专利名称：新型腈水合酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过从自然界新分离出的微生物的新型腈水合酶的酶催化作用由腈化合物制造酰胺化合物的技术。
背景技术：
在对腈化合物的腈基进行水合后转变为酰胺基，制造对应的酰胺化合物的技术中，除了以往通过铜催化的化学方法之外，使用微生物的酶作为催化剂的方法正成为主流。这样的酶一般称为腈水合酶(Nitrile hydratase)，从首次报道以来，又从各种各样的微生物发现了很多酶。例如，来自节杆菌(Arthrobacter)属(Agricultural andBiological Chemistry Vol.44p.2251-2252，1980)、农杆菌(Agrobacterium)属(特开平05-103681)、不动杆菌(Acinetobacter)属(特开昭61-282089)、气单胞菌(Aeromonas)属(特开平05-030983)、肠杆菌(Enterobacter)属(特开平05-236975)、欧文氏菌(Erwinia)属(特开平05-161496)、黄色杆菌(Xanthobacter)属(特开平05-161495)、克雷伯氏菌(Klebsiella)属(特开平05-030982)、棒杆菌(Corynebacterium)属(特开昭54-129190、后来判明为红球菌属)、假单胞菌(Pseudomonas)属(特开昭58-86093)、柠檬酸杆菌(Citrobacter)属(特开平05-030984)、链霉菌(Streptomyces)属(特开平05-236976)、芽孢杆菌(Bacillus)属(特开昭51-86186、特开平7-255494)、镰刀霉菌属(特开平01-086889)、红球菌属(Rhodococcus)(特开昭63-137688、特开平02-227069、特开2002-369697、特开平2-470)、根瘤菌属(Rhizobium)(特开平05-236977)、假诺卡氏菌菌属(Pseudonocardia)(特开平8-56684)等细菌的酶。这些酶由于它们的氨基酸序列的多样性，所以它们的理化性质也是多样的，一直根据各种目的在进行研究。在理化性质中，作为对有关热、或对酰胺化合物和腈化合物等的稳定性正在进行阐明的例子，如有关紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)J1株的文献(European Journal of Biochemistry Vol.196p.581-589，1991.Applied and Microbiology Biotechnology Vol.40p.189-195，1993.)、有关嗜热假诺卡氏菌(Pseudonocardiathermophila)JCM3095株的文献(特开平8-187092、Journal ofFermentation and Bioengineering Vol.83p.474-477，1997)、有关芽孢杆菌(Bacillus)属BR449株的文献(WO 99/55719.AppliedBiochemistry and Biotechnology Vol.77-79P.671-679，1999.)、有关芽孢杆菌(Bacillus)属RAPC8株的文献(Enzyme and MicrobialTechnology Vol.26 p.368-373，2000.Extremophiles Vol.2p.347-357，1998)、有关苍白芽孢杆菌(Bacillus palidus)DAC521株的文献(Biochimica et Biophysica Acta Vol.1431 p.249-260，1999)、有关史氏芽孢杆菌(Bacillus Smithii)SC-J05-1株的文献(Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology Vol.20220-226，1998)。
另外，在使用这些独特的腈水合酶由腈化合物工业化制造酰胺化合物时，在酰胺化合物的制造成本中制造该酶所占的成本是个重要的问题，希望使用业已在工业水平上确立培养法的宿主进行生产。因此，以通过基因工程手段使腈水合酶大量表达为目的，进行着尝试基因克隆的研究。例如、假单胞菌属(特开平3-251184)、红球菌属(特开平2-119778、特开平4-211379、特开平09-00973、特开平07-099980、特开2001-069978)、根瘤菌属(特开平6-25296)、克雷伯氏菌属(特开平6-303971)、无色杆菌属(特开平08-266277)、假诺卡氏菌属(特开平9-275978)、芽孢杆菌属(特开平09-248188)等。
发明内容
期望得到具有能保持热稳定性以及即使在底物腈化合物或生成物酰胺化合物的高浓度存在下也保持高活性这种理化性质的腈水合酶，虽然有这方面的文献报道，但有时由于在反应中使用的酶的实施方式、腈化合物的种类不同，那些理化性质和活性的绝对值都会变动，尚未发现兼备全部特性的酶。另外，作为今后使用进化工程等改良理化性质的题材，有望开发前所未有的多种酶。
在利用进化工程改良理化性质时，需要克隆和表达基因是不言而喻的，从与上述酰胺化合物制造中酶的生产有关的成本制约考虑，希望使用培养法已确立的宿主制作基因重组菌。
即本发明的目的在于提供从自然界分离对热或高浓度化合物稳定性高的腈水合酶，该酶的生产方法以及使用该酶由腈化合物制造对应的酰胺化合物的制造方法。还提供该酶的氨基酸序列以及基因序列，含有该基因的重组质粒、含有该重组质粒的转化菌株、使用该转化菌株的该酶的生产方法和使用该转化菌株由腈化合物制造对应的酰胺化合物的制造方法。另外也提供具有使该重组体的腈水合酶进一步活化的作用的蛋白质的氨基酸序列以及基因序列。
本发明人为解决上述课题进行了专心研究，结果从琦玉县温泉附近的土壤中发现了具有腈水合酶活性的微生物-嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)。而到目前为止尚不知土壤芽孢杆菌属的微生物具有腈水合酶、能表现出腈水合酶活性，而且本微生物在培养中通常用的65℃这一温度已超过了以往的具有腈水合酶的嗜热菌的通常培养温度(45℃～60℃)。
由该微生物纯化腈水合酶，该腈水合酶活性表现出兼备对热和高浓度的腈化合物以及酰胺化合物的高稳定性。另外以纯化后的酶的各亚基N末端的氨基酸序列为基础，由该微生物的染色体DNA分离腈水合酶基因，根据该氨基酸序列和基因序列初步阐明的结果，可判断其与已有的腈水合酶的同源性非常低。另外通过同时表达处于该基因下游的推定为活化蛋白质的基因序列，成功地得到可大量表达该酶的基因的重组菌株，至此完成本发明。
即本发明提供以下内容(1)一种DNA，其特征为所编码的蛋白质具有如下理化性质(a)具有腈水合酶活性。
(b)底物特异性以丙烯腈、己二腈、乙腈、异丁腈、n-戊腈、n-丁腈、苄腈、己腈作为底物，表现出活性。
(c)分子量作为至少由以下2种亚基构成的蛋白质，各亚基经还原型SDS-聚丙烯酰胺电泳确定的分子量如下亚基α分子量25000±2000亚基β分子量28000±2000(d)热稳定性当将水溶液中的酶于70℃温度下加热30分钟后，残存活性为加热前活性的35％以上。
(e)即使用6重量％的丙烯腈作为底物，与6重量％以下底物浓度时相比，其活性也没有减少。
(f)即使在35重量％的丙烯酰胺水溶液中，仍具有以丙烯腈作为底物的活性。
(2)下述(A)或(B)中任一种DNA。
(A)一种DNA，其特征为由编码含有序列号1所示氨基酸序列的α亚基基因和编码含有序列号2所示氨基酸序列的β亚基基因碱基序列的组合所构成。
(B)一种DNA，所编码的蛋白质为在序列号1所示氨基酸序列的α亚基和含有序列号2所示氨基酸序列的β亚基的任一个、或两个中各自对1或多个氨基酸进行的置换、缺失、添加、翻译后修饰，含有序列改变、或没有改变的α亚基和改变、或没有改变的β亚基，而且具有腈水合酶活性。
(3)下述(C)或(D)中的任一个DNA。
(C)一种DNA，其特征为由含有具有序列号3的695-1312位序列的DNA和具有序列号3的1-681位序列的DNA的组合所构成。
(D)编码含有下述两亚基的、并且具有腈水合酶活性的蛋白质的DNA其中，一亚基为包含序列号3的695-1312位序列的DNA、或与该DNA在严格条件下进行杂交的DNA中任一个DNA所编码的α亚基，另一亚基为包含序列号3的1-681位序列DNA、或与该DNA在严格条件下，进行杂交的DNA中的任一个DNA所编码的β亚基。不过上述(C)的情况除外。
(4)(1)～(3)中任一项所述的DNA，其特征是再组合含有编码序列号4所示氨基酸序列的碱基序列的DNA，或编码特征为对该氨基酸序列中1或多个氨基酸进行置换、缺失、添加、翻译后修饰、且编码的是与腈水合酶的活化有关的蛋白质的DNA中的任一个DNA。
(5)(1)～(3)中任一项所述的DNA，其特征是再组合含有序列号3的1325-1663位序列的DNA、或编码特征为可与该DNA在严格的条件下进行杂交、且编码的是与腈水合酶活化有关的蛋白质的DNA中的任一个DNA。
(6)含有编码序列号1所示氨基酸序列的腈水合酶的α亚基基因的DNA。
(7)含有编码序列号2所示氨基酸序列的腈水合酶的β亚基基因的DNA。
(8)含有特征为编码与序列号4所示氨基酸序列的腈水合酶的活化有关的基因的DNA。
(9)(1)～(8)任一项所述的DNA，其中，该DNA来自于土壤芽孢杆菌(Geobacillus)属。
(10)(1)～(8)任一项所述的DNA，其中，该DNA来自于嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)种。
(11)(1)～(8)任一项所述的DNA，其中，该DNA来自于嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)Q-6株(FERM BP-08658)。
(12)整合有(1)～(11)任一项所述的DNA的重组载体。
(13)用(1)～(11)任一项所述DNA转化的微生物、或嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)Q-6株(FERM BP-08658)以及其变异体中的任一种微生物。
(14)以对用(1)～(11)任一项所述的DNA转化的微生物在培养基中进行培养为特征的该蛋白质、或含有该蛋白质的菌体处理物的制造方法。
(15)一种蛋白质、或含有该蛋白质的菌体处理物的制造方法，其特征为在培养基中培养属于土壤芽孢杆菌属的微生物，且该微生物能够生产具有下述理化性质的蛋白质的微生物，所说的理化性质包括(a)具有腈水合酶活性。
(b)底物特异性以丙烯腈、己二腈、乙腈、异丁腈、n-戊腈、n-丁腈、苄腈、己腈作为底物表现出活性。
(c)分子量作为至少由以下2种亚基构成的蛋白质，各亚基经还原型SDS-聚丙烯酰胺电泳确定的分子量如下亚基α分子量25000±2000亚基β分子量28000±2000(d)热稳定性当将水溶液中的酶于70℃温度下加热30分钟后，残存活性为加热前活性的35％以上。
(e)即使用6重量％的丙烯腈作为底物，与6重量％以下底物浓度时相比，其活性也没有减少。
(f)即使在35重量％的丙烯酰胺水溶液中，仍具有以丙烯腈作为底物的活性。
(16)从通过(14)或(15)所述的任一种制造方法培养的微生物获得的该蛋白质、或含有该蛋白质的菌体处理物。
(17)特征为具有如下理化性质的蛋白质。
(a)具有腈水合酶活性。
(b)底物特异性以丙烯腈、己二腈、乙腈、异丁腈、n-戊腈、n-丁腈、苄腈、己腈作为底物表现出活性。
(c)分子量作为至少由以下2种亚基构成的蛋白质，各亚基经还原型SDS-聚丙烯酰胺电泳确定的分子量如下
亚基α分子量25000±2000亚基β分子量28000±2000(d)热稳定性当将水溶液中的酶于70℃温度下加热30分钟后，残存活性为加热前活性的35％以上。
(e)即使用6重量％的丙烯腈作为底物，与6重量％以下底物浓度时相比，活性也没有减少。
