调制方法，至少包括使悬浮于提取用液中的哺乳动物培养细胞急剧冻结的工序。
2.根据权利要求1所述的调制方法，其中，进而包括在急剧冻结之后解冻哺乳动物培养细胞、并进行离心分离的工序。
3.根据权利要求1或者2所述的调制方法，其中，急剧冻结是通过液氮进行的。
4.根据权利要求2或者3所述的调制方法，其中，已急剧冻结的哺乳动物培养细胞的解冻是在-10℃～20℃水浴或冰浴中解冻的。
5.根据权利要求1～4中任意一项所述的调制方法，其中，提取用液含有蛋白酶抑制剂。
6.根据权利要求1～5中任意一项所述的调制方法，其中，哺乳动物培养细胞是淋巴瘤来源的培养细胞。
7.根据权利要求1～5中任意一项所述的调制方法，其中，哺乳动物培养细胞是生殖巢来源的培养细胞。
8.根据权利要求7所述的调制方法，其中，哺乳动物培养细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)来源的培养细胞。
9.根据权利要求8所述的调制方法，其中，中国仓鼠卵巢(CHO)来源于CHO K1-SFM来源。
10.一种哺乳动物培养细胞提取液，是利用权利要求1～9中任意一项所述的方法调制的。
11.一种无细胞系蛋白质合成方法，使用了权利要求10所述的哺乳动物培养细胞提取液。
12.根据权利要求11所述的无细胞系蛋白质合成方法，其中，在无细胞系蛋白质合成反应液的组成当中，在对除了外来mRNA以外的反应液进行保温的工序之后，添加外来mRNA，进行合成反应。
13.根据权利要求12所述的无细胞系蛋白质合成方法，其中，保温是在0℃～50℃下进行。
全文摘要
本发明提供一种至少包括使在提取用液中悬浮的哺乳动物培养细胞急剧冻结的工序的哺乳动物细胞提取液的调制方法、和用该方法调制的哺乳动物培养细胞提取液、以及使用了该提取液的无细胞系蛋白质合成方法。优选该无细胞系蛋白质合成方法包括在进行合成反应之前无细胞系蛋白质合成反应液中含有外来mRNA以外的成分的状态下的一定时间的保温工序。
文档编号C12N15/09GK1806040SQ200480016278
公开日2006年7月19日 申请日期2004年6月9日 优先权日2003年6月10日
发明者铃木崇, 江连彻, 伊东昌章, 东出将贤, 远藤幸善 申请人:株式会社岛津制作所