(f)即使在35重量％的丙烯酰胺水溶液中，仍具有以丙烯腈作为底物的活性。
(18)下述(A)或(B)中任一种蛋白质。
(a)特征为含有α亚基和β亚基的蛋白质，其中α亚基含有序列号1所示氨基酸序列，β亚基含有序列号2所示氨基酸序列。
(b)含有在含有序列号1所示氨基酸序列的α亚基和含有序列号2所示氨基酸序列的β亚基的任一个、或两个各自对1或多个氨基酸进行置换、缺失、添加、翻译后修饰，含有序列改变、或没有被改变的α亚基和改变的、或没有被改变的β亚基，而且具有腈水合酶活性的蛋白质。
(19)下述(C)或(D)中的任一种蛋白质。
(c)特征为含有α亚基和β亚基的蛋白质，其中，α亚基是由具有序列号的3695-1312位序列的DNA编码的，β亚基是由具有序列号的31-681位序列的DNA编码的。
(d)特征为含有α亚基和β亚基且具有腈水合酶活性的蛋白质，其中α亚基是由具有序列号3的695-1312位序列的DNA编码的，或在严格条件下与该DNA进行杂交的DNA中的任一个DNA所编码的；而β亚基是由具有序列号3的1-681位序列的DNA，或在严格的条件下与该DNA进行杂交的DNA中的任一个DNA编码的。不过上述(C)的情况除外。
(20)具有如下特征的蛋白质至少含有包含α亚基的多肽或翻译后修饰的多肽中的任一种和包含β亚基的多肽或翻译后修饰的多肽中的任一种，或含有两者，其中，α亚基为序列号1所示氨基酸序列，β亚基是序列表中的序列编号2所示氨基酸序列。
(21)酰胺化合物的制造方法，其特征是将具有如下理化性质的蛋白质、或含有该蛋白质的菌体处理物作用于腈化合物，获得由该腈化合物衍生的酰胺化合物。
(a)具有腈水合酶活性。
(b)底物特异性以丙烯腈、己二腈、乙腈、异丁腈、n-戊腈、n-丁腈、苄腈、己腈作为底物表现出活性。
(c)分子量作为至少由以下2种亚基构成的蛋白质，各亚基经还原型SDS-聚丙烯酰胺电泳确定的分子量如下亚基α分子量25000±2000亚基β分子量28000±2000(d)热稳定性当将水溶液中的酶于70℃温度下加热30分钟后，残余活性为加热前的35％以上。
(e)即使用6重量％的丙烯腈作为底物，与6重量％以下底物浓度时相比，活性也没有减少。
(f)即使在35重量％的丙烯酰胺水溶液中，仍具有以丙烯腈作为底物的活性。
(22)酰胺化合物的制造方法，其特征是在培养基中培养用权利要求1～11中任一项所述的DNA转化的微生物、或属于土壤芽孢杆菌属的可生产具有下述理化性质的蛋白质的微生物中的任一种，由此得到的蛋白质、或含有该蛋白质的菌体处理物。
(a)具有腈水合酶活性。
(b)底物特异性以丙烯腈、己二腈、乙腈、异丁腈、n-戊腈、n-丁腈、苄腈、己腈作为底物表现出活性。
(c)分子量作为至少由以下2种亚基构成的蛋白质，各亚基经还原型SDS-聚丙烯酰胺电泳确定的分子量如下亚基α分子量25000±2000亚基β分子量28000±2000(d)热稳定性当将水溶液中酶于70℃温度下加热30分钟后，残余活性为加热前的35％以上。
(e)即使用6重量％的丙烯腈作为底物，与6重量％以下底物浓度时相比，活性也没有减少。
(f)即使在35重量％的丙烯酰胺水溶液中，仍具有以丙烯腈作为底物的活性。
图1表示嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6(Geobacillusthermoglucosidasius Q-6)株的腈水合酶β亚基、α亚基以及下游基因群的基因构成以及限制酶图。表示出了通过菌落杂交获得的片段(HiN2.3)以及在大肠杆菌的表达中使用的片段(βα、βα1、βα12)的位置。
具体实施例方式
首先对本发明的腈水合酶进行说明。在本发明中，所谓具有腈水合酶活性指的是具有使腈化合物加成水分子后，转变为酰胺化合物的活性，例如如果是乙腈则转变为乙酰胺、如果是N-丙腈则转变为N-丙酰胺、如果是丙烯腈则转变为丙烯酰胺。生成的化合物经液相色谱分级收集后，使用气相色谱/质量分析(GC/MS)、红外吸收光谱(IR)以及核磁共振光谱(NMR)等进行鉴定。
在本发明中当对腈水合酶活性进行测定时，例如、向0.1重量％的1ml腈化合物溶液(0.05M磷酸缓冲液pH7.7)加入10μl腈水合酶溶液，在反应温度27℃～60℃范围内保温1分～60分钟后，通过加入0.1ml的1N HCl终止反应，将反应液的一部分用液相色谱进行分析，可以鉴定有无酰胺化合物的生成。
在本发明中作为底物的腈化合物，例如乙腈、N-丙腈、N-丁腈、异丁腈、N-戊腈、N-己腈等脂肪族腈化合物，2-氯丙腈等含有卤素原子的腈化合物，丙烯腈、丁烯腈、甲基丙烯腈等含有不饱和键的脂肪族腈化合物，乳腈、羟基苯乙腈等羟基腈化合物，2-苯基甘氨酸基腈等氨基腈化合物，苄腈、氰吡啶等芳香族腈化合物，丙二腈、丁二腈、己二腈等二腈化合物等以及三腈化合物。
本发明的腈水合酶的底物特异性在上述测定条件下，通过变更各种底物进行测定可以判断，对应于各个底物，是否具有腈水合酶活性。如果扩大底物特异性，其可制造的对应的酰胺化合物的种类也增加能扩大当然最好，但本酶至少可以用丙烯腈、己二腈、乙腈、异丁腈、n-戊腈、n-丁腈、苄腈、己腈作为底物。
本发明的腈水合酶通过还原型SDS(十二烷基硫酸钠)-聚丙烯酰胺电泳，经考马斯亮蓝染色，检测到分子量25000±2000和分子量28000±2000两个亚基，前者称为α亚基、后者称为β亚基。
本发明的腈水合酶在活性测定之前，以处于不含有有机酸等稳定剂的水溶液中的状态于70℃进行30分钟加热处理后，仍能保持加热前活性的35％活性。
另外，虽有报道称高浓度的腈底物可化学性地使酶失活，但本发明的腈水合酶即使用6重量％的丙烯腈作为底物，也没有观察到上述现象。
另外，有报道说高浓度的反应产物酰胺化合物可抑制反应，这在获得高浓度的反应产物时成了大问题，但本发明的腈水合酶即使将35重量％的丙烯酰胺加到活性测定溶液中，仍可发现作为底物的丙烯腈浓度有意义减少，酶仍保持活性。
作为本发明，已经例举了上述(18)所述内容。即，作为本发明的腈水合酶，优选的例子是由以序列表中的序列编号1所示205个氨基酸的序列表示的α亚基和以序列表中的序列编号2所示226个氨基酸的序列表示的β亚基构成的酶。除了这两个亚基以外，也可以含有金属或其它肽等。作为金属，特别多的是含铁或钴。另外，即使是含有两个亚基中任一个亚基的蛋白质也可以。而作为各个亚基的氨基酸序列，只要是与其它亚基形成复合体具有腈水合酶活性，当然会预想到在氨基酸序列中可以含有1或多个氨基酸的置换、缺失、或插入，而且由于宿主种类不同，翻译后可能会受到修饰。特别是在腈水合酶的α亚基中，半胱氨酸残基翻译后往往被修饰为半胱亚磺酸或半胱次磺酸。作为优选的例子如该氨基酸序列中的1～30个氨基酸被置换、缺失、插入、或翻译后修饰的氨基酸序列，更优选1～10个、更优选1～5个、最优选1～3个。而含有具有这样置换、缺失、或插入的氨基酸序列的腈水合酶酶也可以尝试通过众所周知定点突变导入法、例如Molecular Cloning 2nd Edition，Cold Spring Harbor Laboratorypress(1989)所述的方法，使用在碱基序列对应的部位导入置换、缺失、或插入的DNA，如下所述，导入到宿主微生物中使该DNA表达后获得，制作出具有热稳定性或有机溶剂耐受性提高或底物特异性变化等产业上期望的性质的变异酶。按照这样的技术水准，那些变异酶在具有腈水合酶活性时也可成为包含在本发明中的酶。
另外本发明虽然例举了上述(19)所述的发明，对此在本发明的DNA的说明中进行了详细说明。
具有上述理化性质的腈水合酶例如可以通过培养属于土壤芽孢杆菌属的微生物获得。在本发明中可使用的微生物只要是属于土壤芽孢杆菌属，且具有使腈化合物转变为酰胺化合物的水合活性的微生物，无论哪一种都可以。作为属于土壤芽孢杆菌属的微生物，如Geobacillus caldoxylosilyticus、嗜热土壤芽孢杆菌(Geobacilluskaustophilus)、Geobacillus lituanicus、嗜热脂肪土壤芽孢杆菌(Geobacillus Stearothermophilus)、Geobacillus Subterraneus、热链形土壤芽孢杆菌(Geobacillus thermocatenulatus)、热反硝化土壤芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)、嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)、喜热噬油土壤芽孢杆菌(Geobacillus thermoleovorans)、Geobacillustoebii、Geobacillus uzenensis。另外，不特别限定于来自土壤芽孢杆菌属的微生物，也包括来自其它微生物株的腈水合酶基因。作为这样的微生物株，如属于农杆菌(Agrobacterium)属、无色杆(Achromobacter)属、不动杆菌(Acinetobacter)属、气单胞菌(Aeromonas)属、肠杆菌(Enterobacter)属、欧文氏菌(Erwinia)属、黄色杆菌(Xanthobacter)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、棒杆菌(Corynebacterium)属、中华根瘤菌(Sinorhizobium)属、假单胞菌(PSeudomonas)属、链霉菌(Streptomyces)属、诺卡氏菌(Nocardia)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、微球菌(Micrococcus)属、红球菌(Rhodococcus)属、红假单胞菌(RhodopSeudomonas)属、根瘤菌(Rhizobium)属、假诺卡氏菌菌(PSeudonocardia)属等的微生物。具体来说，在本发明中通过下述手法进行筛选。首先取少量从各种各样场所采取的土壤，加到已装有水或生理盐水的试管内，于65℃的振荡培养器中振荡培养2天～14天。取该培养液一部分，加到广泛使用的用于微生物生长发育的培养基中、例如以甘油、胨、酵母提取物等作为主要成分的液体培养基，在65℃的培养温度下，培养1天至7天左右。将上述得到的培养液的一部分铺在含有上述的用于微生物生长发育的培养基成分的琼脂平板培养基上，于65℃下再进行培养，可以通过使其形成菌落，分离微生物。将这样获得的微生物使用加有在上述培养基成分中再加入N-戊腈等腈化合物或甲基丙烯酰胺等酰胺化合物的液体培养基的试管或烧瓶，通过在适当的期间、例如约12小时至7天左右的时间、于65℃的培养温度下进行振荡培养使微生物增殖，按照上述测定腈水合酶活性的常规方法，选择目的微生物。当根据16SrRNA以及下述生化性质对这样的微生物的代表菌株进行鉴定时，判明是嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌(Geobacillusthermoglucosidasius)，以嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6(Geobacillus thermoglucosidasius Q-6)的名称作为编号FERM P-19351(受理日平成15年5月16日)保藏于独立行败法人产业技术综合研究所(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，根据布达佩斯条约作为FERM BP-08658被移管保藏(接受日平成16年3月11日)。虽然检索了多种专利、文献，但本发现任何有关属于嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌的微生物、有关具有腈水合酶活性的记载。由此确认嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株是新菌株。使用该新菌株的突变体、即由嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株衍生的突变株、细胞融合株和基因重组株都可以制造酰胺化合物。而嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的性质如下所述。
(a)形态学上的性质培养条件营养琼脂(Oxoid，England，UK)培养基60℃1.细胞的形状和大小形状杆菌大小0.8×2.0～3.0μm2.有无细胞多态性-3.有无运动性+鞭毛的着生状态周毛4.有无胞子-胞子的部位端立(b)培养的性质培养条件营养琼脂(Oxoid，England，UK)培养基60℃1.颜色奶油色2.光泽+3.色素生产-培养条件营养肉汤(Oxoid，England，UK)培养基60℃1.有无表面发育-2.培养基有无混浊+培养条件明胶穿刺培养60℃1.生长发育状态+2.明胶液化+培养条件石蕊汁60℃1.凝固-2.液化-(c)生理性质1.革兰氏染色不定2.硝酸盐的还原-
2.脱氮反应-3.MR测试-4.VP测试-5.吲哚的生成-6.硫化氢的生成-7.淀粉的水解-8.柠檬酸的利用Koser-Christensen-9.无机氮源的利用硝酸盐-铵盐+10.色素的生成-11.脲酶活性-12.氧化酶+13.过氧化氢酶+14.生长发育的范围pH5.5～8.0温度45℃～72℃15.对氧的态度通性厌氧性16.O-F测试-/-(d)糖类的产酸/产气1.L-阿拉伯糖-/-2.D-木糖+/-3.D-葡萄糖+/-4.D-甘露糖+/-5.D-果糖+/-6.D-半乳糖-/-7.麦芽糖+/-
8.蔗糖+/-9.乳糖-/-10.海藻糖+/-11.D-山梨糖醇-/-12.D-麦芽糖醇+/-13.肌醇-/-14.甘油-/-(e)其它性质1.β-半乳糖苷酶活性-2.精氨酸二氢酶活性-3.赖氨酸脱羧酶活性-4.色氨酸脱氨酶活性-5.明胶酶活性+在本发明方法中使用的微生物的培养方法可根据一般的微生物培养方法进行，无论固体培养或液体培养都可以。嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)由于是通性厌氧性微生物，所以可以在与通常的通性厌氧性微生物同样的培养条件下进行培养。培养温度可以在微生物生长发育范围内适当变更，例如、40℃～75℃的范围。培养基的pH可以是例如4～9。特别是对于嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6(Geobacillus thermoglucosidasius Q-6)，可以在45℃～72℃、优选55℃～70℃范围的培养温度下，5～8的培养基pH下进行培养。培养时间因各种条件不同而有所差异，通常、优选约1天～约7天左右时间。另外作为培养基，使用用于一般的微生物的通常的适当含有碳源、氮源、有机或无机盐等的各种培养基。作为碳源可以使用甘油、葡萄糖、蔗糖、糖蜜、有机酸、动植物油等。作为氮源、如酵母提取物、胨、麦芽提取物、肉提取物、尿素、硝酸钠等。作为有机或无机盐、如可以使用氯化钠、硫酸镁、氯化钾、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钴、硫酸锌、硫酸铜、醋酸钠、碳酸钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等。在本发明方法中，为了使所用微生物的腈水合酶活性提高，最好是在培养基中添加N-戊腈、异戊腈、丁烯腈等腈化合物、甲基丙烯酰胺等酰胺化合物。添加量，例如、对于1升培养基，添加0.01g～10g范围的量为好。另外，最好是有0.1μg/ml以上Fe离子或Co离子存在。
为了获得本发明的酶的氨基酸序列信息，可以将本件发明的酶纯化后，通过还原型SDS-聚丙烯酰胺电泳将各亚基分离后，从凝胶中切出各个带，通过蛋白质测序仪测定氨基酸序列的一部分。
另外本发明还涉及到编码腈水合酶的DNA。具体来说，如含有序列号3的695-1312位的DNA和含有序列号3的1-681位的DNA，它们分别DNA编码α亚基与β亚基，但并不限定于此，只要是含有该碱基序列的DNA就可以。另外也可以是在严格的条件下可以与这些序列互补的碱基序列构成的DNA进行杂交的DNA，只要是具有腈水合酶活性，都包含在本发明中。即使用这些DNA，可以表达本发明的腈水合酶。严格的条件下指的是例如使用ECL direct nucleic acid labelingand detection System(Amersham Pharmacia Biotech公司制)，手册记述的条件(Wash42℃、含有0.5xSSC的primary wash buffer)。作为在严格的条件下可进行杂交的DNA，例如在上述严格的条件下，在含有序列号3的695-1312位的DNA或含有序列号3的1-681位的DNA的互补的碱基序列中任意的、通常至少20个、至少优选50个、特别是至少优选100个连续的碱基序列作为检测样品，与该样品进行杂交的DNA。
编码本发明腈水合酶的DNA可以通过以下方法获得。在本说明书中，只要是没有特别说明，可以采用在该领域中众所周知的基因重组技术、重组蛋白质的生产技术、分析法。
编码本发明腈水合酶的DNA根据本说明书中给出的碱基序列、或氨基酸序列、以及不同情况下由上述的纯化酶测定得到的氨基酸序列等序列信息，可以从含有本发明的腈水合酶的微生物、例如嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株中获得。使用根据氨基酸序列合成的寡核苷酸作为探针，将含有腈水合酶的微生物的染色体DNA经限制酶消化得到的DNA片段导入到噬菌体或质粒中，转化宿主，从得到的文库中通过蚀斑杂交或菌落杂交等也可以得到编码本发明腈水合酶的DNA。另外不以寡核苷酸作为探针，而是根据由上述纯化酶测定得到的两个亚基的N末端氨基酸序列信息等制备引物，以通过聚合酶链式反应(PCR)对腈水合酶基因的一部分进行扩增得到的产物作为探针，通过同样的过程也可以获得该DNA。得到的DNA插入质粒载体、例如pUC118中进行克隆，通过双脱氧终止法(Proceedings of the National Academyof Sciences.USA，745463-5467，1977)等众所周知的方法可以测定碱基序列。可以通过使用上述给出的活性测定常规方法对使用该基因转化的大肠杆菌宿主中的表达产物进行测活，确认这样制备的基因是编码腈水合酶的DNA。
另外本发明提供重组载体，其特征是上述DNA被连接在载体上。
所谓本发明中的重组载体可以通过在适于宿主微生物的启动子区域下游以能够发挥作用的形式连接上用上述方法得到的DNA的5’末端侧，根据需要在该片段下游插入转录终止序列，整合到适当的表达用载体中进行制备。
作为适当的表达载体，只要是可在宿主微生物内复制增殖的，没有特别限制。另外，只要是染色体可插入基因的宿主，不需要含有该宿主中可自我复制的区域。例如、作为宿主，如果使用大肠杆菌，可以从含有强力启动子、例如lac、trp、tac、trc、T7，PL或丙酮酸氧化酶基因的启动子(专利公报第2579506号)等的pUC系、pGEX系、pET系、pT7系、pBluescript系、pKK系、pBS系、pBC系、pCAL系等通常在大肠杆菌中使用的任意载体中选择。另外，α亚基基因以及β亚基基因也可以由各个启动子作为独立的顺反子表达，也可以通过共同的启动子以多顺反子表达。另外，当为独立顺反子时，各个亚基基因也可以不在同一个载体上。
另外通过在上述的腈水合酶的重组载体中整合表达处于本发明腈水合酶基因下游的基因的DNA，发现腈水合酶的活性进一步上升，所以本发明也提供这样的载体。具体来说，与上述同样，使用含有表达必需的启动子或转录终止因子等的质粒载体，编码与腈水合酶的活化有关的蛋白质的基因、腈水合酶的α亚基基因以及β亚基基因可以以各个独立的顺反子表达，也可以通过共同的调控区域以多顺反子表达。同样各个基因也可以不在同一个载体上。
因此，本发明提供编码与腈水合酶的活化有关的蛋白质的DNA。具体来说，如序列表中的序列编号3中1325-1663位的碱基序列，但不限定于此，只要是含有该碱基序列的DNA都可以。另外可以是对由与这些序列互补的碱基序列构成的DNA在严格的条件下可进行杂交的DNA，只要是与腈水合酶的活化有关都包含在本发明中。即，使用这些DNA可以使本发明的腈水合酶进一步活化。严格的条件下指的是例如使用ECL direct nucleic acid labeling and detection system(Amersham Pharmacia Biotech公司制)，手册给出的条件(wash42℃、含有0.5xSSC的primary wash buffer)。作为在严格的条件下可进行杂交的DNA，例如、在上述的严格条件下，将含有序列号31325-1663位的碱基序列的DNA中的互补碱基序列中任意的、通常至少20个、优选至少50个、特别优选至少100个连续的碱基序列作为检测样品，可与该样品杂交的DNA。另外，与本发明的腈水合酶活化有关的蛋白质可以是序列号4的112个氨基酸的序列所表示的蛋白质，只要是具有参与腈水合酶的活化的能力，当然也会予想到在氨基酸序列中，也可以含有置换、缺失、或插入1或多个氨基酸的氨基酸序列，而且由于宿主种类不同，翻译后可能受到修饰。作为该氨基酸序列中的1～25个氨基酸被置换、缺失、插入、或翻译后修饰的氨基酸序列理想的例子，如优选1～10个、更优选1～5个、最优选1～3个。
另外，本发明提供转化子，其特征是上述的DNA被导入宿主细胞，使宿主转化。
可以通过使用由上述方法作成的表达载体转化宿主细胞获得转化子。作为宿主细胞，包括微生物、哺乳类细胞、以及植物细胞等，最好利用微生物。作为微生物的例子，如下述实施例中的大肠杆菌，对此没有特别的限定，如芽孢杆菌属、假单胞菌属、棒杆菌属、短颈细菌属、链球菌属、红球菌属、放线菌或酵母等。
作为向宿主微生物导入基因的导入法，可以通过例如转化、转导、融合传递、或电穿孔等在本技术领域中众所周知的任意的常规方法，导入到优选的宿主中。
另外作为本发明的腈水合酶或含有该酶的菌体处理物的制造方法，如上所述，可以通过适当组合的众所周知的纯化方法从能够生产该腈水合酶的微生物、例如、土壤芽孢杆菌属的微生物、特别是嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的培养物中获得该酶，另外如上所述，也可以从使用腈水合酶的基因转化的转化子中获得该酶。
当获取该酶时，土壤芽孢杆菌属的微生物的培养方法是如上所述的方法，最好将上述转化子于含有通常这些微生物可消化利用的营养源的培养基进行培养，例如、可以用生产酶或抗生素物质等的通常的方法进行培养。通常培养无论是液体培养还是固体培养都可以。例如、可以使用适当混合了葡萄糖、蔗糖等碳水化合物；山梨糖醇、甘油等醇类；柠檬酸、酢酸等有机酸；大豆油等碳源或这些物质的混合物；酵母提取物、肉提取物、硫铵、铵等含氮无机有机氮源；磷酸盐、镁、铁、钴、锰、钾等无机营养源；以及生物素、硫胺素等维生素类的培养基。更为理想的是在上述的培养基成分中存在0.1μg/ml以上Fe离子或Co离子。培养条件通常优选在好氧条件下进行。培养温度只要是宿主微生物能够生长发育的温度即可，没有特别限制，例如通常在5℃～80℃、优选20～70℃、更优选25～42℃下进行。而培养过程中的pH只要是宿主微生物能够生长发育的pH即可，没有特别限制，例如通常在pH3～9、优选pH5～8、更优选在pH6～7下进行。
另外，在本发明中，使用本发明的酶可以制造腈化合物。在这一发明中，当使用上述酶时，只要是不妨碍本发明的酶的作用，对其纯化程度等没有特别限定，除了纯化的本发明的酶之外，也可以用其它的酶含有物，此外还可以使用生产该酶的微生物或将该酶的基因导入后转化的转化子等。在使用微生物或转化子等时，可以利用菌体，作为菌体可以使用活菌体、或使用实施丙酮或甲苯等溶剂处理或冷冻干燥等处理，增加了化合物的透性的菌体。因情况不同也可以制成菌体破碎物或菌体提取物等含酶物。作为含有该酶的菌体处理物的制备方法，如首先对培养物进行固液分离，根据需要使得到的湿菌体悬浮于磷酸缓冲液或Tris盐酸缓冲液等缓冲液中，然后适当组合运用超音波处理、弗氏压碎器处理或使用玻璃珠的粉碎处理、或用溶菌酶或蛋白酶等细胞壁溶解酶处理等菌体破碎处理，从菌体内提取该酶，可以获得粗制的腈水合酶含有液。根据需要，可以通过使用众所周知的蛋白质、酶等分离、纯化手段，进一步纯化该粗制酶含有液。例如、向粗制酶含有液中加丙酮、乙醇等有机溶剂，使其分级沉淀，或加硫铵等使其盐析，从水溶液中使含有腈水合酶级分沉淀，进行回收的方法。还可以再适当组合适当组合阴离子交换、阳离子交换、凝胶过滤、使用抗体或螯合剂的亲和层析等进行纯化。当然，可以通过众所周知的方法，将酶或菌体、含有酶的菌体处理物等填充到柱子中，也可以将其固定于载体上，特别是对于菌体，也可以包埋在聚丙烯酰胺凝胶等高分子中。将菌体或菌体处理物悬浮于水或磷酸缓冲液等缓冲液等的水性水溶液中，通过向该溶液中加腈化合物，使反应进行。使用的菌体或菌体处理物的浓度为0.01重量％～20重量％、优选0.1重量％～10重量％。反应温度的上限优选90℃、更优选85℃、最好优选70℃，反应温度的下限例如1℃、优选4℃、更优选10℃，反应pH例如5～10，优选6～8，反应时间例如1分钟～72小时。也可以通将腈化合物徐徐滴下，使之生成高浓度酰胺化合物并积蓄。为了从反应液中回收酰胺化合物，可采用过滤或离心分离等将菌体或菌体处理物等除去后，利用晶析等手法取出的方法等。
实施例以下给出实施例对本发明进行详细说明，这些实施例并不限定本实施例1菌体分离取少量在琦玉县温泉附近采取的土壤(约1g)，加入到装有5ml生理盐水的试管内，于65℃的振荡培养器中振荡培养3日。取一部分该培养液(0.5ml)，加到由葡萄糖1.0重量％、胨0.5重量％、酵母提取物0.3重量％组成的培养基(pH7.0)中，于65℃下进行2日往复振荡培养。通过将经振荡培养得到的培养液的一部分(0.1ml)涂在含有上述培养基成分的琼脂平板培养基上，于65℃下再培养2天，使其形成菌落，对微生物进行分离。通过将分离的微生物接种到在与上述同一组成的培养基中添加了0.1重量％的N-戊腈的液体培养基后，于65℃下培养24小时，获得含有腈利用性高的微生物的培养液。将该培养液1ml加到9ml的1.1重量％的丙烯腈溶液(0.05M磷酸缓冲液pH7.7)，在反应温度27℃下开始反应。10分钟后，通过加1ml的1N HCl终止反应。将反应液的一部分利用液相色谱(HPLC)进行分析，通过检测有无丙烯酰胺生成，筛选具有腈水合酶活性的微生物。通过这样操作得到使腈化合物转变为酰胺化合物的具有水合活性的微生物嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株。
(液相色谱分析条件)本体HITACHI D-7000(日立公司制)柱子；InertSil ODS-3(GLscience公司制)长度；200mm柱温度；35℃流量；1ml/min样品注入量；10μl溶液0.1wt％磷酸水溶液实施例2菌体培养的生长发育上限温度将实施例1得到的嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株涂布在含有实施例1使用的培养基成分的琼脂平板培养基上，在多个不同温度下进行培养，研究菌体的生长发育状况。其结果如表1所示。嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株直至70℃均表现出通常的增殖特性，即使在72℃下也可以生长发育。
表1评价基准-没有增殖、+增殖、++增殖良好
实施例3嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株菌体中的腈水合酶活性的测定以及对温度的依赖性将含有甘油0.2重量％、柠檬酸三钠二水合物0.2重量％、磷酸二氢钾0.1重量％、磷酸氢二钾0.1重量％、胨0.1重量％、酵母提取物0.1重量％、氯化钠0.1重量％、N-戊腈0.1重量％、硫酸镁七水合物0.02重量％、硫酸铁(II)七水合物0.003重量％、氯化钴六水合物0.0002％的灭过菌的培养基(pH7.0)100ml加入到500ml三角烧瓶中，然后接种1ml预先在同一培养基培养的嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株培养液。将接种后的培养液于65℃下以200stroke/min旋转振荡培养1天，获得菌体培养液。通过离心分离(10000×g，15分钟)从300ml该嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的菌体培养液中收集菌体，用0.05M磷酸缓冲液(pH7.5)洗涤后，悬浮于50ml同一缓冲液中。对于这样制备的菌体悬浊液，用上述方法反应5分钟，测定使腈化合物转变为酰胺化合物的水合活性。如果将酶活性单位(unit)定义为在1分钟内使1μmol丙烯腈转变为丙烯酰胺的活性为1单位(以下、记为U)，那么27℃下每单位湿菌体重量的腈水合酶活性(U/Mg)为9.37U/mg。再于10℃下制备含有0.5重量％丙烯腈的菌体悬浊液(5U/ml)，使用该菌体悬浊液，在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的条件下，同样得到腈水合酶活性，活性如表2所示。该结果表明在反应中使用菌体时的最适温度在60℃附近，特别是在高温区表现出很高的活性。
表2
实施例4嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株菌体中的腈水合酶的热稳定性为了研究嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株菌体中的腈水合酶活性的热稳定性，将通过实施例3培养法得到的菌体按照10U/ml悬浮于蒸馏水中，在既定温度下进行30分保温处理，测定残存活性。向0.5ml的1重量％丙烯腈溶液(0.05M磷酸钾缓冲液、pH7.5)中加0.5ml的保温处理后菌体液，于27℃下边搅拌，边开始反应。5分钟后，通过加100μL的1当量盐酸终止反应。算出相对于保存处理前活性的保存处理后的活性，将保存处理前的活性作为基准(100)的换算值如表3所示。由该结果可以认为嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株菌体中的腈水合酶的酶活性即使在高温下也仍能稳定保持，在70℃的高温下也能保持80％以上的活性，在80℃的高温下也可保持30％以上的活性。
表3
实施例5以各种腈化合物作为底物的反应针对使下表4中给出的各种腈化合物转变为对应的酰胺化合物的腈水合酶活性进行研究。向9ml的1.1％腈溶液(0.05M磷酸钾缓冲液、pH7.5)中加入1ml菌体悬浊液，于反应温度30℃下开始反应。10分后通过加1ml的1N HCl终止反应。所用的HPLC的分析条件与实施例1相同，将溶液做成含有10wt％乙腈的蒸馏水。其结果表明将表4给出的所有腈化合物作为底物，都具有腈水合酶活性。
表4
将实施例6以下所述的直至阐明来自嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶α亚基(ORF2)、β亚基(ORF1)以及腈水合酶活性化因子(ORF3)的氨基酸序列以及碱基序列的本发明的过程归纳如下。
将对嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株进行培养得到的菌体破碎后，进行硫酸铵沉淀、阴离子交换柱层析、DEAE柱层析、羟基磷灰石柱层析、凝胶过滤层析、透析，对腈水合酶酶进行纯化。
测定纯化的腈水合酶的α亚基以及β亚基的N末端大约30残基的氨基酸序列，考虑该菌的所属菌属的氨基酸的密码子使用，制备用于基因扩增的寡核苷酸简并引物，以从该菌体提取的染色体DNA作为模板，进行简并PCR，获得扩增DNA片段。对被扩增的DNA片段进行克隆，测定插入片段的碱基序列。对从该碱基序列推定出的氨基酸序列和从嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株纯化的腈水合酶α亚基以及β亚基的N末端氨基酸序列进行比较，确认被克隆的序列编码腈水合酶。
结果表明在嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株中由5’末端侧上游开始的腈水合酶基因按照β亚基、α亚基顺序邻接存在。
根据众所周知的各种各样的腈水合酶α亚基的下游基因中同源性高的序列制备用于基因扩增的寡核苷酸简并引物，以从该菌体提取的染色体DNA作为模板进行简并PCR，获得扩增DNA片段。对得到的该菌的α亚基部分的扩增DNA片段进行克隆，测定碱基序列。
将以上得到的嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶α亚基以及β亚基导入适当的表达载体。使用构建的表达质粒，转化适当的宿主菌。作为宿主，如红球菌属、棒杆菌属、大肠杆菌等。优选没有酰胺酶的宿主。另外使埋头转化子所得到的菌体与丙烯腈在水性溶剂中接触，以此确认丙烯酰胺的生成，对该生成效率以及腈水合酶活性进行比较。
然后将上述得到的DNA片段作为探针，进行菌落杂交，对包含嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶α亚基以及β亚基的下游基因的周边基因进行克隆。
使下游基因与腈水合酶α亚基以及β亚基共表达，比较腈水合酶活性。结果发现下游基因是与使腈水合酶活性显著上升的活化有关的基因。
实施例6来自嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶的纯化对嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株进行培养，通过各种柱层析对腈水合酶活性级分进行纯化。
层析中的腈水合酶活性级分的测定方法如下进行。向用HEPES缓冲液(100mM、pH7.2)稀释的各级分洗脱液中添加1重量％的丙烯腈，于27℃下反应1分钟。通过向反应液添加10液量％1N HCl使反应终止，利用实施例1所述的HPLC分析法测定生成的丙烯酰胺浓度。
为了对来自嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶酶进行纯化，首先将嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株接种在含有0.1重量％的N-戊腈的V/F培养基(甘油0.2重量％、柠檬酸三钠二水合物0.2重量％、磷酸二氢钾0.1重量％、磷酸氢二钾0.1重量％、胨0.1重量％、酵母提取物0.1重量％、氯化钠0.1重量％、N-戊腈0.1重量％、硫酸镁七水合物0.02重量％、硫酸铁(II)七水合物0.003重量％、氯化钴六水合物0.0002重量％)，于65℃培养24小时。在培养中，使用96孔2ml的深底平板(COSTAR公司)。培养结束后、通过8000g、10分钟的离心分离集菌，将得到3g湿菌体再悬浮于20ml的HEPES缓冲液(100mM、pH7.2)。在冷却下将菌体用超音波破碎仪进行破碎，向菌体破碎液中加硫酸铵(30％饱和浓度)，于4℃下缓慢地搅拌30分钟，于20000g下进行10分钟的离心分离，得到上清。向离心上清液中加入硫酸铵(70％饱和浓度)，于4℃下缓慢地搅拌30分钟后，通过于20000g下10分钟离心分离，将得到的沉淀物再溶解于9ml的HEPES缓冲液(100mm、pH7.2)，在1L同样的溶液中，于4℃下透析24小时，进行阴离子交换层析(Amersham Bioscience公司；HiTrap DEAE FF(柱体积5ml×5根))。展开液使用HEPES缓冲液(100mm、pH7.2)，通过使氯化钾浓度从0.0M直至0.5M直线增加，进行分级洗脱，得到含有腈水合酶活性的级分。将该级分进行磷灰石柱层析(BIO-RAD公司制；CHT2-I(柱体积2ml))。以0.01M磷酸钾水溶液(pH7.2)作为展开液，通过使磷酸钾从0.01M直至0.3M直线增加进行分级洗脱，得到含有腈水合酶活性的级分。将该级分进行以含有0.15M NaCl的0.05M磷酸钠水溶液(pH7.2)作为展开液的凝胶过滤层析(Amersham Bioscience公司；Superdex 200HR 10/30)，得到腈水合酶活性级分。使用这样获得的凝胶过滤层析的腈水合酶活性级分进行以下的实施例。
实施例7由嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株纯化的腈水合酶活性级分中的腈水合酶的反应温度依赖性对于来自嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶活性级分溶液(3.2mg/mL、0.05M磷酸缓冲液(pH7.5))，在表5所示反应温度下对使腈化合物转变为酰胺化合物的腈水合酶活性进行测定。向1mL的0.5重量％丙烯腈溶液(0.05M磷酸钾缓冲液、pH7.5)加腈水合酶活性级分溶液，在各温度下边搅拌边开始反应。2分后通过加100μL的1N盐酸终止反应。酶活性单位(unit)定义为1分钟内将1μmol的丙烯腈转变为丙烯酰胺的活性为1单位(以下、记为U)，表5给出了每单位酶重量的水合活性(U/mg)。该结果表明从嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株纯化的腈水合酶活性级分中的腈水合酶的活性在直至60度的高温下，伴随着反应温度的上升而上升。最适温度与反应中使用菌体时同样，认为处于60℃附近，即使在70度的高温下也表现出很高的腈水合酶活性。
表5
实施例8从嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株纯化的腈水合酶的热稳定性为了研究从嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株纯化的腈水合酶的活性的热稳定性，将腈水合酶活性级分溶液(3.2mg/ml、0.05M磷酸缓冲液(pH7.5))在既定温度下进行30分的保温处理，测定残存活性。向1mL的0.5重量％丙烯腈溶液(0.05M磷酸钾缓冲液、pH7.5)中加保温处理后的腈水合酶溶液5μl，于27℃下边搅拌边开始反应。2分后通过加100μl的1N HCl终止反应。算出相对于保存处理前活性的保存处理后活性(残存活性)，以保存处理前活性作为基准(100)的换算值如表6所示。由该结果可以认为从嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株纯化的腈水合酶活性级分中的水溶液中腈水合酶的酶活性即使在高温下也保持稳定，在60℃的高温下也能保持60％以上的活性，在70℃的高温下也还可以保持35％以上的活性。
表6
实施例9从嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株纯化的腈水合酶对丙烯腈浓度的依赖性和浓度耐受性对于从嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株纯化的腈水合酶，为了研究对作为底物的丙烯腈浓度的依赖性和耐受性，将4μl的腈水合酶活性级分溶液(3.2mg/mL、0.05M磷酸缓冲液(pH7.5))加到5ml含有各种重量％的丙烯腈溶液(0.05M磷酸钾缓冲液、pH7.5)中，于27℃下边搅拌边开始反应。于5分钟、10分钟、20分钟、40分钟后各取1ml，通过加100μL的1N HCl终止反应，通过HPLC定量生成的丙烯酰胺的浓度，如表7所示。由该结果可以认为从嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株纯化的腈水合酶活性级分的水溶液中的腈水合酶酶活性即使在高丙烯腈浓度下也能保持稳定。即使在6％的高浓度丙烯腈溶液中反应40分钟，与更低的丙烯腈浓度情况相比，没有观察到活性下降，反而伴随着底物浓度的上升，活性也上升。
表7
实施例10从嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株纯化的腈水合酶的丙烯酰胺浓度耐受性对于从嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株纯化的腈水合酶，为了研究由生成物丙烯酰胺引起的酶抑制，将10μl的腈水合酶活性级分溶液(3.2mg/ml、0.05M磷酸缓冲液(pH7.5))加到含有0.5重量％丙烯腈和35重量％丙烯酰胺的1ml溶液(0.05M磷酸钾缓冲液、pH7.5)中，于27℃下边搅拌边进行10分钟反应，通过HPLC定量反应后溶液中的丙烯腈浓度，发现所有的丙烯腈都转变为丙烯酰胺。由该结果可以认为从嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株纯化的腈水合酶活性级分的水溶液中的腈水合酶的酶活性即使在35％的高丙烯酰胺浓度下也仍保持活性。
实施例11来自嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶β亚基以及α亚基部分的基因的克隆(1)来自嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶酶的确认以及N末端氨基酸序列测定将通过实施例6得到的经凝胶过滤层析的腈水合酶活性级分洗脱液在还原条件下进行还原型SDS聚丙烯酰胺电泳。电泳后用考马斯亮蓝(CBB)进行蛋白质染色、脱色，结果具有约25K道尔顿以及约28K道尔顿分子量的2条主要的带被确认。使用印迹装置(BIO-RAD公司)将这2条主要的纯化蛋白质转移到PVDF膜(MILLIPORE公司制)上，进行CBB染色，将吸附有2条目的带的部分从PVDF膜上切下来。然后使用全自动蛋白质一级结构分析仪PPSQ-23A(岛津制作所)测定2种蛋白质N末端氨基酸序列。结果表明分子量25K道尔顿的蛋白质的N末氨基酸序列是序列号23表示的序列，分子量28K道尔顿的蛋白质的N末氨基酸序列是序列号24表示的序列。
与已知的腈水合酶酶的氨基酸序列比较，结果表明25K道尔顿的多肽链与腈水合酶α亚基、28K道尔顿的多肽链与腈水合酶β亚基尽管同源性低，但都表现出同源性，暗示编码该蛋白质。
(2)对应于N末端氨基酸序列的寡核苷酸引物的合成由上述测定的2种蛋白质的N末端氨基酸序列，根据该菌属的密码子使用合成以下12种用于PCR的简并寡核苷酸引物。序列号5所示引物1(αF1)、序列号6所示引物2(αF2)、序列号7所示引物3(αF3)、序列号8所示引物4(αR1)、序列表中的序列编号9所示引物5(αR2)、序列号10所示引物6(αR3)、序列表中的序列编号11所示引物7(βF1)、序列号12所示引物8(βF2)、序列号13所示引物9(βF3)、序列号14所示引物10(βR1)、序列号15所示引物11(βR2)、序列号16所示引物12(βR3)。其中y表示C或T，R表示a或g，m表示a或c，k表示g或t，s表示c或g，w表示a或t，d表示a、g或t，n表示a、c、g或t。另外，考虑编码α亚基和β亚基的基因在染色体上的位置，合成引物。
(3)嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株染色体DNA的提取以及简并PCR将嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株通过与实施例6同样的方法培养、回收，使用QIAGEN公司的Genomic-tip system(500/G)试剂盒从菌体中提取染色体DNA。以0.1μg溶解于TE溶液的嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的染色体DNA作为模板进行简并PCR。将序列号5到10所示的引物1至6与序列号11到16所示的引物7至12按照36种组合进行简并PCR。使用含有100pmol的引物各2种，5U的TA kara公司的ExTaq DNA聚合酶以及缓冲液的总量100μl的反应液，进行简并PCR，尝试扩增DNA片段。反应条件如下。96℃、3分钟热变性后、进行96℃、30秒热变性、42℃、30秒退火、72℃、1分30秒延伸反应的35次循环后，于72℃进行5分钟延伸反应，保持在4℃下。将各个PCR产物进行1重量％琼脂糖凝胶电泳，在确认DNA是否扩增时，只有用序列表中的序列编号9给出的引物5(αR2)与序列表中的序列编号11给出的引物7(βF1)的组合以及用序列表中的序列编号9给出的引物5(αR2)与序列表中的序列编号12给出的引物8(βF2)组合进行PCR时，可确认有约700bp的DNA片段扩增。
(4)简并PCR产物的克隆以及扩增DNA片段的碱基序列测定从凝胶中将被扩增的DNA片段切出，用QIAquick GE1 Extraction Kit(QIAGEN公司)提取，用T4DNA连接酶(TAkara公司)将该片段与pGEM-T载体(Promega公司)连接。利用了使用ExTaq进行PCR，结果会在3’末端附加1个碱基A的性质。连接反应后，转化大肠杆菌JM109株，在LB琼脂培养基(50μg/ml氨苄青霉素、0.5重量％细菌用酵母提取物、1重量％细菌用胰蛋白酶胨、0.5重量％NaCl、2.0重量％细菌用琼脂(pH7.5))中于37℃下培养过夜，利用氨苄青霉素选择转化子。按照常规方法从用含有氨苄青霉素的LB培养基培养的转化子中提取质粒DNA，使用处于载体上的SP6和T7启动子的序列作为引物，测定约700bp插入序列的碱基序列。
结果在扩增DNA片段内确认3681bp的开放读框(以后称为ORF1)。在ORF1的翻译终止密码子和下一个开放读框(以后称为ORF2)的翻译起始密码子ATG之间有13bp。由ORF1的碱基序列推测出的N末端侧25个氨基酸序列与上述纯化的28K道尔顿的多肽链的N末端侧25个氨基酸序列完全一致，相当于序列号2所示氨基酸序列的第1位至第25位的序列。ORF1的氨基酸序列与已知的腈水合酶β亚基的氨基酸序列之间尽管同源性低，但也表现出同源性，暗示编码该蛋白质。
嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶β亚基编码226氨基酸，与在已有的数据库中具有同源性的蛋白质的氨基酸序列的一致度按照由高开始的顺序排序，与克雷伯氏菌属MC12609株的腈水合酶β亚基为43％、与农杆菌属的腈水合酶β亚基为42％、与红假单胞菌属CGA009株腈水合酶β亚基为40％，非常低。另外，与来自和土壤芽孢杆菌属亲缘关系近的属芽孢杆菌属的蛋白质的氨基酸的一致度也按照由高到低排序，与嗜热菌Bacillus BR449株的腈水合酶β亚基为35.0％、与嗜热菌史氏芽孢杆菌SC-J05-1株的腈水合酶β亚基为34.5％，非常低。另一方面，嗜热菌Bacillus BR449株的腈水合酶β亚基与嗜热菌史氏芽孢杆菌SC-J05-1株的腈水合酶β亚基具有85.6％的很高的一致度。另外由ORF2的碱基序列推测的N末端的氨基酸序列与上述纯化的25K道尔顿的多肽链N末端的氨基酸序列完全一致。
由以上结果判明在嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株中，5’末端侧上游开始的编码28K道尔顿腈水合酶β亚基的基因、编码25K道尔顿腈水合酶α亚基的基因按照这样顺序邻接存在的。
(5)嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株腈水合酶α亚基部分的基因的克隆为了对上述得到的嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶β亚基部分的基因的周边基因以及α亚基部分的基因进行克隆，进行简并PCR。参考位于已知的腈水合酶α亚基的下游的基因，制备下述2种用于简并PCR的寡核苷酸引物。即序列号17给出的引物13(pR1)、序列号18给出的引物14(pR2)。
另外，在先前测定了碱基序列的嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶β亚基内制备下述2种用于PCR扩增的寡核苷酸引物。即序列号19给出的引物15(Q6AposF)、序列号20给出的引物16(Q6abF1)。以0.1μg嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株染色体DNA作为模板进行简并PCR。简并PCR在退火温度50度下，按照序列号17、18给出的引物13、14与序列号18、19给出的引物15、16的4种组合进行的。由该结果可以确认用序列号17给出的引物13(pR1)与序列号18给出的引物15(Q6AposF)的组合进行的PCR中，存在约0.8kb的扩增DNA产物。而用序列号16给出的引物13(pR1)与序列号19给出的引物16(Q6abF1)的组合进行PCR中，确认存在有1.5k的扩增DNA产物。通过其它组合进行PCR时，不能确认扩增DNA产物的存在。
将通过用序列号16给出的引物13(pR1)与序列号19给出的引物15(Q6AposF)的组合进行的简并PCR扩增的0.8kb的DNA片段从琼脂糖凝胶切出，按照常规方法提取DNA，整合到pGEM-T载体(Promega公司)中，转化大肠杆菌JM109株，通过50μg/ml的氨苄青霉素选择重组体。用含有氨苄青霉素的LB培养基培养转化子，利用常规方法提取质粒DNA，测定了约0.8kb的插入部分的碱基序列。该结果可确认618bp的开放阅读框(以后称为ORF2)。由ORF2的碱基序列推测的N末端侧29个的氨基酸序列与上述纯化的25K道尔顿的多肽链N末端侧的29个的氨基酸序列完全一致，相当于序列号1所示氨基酸序列的第1位至第29位的序列。ORF2的氨基酸序列与已知的腈水合酶α亚基的氨基酸序列尽管同源性低，但表现出同源性，暗示编码该蛋白质。
嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶α亚基编码205个氨基酸，与已有数据库中具有同源性的蛋白质的氨基酸序列的一致度按照由高到低排序，与嗜热菌Bacillus BR449株的腈水合酶β亚基为66.3％、与嗜热菌史氏芽孢杆菌SC-J05-1株的腈水合酶β亚基低至63.9％。而嗜热菌Bacillus BR449株的腈水合酶β亚基与嗜热菌史氏芽孢杆菌SC-J05-1株的腈水合酶β亚基一致性达88.8％，具有很高的同源性。
实施例12嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶α亚基和β亚基部分向表达载体整合和在大肠杆菌中的表达(1)嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶α亚基和β亚基部分向表达载体的整合以上述测定的碱基序列作为基础，制备用于通过PCR对腈水合酶α亚基和β亚基部分进行扩增的以下2种寡核苷酸引物。即序列号21给出的引物17(Q6ab-F1-T)、序列号22给出的引物18(Q6ABall-R1-BglII-T)。序列号21给出的引物17在限制酶部位NdeEI之中设计了嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶β亚基的翻译起始密码子。对于序列号22给出的引物18，在紧靠嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶α亚基的翻译终止密码子下面导入了限制酶BglII位点。以嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的染色体DNA作为模板，使用序列号21、22给出的引物17，18各100pmol进行PCR。使用ExTaq DNA聚合酶，于总量100μl中在96℃下、3分钟热变性后、按照96℃30秒热变性、60℃30秒退火、72℃1分30秒延伸反应的条件下进行30个循环的PCR后，于72℃下进行5分钟延伸反应，然后在4℃下冷却。当将PCR后的溶液进行1.5重量％琼脂糖凝胶电泳时可确认扩增出约1.3kb的DNA片段。将该扩增DNA产物从琼脂糖凝胶中用常规方法提取，然后连接到Promega公司的pGEM-Teasy载体上，转化大肠杆菌JM109株。从转化子提取质粒DNA，测定插入部分的碱基序列，确认PCR扩增中没有错误。
接下来将该质粒用NdeI，EcoRI限制酶消化，进行1.5重量％琼脂糖凝胶电泳，将约1.3Kb的插入DNA从琼脂糖凝胶切出，利用常规方法提取。使用NOvagene公司的pET-26b(+)载体和pET-28a(+)载体作为表达载体。将这2种载体DNA用NdeI，EcoRI限制酶消化，进行1重量％琼脂糖凝胶电泳，利用常规方法提取约5.3Kb的DNA片段。根据常规方法将这些插入片段与载体进行连接反应，转化大肠杆菌JM109株，从利用卡那霉素抗性选择的转化子中提取质粒DNA，选出导入了插入片段的质粒。由以上可以获得嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶α亚基和β亚基部分作为插入片段导入的表达质粒。以下将最终制备得到的质粒称之为pET-26b(+)-βα和pET-28a(+)-βα。
(2)利用大肠杆菌表达的嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶活性用表达质粒pET-26b(+)-βα和pET-28A(+)-βα转化Novagene公司的大肠杆菌BL21(DE3)LysE株，通过T7启动子使嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶β亚基和α亚基的蛋白质作为多顺反子共表达。
用各个表达质粒转化Novagene公司制的大肠杆菌BL21(DE3)LysE株的感受态细胞，将转化处理后的菌液涂在含有30μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基(0.5重量％细菌用酵母提取物、1重量％细菌用胰蛋白酶胨、0.5重量％NaCl、2.0重量％琼脂；pH7.5)上，于30℃下培养过夜，利用卡那霉素进行选择。将该转化子接种到2ml含有30μg/ml卡那霉素的LB培养基中，于30℃下以200rpm振荡培养过夜。将上述培养液按照2％重量接种到含有20μg/ml氯化钴天水合物(CoCl2·6H2O)和30μg/ml卡那霉素的10ml LB培养基中，于30℃下以200rpm振荡培养约3小时，直至OD600＝0.5，添加0.1mM的IPTG，诱导从T7启动子开始的表达后，200rpm振荡培养4小时，回收菌体。
用该菌体，在27℃下测定使腈化合物转变为酰胺化合物的腈水合酶水合活性。
将使来自嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶表达的大肠杆菌菌体再溶解于含有20mM Tris-HCl和15mM的NaCl的TBS缓冲液(pH7.5)中，稀释至OD＝0.2，制成终浓度0.2重量％丙烯腈溶液的反应液。于27℃下边搅拌边反应，30分钟后通过加100μL的1当量盐酸终止反应。酶活性单位(unit)定义为在1分钟内将1mol丙烯腈转变为丙烯酰胺的活性为1单位(以下、记为U)，表8给出了每单位湿菌体重量的水合活性(U/mg)。
表8
由该结果判明当使嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶α亚基和β亚基在大肠杆菌中表达时，其具有将丙烯腈转换为丙烯酰胺的腈水合酶活性。
实施例13通过菌落杂交获得来自嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶周边基因(1)荧光标记DIG探针的制备用序列号25给出的嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶α亚基部分的DNA作为模板，使用罗氏公司制的DIG-DNA标记试剂盒制备荧光标记探针。制备方法根据罗氏公司的DIG手册。
(2)染色体DNA杂交将实施例11中制备的嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的染色体DNA用各种限制酶消化，进行1重量％琼脂糖凝胶电泳。将琼脂糖凝胶内的DNA转移到尼龙膜Hybond)-N+(Amersham公司)后，使用先前制备的荧光标记DIG探针，进行染色体DNA杂交。将转移、固定了DNA的膜按照每张10ml的比例浸入到杂交缓冲液(含有1重量％脱脂奶粉、0.1重量％N-月桂酰肌氨酸酯、0.02重量％SDS、50重量％甲酰胺的5×SSC)中，于42℃下进行2小时预杂交。与上述同样，将100ng制备的荧光标记探针于95℃下通过10分钟煮沸和急冷处理使其热变性，添加到预杂交缓冲液中，于42℃下杂交过夜。将杂交后的膜在150ml的含有0.1重量％SDS的2×SSC中于室温下洗涤2次。然后在加热到65℃的150ml的含有0.1重量％SDS的1×SSC中进行2次5分钟的洗涤。接下来用100ml的马来酸缓冲液(用0.1M马来酸、0.15M NaCl、NaOH调到pH7.5)洗涤5分钟后，在50ml的封闭溶液(含有0.3重量％Tween20、0.15M NaCl和1重量％脱脂乳的0.1M马来酸缓冲液；pH7.5)中，于室温下进行30分钟封闭处理。用20ml的封闭溶液将抗洋地黄毒苷-AP稀释至75mU/ml，于室温下进行30分钟的抗体反应后，在100ml的洗涤缓冲液(含有0.3重量％Tween20、0.15M NaCl的0.1M马来酸缓冲液；pH7.5)中将膜洗5次，将没有结合的抗体冲去。在20ml的检测缓冲液(0.1M Tris-HCl、0.1M NaCl、pH9.5)中进行5分钟平衡处理后、制成在10ml的检测缓冲液中含有34μl的100mg/ml的NBT(氮蓝四唑)溶液，35μl的50mg/ml的BCIP溶液的稀释后的发色底物溶液NBT/BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸)，将膜完全浸没在该溶液中，避光温育1分钟至16小时。温育中不要使盘移到，也不要摇动，进行发色确认。结果表明在用限制酶HiIII消化的约2.3kb基因片段中，含有腈水合酶α亚基部分的下游基因。
(3)通过菌落杂交获得目的克隆①用于菌落杂交的质粒文库的制作使用同一荧光标记DIG探针，进行菌落杂交。将10μg嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的染色体DNA进行1重量％琼脂糖凝胶电泳，从琼脂糖凝胶将含有约2.0kb至2.6kb的DNA片段的部分切出，用与上述同样的方法对DNA片段进行提取和纯化。将得到的DNA片段用DNA连接试剂盒(Takara公司制)导入处于pUC118质粒载体(Takara公司制)的多克隆位点内的Hind III限制酶部位。连接中使用的pUC118质粒载体DNA为经过下述处理的DNA使用限制酶Hind III消化后，通过酚/氯仿处理和乙醇沉淀进行纯化，然后用碱性磷酸酶(Takara公司制)进行5’末端的脱磷酸化处理后，再度进行酚/氯仿处理和乙醇沉淀，进行琼脂糖凝胶电泳，通过从琼脂糖凝胶中提取进行再纯化。
使用向pUC118质粒载体中在Hind III限制酶部位连接了约2.0kB至2.6kB片段化的嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的染色体DNA的溶液转化大肠杆菌JM109株，接种在含有50μg/ml的氨苄青霉素、1mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)和2重量％X-GAl(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷)的LB琼脂培养基(0.5重量％细菌用酵母提取物、1重量％细菌用胰蛋白酶胨、0.5重量％NaCl、2.0重量％琼脂；pH7.5)上，于37℃培养过夜。结果可以获得多枚每枚都出现50个至500个白色菌落的平皿。
对于这些染色体DNA的质粒文库使用先前制备的荧光标记DIG探针，进行菌落杂交，筛选含有目的腈水合酶α亚基下游基因的克隆。
②通过菌落杂交获得目的克隆首先将出现的白菌落约1000克隆用灭菌过的牙签在新的LB琼脂培养基上划线。此时，在使膜杂交的L B琼脂培养基以及保存用的LB琼脂培养基上同样划线，于30℃下培养过夜。
然后，在生长菌落的平皿上轻轻放上Amersham公司制的尼龙膜Hybond-N+，1分钟后从边上用镊子慢慢地取出。将剥落的膜按照附着菌体的面向上那样在变性溶液(含有1.5M NaCl的0.5M NaOH水溶液)中浸7分钟后，在中和溶液(含有1.5M NaCl和1mM EDTA·2Na的0.5M Tris盐酸水溶液；pH7.2)中浸泡3分钟，然后再于新的中和溶液中浸泡3分钟。接下来用2×SSC溶液(1升1×SSC中含有NaCl 8.76g、柠檬酸钠4.41g)洗涤1次后，在干的滤纸上将膜风干。再通过进行120mJ/cm2的UV照射，将DNA固定在膜上。
③利用DIG抗体进行检测和目的克隆的分离将上述处理的固定了DNA的膜按照1张膜10ml的比例浸到10ml的杂交缓冲液(含有1重量％脱脂乳、0.1重量％N-月桂酰肌氨酸酯、0.02重量％SDS、50重量％甲酰胺的5×SSC)中，于42℃下进行2小时预杂交。与上述同样，将制备的100ng荧光标记探针于95℃下通过10分钟煮沸和急冷处理使其热变性，添加到预杂交缓冲液中，于42℃下杂交过夜。将杂交后的膜在150ml的含有0.1重量％SDS的2×SSC中于室温下洗2次。然后在加热到65℃的150ml的含有0.1重量％SDS的1×SSC中进行2次5分钟的洗涤。接下来用100ml的马来酸缓冲液(用0.1M马来酸、0.15M NaCl、NaOH调到pH7.5)洗涤5分钟后，在50ml的封闭溶液(含有0.3重量％Tween20、0.15M NaCl和1重量％脱脂乳的0.1M马来酸缓冲液；pH7.5)中，于室温下进行30分钟封闭处理。用20ml的封闭溶液将抗洋地黄毒苷-AP稀释至75mU/ml，于室温下进行30分钟的抗体反应后，在100ml的洗涤缓冲液(含有0.3重量％Tween20、0.15M NaCl的0.1M马来酸缓冲液；pH7.5)中将膜洗5次，将没有结合的抗体冲去。在20ml的检测缓冲液(0.1MTris-HCl、0.1M NaCl、pH9.5)中进行5分钟平衡处理后、制成在10ml的检测缓冲液中含有34μl的100mg/ml的NBT(氮蓝四唑)溶液，35μl的50mg/ml的BCIP溶液的稀释的发色底物溶液NBT/BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸)，将膜完全浸没在该溶液中，避光温育1分钟至16小时。温育中不要使盘移到，也不要摇动，进行发色确认。结果在该膜上的1000个克隆中，发现4处阳性信号，在原来平皿上确认了与该位置重叠的阳性克隆。
(4)含有嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶α亚基部分的下游基因的阳性克隆解析将已确认的阳性克隆从平皿接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃下，以250rpm振荡培养过夜，通过离心回收菌体，利用常规方法提取质粒DNA。将质粒DNA用限制酶Hind III消化后，进行1.5重量％琼脂糖凝胶电泳，确认插入片段的大小约为2.3kB。另外，可以通过PCR多态性和限制酶消化图谱确认插入片段中含有嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶α亚基部分。
将以上获得的质粒命名为pUC118-Q6Hin2.3，测定插入片段的全部碱基序列。嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶和下游基因群的限制酶图和基因构成如图1所示。
由此结果可以确认在插入片段中由339bp的碱基序列构成的开放读框(以下、称为ORF3)存在于腈水合酶α亚基(ORF2)的5’末端侧下游同一方向。ORF2的翻译终止密码子与ORF3的翻译起始密码子之间序列是12bp，ORF3的翻译终止密码子与位于更下游的ORF的翻译起始密码子之间的序列是145bp。ORF3编码112个氨基酸，与已有数据库中的以下蛋白质虽然具有同源性，但非常低。与已有数据库中同源性高的序列的氨基酸的一致率是与芽孢杆菌属BR449株的P12K为31％、与紫红红球菌J1株的NhhG为31％、与紫红红球菌J1株的Nh1E为21％、与嗜热假诺卡氏菌JCM3095株的P16为23％。
实施例14嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶α亚基和β亚基以及下游基因ORF3的表达质粒的构建将pET-26b(+)-βα和pET-28a(+)-βα质粒用限制酶Hind III消化，进行脱磷酸化反应，通过用酚氯仿提取进行脱磷酸化处理。将该消化产物进行1重量％琼脂糖凝胶电泳，通过常规方法提取约6.1Kb的DNA片段。在该DNA片段中含有pET载体以及嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶β亚基和直至位于α亚基的第60位氨基酸的Hind III限制酶部位。
接下来，将pUC118-Q6Hin2.3质粒用限制酶Hind III消化，进行1重量％琼脂糖凝胶电泳，提取约2.3kB的插入片段DNA。将该插入片段与先前提取的片段连接，转化大肠杆菌JM109株，从通过卡那霉素抗性选择的转化子中选出含有插入DNA的质粒。通过PCR确认插入方向，获得在pET-26b(+)和pET-28a(+)载体中含有嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶α亚基以及β亚基以及下游基因ORF3及其下游区的质粒。以下将通过上述操作制备得到的质粒称为pET-26b(+)-βα12和pET-28a(+)-βα12。
然后，导入嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株腈水合酶α亚基、β亚基以及直至下游基因ORF3的翻译终止密码子，构建能使3种蛋白质共表达的表达质粒。将先前构建的质粒pET-26B(+)-βα12用限制酶NdeI和Bg1II消化，进行1.5重量％琼脂糖凝胶电泳，通过常规方法提取含有α亚基、β亚基以及直至下游基因ORF3的翻译终止密码子的1.7kB基因片段。同时将表达载体pET-26b(+)和pET-28a(+)用NdeI和BamHI消化，进行1重量％琼脂糖凝胶电泳，通过常规方法提取5.3kB的载体部分的基因片段。将这些载体与作为插入片段的先前提取的含有α亚基、β亚基以及直至下游基因ORF3的翻译终止密码子的1.7kB基因片段通过常规方法进行连接反应。当进行该反应时，用BglII限制酶消化的末端与用BamHI限制酶消化的末端连接。使用连接反应后的溶液转化大肠杆菌JM109株，从用卡那霉素抗性选择的转化子中提取质粒DNA，选出导入了插入片段的质粒。通过以上操作，可以获得将嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶α亚基、β亚基部分以及下游基因ORF3作为插入片段被导入的、可使3种蛋白质共表达的表达质粒。以下将这些目的质粒称之为pET-26b(+)-βα1和pET-28a(+)-βα1。
实施例15在大肠杆菌中与下游基因共表达的嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶活性用表达质粒pET-26b(+)-βα以及pET-28a(+)-βα转化NOvagene公司的大肠杆菌BL 21(DE3)LysE株，使嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶β亚基和α亚基的蛋白质通过T7启动子共表达。同样使用pET-26b(+)-βα1和pET-28A(+)-βα1转化NOvagene公司的大肠杆菌BL21(DE3)Lyse株，使嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶β亚基、α亚基和下游基因ORF3的蛋白质通过T7启动子共表达。作为对照，使用用表达载体pET-26b(+)和pET-28a(+)转化的NOvagene公司的大肠杆菌BL21(DE3)Lyse株的转化子。
用各个表达质粒转化NOvagene公司制的大肠杆菌BL21(DE3)Lyse株的感受态细胞，将转化处理后的菌液铺在含有30μg/ml的卡那霉素的LB琼脂培养基(0.5重量％细菌用酵母提取物、1重量％培养胰胨、0.5重量％NACl、2.0重量％琼脂；pH7.5)上，于30℃培养过夜，进行卡那霉素抗性选择。将该转化子接种在2ml含有30μg/ml卡那霉素的LB培养基中，于30℃下以200rpm振荡培养过夜。将前培养液按照2重量％接种在含有20μg/ml氯化钴六水合物(COCl2·6H20)和30μg/ml卡那霉素的10ml LB培养基中，于30℃下以200rpm振荡培养约3小时，直至OD600＝0.5为止，添加0.1MM的IPTG，诱导从T7启动子开始的表达，再以200rpm进行约4小时振荡培养，回收菌体。
将这样得到的可表达来自嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶表达的大肠杆菌菌体再悬浮于含有20mM Tris-HCl以及15mM NaCl的TBS缓冲液(pH7.5)，稀释到OD＝0.2，制成终浓度0.2重量％丙烯腈溶液的反应液。于27℃下边搅拌边进行反应，在10分后、30分后通过加100μL的1当量盐酸终止反应。酶活性单位(unit)定义为1分钟内将1μmol丙烯腈转变为丙烯酰胺的活性为1单位(以下、记为U)，每单位湿菌体重量的水合活性(U/mg)如表9所示。
表9
由该结果对只使嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶α亚基以及β亚基表达的情况与使下游基因ORF3共表达的情况进行比较，可知由于有下游基因ORF3的存在，腈水合酶活性可以显著增加。显然ORF3具有使嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶的酶活性显著提高的功能。
实施例16在大肠杆菌中表达的嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株腈水合酶的热稳定性为了研究活性的热稳定性，将带有表达载体pET26b(+)-βα，使嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株腈水合酶表达的大肠杆菌液(含有20mM的Tris-HCl以及15mM的NaCl的TBS缓冲液(pH7.5))于30、65、70度下进行30分钟保温处理。保温处理后、于冰上冷却，保温在27度下使温度一定后，在反应温度27度下测定腈水合酶活性。按照OD＝0.2的浊度悬浮表达嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株腈水合酶的大肠杆菌，制成终浓度0.5重量％丙烯腈溶液的反应液，于27℃下边搅拌边开始反应，30分钟后通过加10液量％的1当量盐酸终止反应。以于30度下进行保温处理时的活性作为基准(100％)的换算值如表10所示。
表10
由该结果可看出，在表达嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q-6株的腈水合酶的大肠杆菌中的腈水合酶酶活性即使在70度的高温下仍能保持80％以上的活性，可以说在大肠杆菌使其表达的情况下也具有高耐热性，是工业上非常有用的酶。
产业上的可利用性本发明的组成物对于热或高浓度的腈、酰胺化合物表现出很高的稳定性，具有可有效地将腈化合物转变为对应的酰胺化合物的效果。本发明的组成物适合应用于即使在高温、和高腈化合物浓度或高酰胺化合物浓度下的反应中也能将腈化合物转变为对应的酰胺化合物的领域中。
序列表<110>旭化成株式会社<120>新型腈水合酶<130>A41354A<160>25<210>1<211>205<212>PRT<213>嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)<223>腈水合酶α-亚基<400>1Met Ser Val Gln Lys Val His His Asn Val Leu Pro Glu Lys Pro Ala1 5 10 15Gln Thr Arg Thr Lys Ala Leu Glu Ser Leu Leu Ile Glu Ser Gly Leu20 25 30Val Ser Thr Asp Ala Leu Asp Ala Ile Ile Glu Ala Tyr Glu Asn Asp35 40 45Ile Gly Pro Met Asn Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ala Trp Val Asp50 55 60Pro Asp Tyr Lys Glu Arg Leu Leu Arg Asp Gly Thr Ser Ala Ile Ala65 70 75 80Glu Leu Gly Phe Leu Gly Leu Gln Gly Glu His Met Val Val Val Glu85 90 95Asn Thr Pro Lys Val His Asn Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys100 105 110Tyr Pro Trp Pro Val Leu Gly Leu Pro Pro Ser Trp Tyr Lys Ser Ala115 120 125Ser Tyr Arg Ala Arg Ile Val Ser Glu Pro Arg Thr Val Leu Lys Glu130 135 140Phe Gly Leu Glu Leu Asp Asp Asp Val Glu Ile Arg Val Trp Asp Ser145 150 155 160Ser Ala Glu Ile Arg Tyr Leu Val Leu Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr165 170 175Glu Gly Trp Ser Glu Glu Glu Leu Ala Lys Leu Val Thr Arg Asp Ser180 185 190Met Ile Gly Val Ala Lys Ile Lys Ser Pro Val Lys Lys195 200 205<210>2<211>226<212>PRT<213>嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌<223>腈水合酶β-亚基<400>2
Met Asn Gly Pro His Asp Leu Gly Gly Lys Arg Asp Phe Gly Pro1 5 10 15Ile Ile Lys His Asp Gln Glu Pro Leu Phe His Glu Glu Trp Glu20 25 30Ala Lys Val Leu Ala Met His Phe Ala Leu Leu Gly Gln Gly Val35 40 45Ile Asn Trp Asp Glu Phe Arg His Gly Ile Glu Arg Met Gly Tyr50 55 60Val Tyr Tyr Leu Thr Ser Ser Tyr Tyr Glu His Trp Leu Ala Ser65 70 75Leu Glu Thr Val Leu Ala Glu Lys Asn Ile Ile Asn Ser Glu Gln80 85 90Tyr Arg Lys Arg Ile Arg Glu Ile Glu Tyr Gly Met Ser Val Pro95 100 105Val Ser Glu Lys Pro Glu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Ser Glu Val110 115 120Ile Tyr Gly Thr Lys Ile Ser Ser Glu Arg Arg Glu Ser Thr Val125 130 135Ser Pro Arg Phe Arg Pro Gly Asp Arg Val Arg Val Lys His Phe140 145 150Tyr Thr Asn Lys His Thr Arg Cys Pro Gln Tyr Val Met Gly Lys155 160 165Val Gly Val Val Glu Leu Leu His Gly Asn His Val Phe Pro Asp170 175 180Ser Asn Ala His Gly Asp Gly Glu Ala Pro Gln Pro Leu Tyr Asn185 190 195Val Arg Phe Glu Ala Arg Glu Leu Trp Gly Gly Glu Ala His Glu200 205 210Lys Asp Ser Leu Asn Leu Asp Leu Trp Asp Ser Tyr Leu Thr His215 220 220Ala226<210>3<211>1663<212>DNA<213>嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌<223>腈水合酶β-亚基，α-亚基，orf3<221>CDS<222>1..681<223>腈水合酶β-亚基<221>CDS<222>695..1312<223>腈水合酶α-亚基
<221>CDS<222>1325..1663<223>orf3<400>3atg aac ggc ccg cac gat tta ggt gga aaa cgt gat ttt ggc cca45Met Asn Gly Pro His Asp Leu Gly Gly Lys Arg Asp Phe Gly Pro1 5 10 15atc att aaa cat gat caa gaa cct ctt ttt cat gaa gaa tgg gaa90Ile Ile Lys His Asp Gln Glu Pro Leu Phe His Glu Glu Trp Glu20 25 30gca aaa gta ctg gcg atg cat ttt gct tta ctt gga caa gga gta135Ala Lys Val Leu Ala Met His Phe Ala Leu Leu Gly Gln Gly Val35 40 45atc aac tgg gat gaa ttt agg cat ggt ata gaa cgg atg gga tat180Ile Asn Trp Asp Glu Phe Arg His Gly Ile Glu Arg Met Gly Tyr50 55 60gtt tat tac ctt act tca agc tat tat gaa cat tgg ctt gct tca225Val Tyr Tyr Leu Thr Ser Ser Tyr Tyr Glu His Trp Leu Ala Ser65 70 75cta gaa acc gta ttg gcc gag aaa aat atc att aac agt gaa cag270Leu Glu Thr Val Leu Ala Glu Lys Asn Ile Ile Asn Ser Glu Gln80 85 90tat aga aag aga att agg gaa ata gaa tat ggc atg agt gta cct315Tyr Arg Lys Arg Ile Arg Glu Ile Glu Tyr Gly Met Ser Val Pro95 100 105gtc agc gaa aag cct gag tta aaa gag tct ttg tta tcc gaa gtg360Val Ser Glu Lys Pro Glu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Ser Glu Val110 115 120atc tat ggc acg aaa ata tca tcc gaa cgg aga gaa agc act gta405Ile Tyr Gly Thr Lys Ile Ser Ser Glu Arg Arg Glu Ser Thr Val125 130 135tct ccg cgg ttt cgt cct gga gat aga gtg agg gta aaa cac ttt450Ser Pro Arg Phe Arg Pro Gly Asp Arg Val Arg Val Lys His Phe140 145 150tat aca aac aag cat act aga tgt cct caa tat gtc atg ggg aaa495Tyr Thr Asn Lys His Thr Arg Cys Pro Gln Tyr Val Met Gly Lys155 160 165gta gga gtt gta gaa ctt ctt cat ggg aat cat gtt ttc cca gac540Val Gly Val Val Glu Leu Leu His Gly Asn His Val Phe Pro Asp170 175 180tct aac gct cat ggt gat ggc gag gct ccg caa ccg ctt tac aat595Ser Asn Ala His Gly Asp Gly Glu Ala Pro Gln Pro Leu Tyr Asn185 190 195gtg cgc ttt gaa gca aga gaa ctg tgg gga ggc gag gct cac gaa630
Val Arg Phe Glu Ala Arg Glu Leu Trp Gly Gly Glu Ala His Glu200 205 210aaa gat agt cta aat ctc gac tta tgg gat agc tat cta act cac675Lys Asp Ser Leu Asn Leu Asp Leu Trp Asp Ser Tyr Leu Thr His215 220 225gcg taa aggaggaaaa atc 694Ala226atg agt gta caa aaa gtt cat cac aac gtt ctg cct gaa aag cct739Met Ser Val Gln Lys Val His His Asn Val Leu Pro Glu Lys Pro1 5 10 15gct caa act cgg aca aag gct ttg gaa tcg ctg ttg atc gaa tct784Ala Gln Thr Arg Thr Lys Ala Leu Glu Ser Leu Leu Ile Glu Ser20 25 30gga ttg gtc tcc act gat gcc ctt gat gcg att att gaa gcc tat829Gly Leu Val Ser Thr Asp Ala Leu Asp Ala Ile Ile Glu Ala Tyr35 40 45gaa aat gat att ggg cct atg aat ggg gca aaa gtt gtt gca aaa874Glu Asn Asp Ile Gly Pro Met Asn Gly Ala Lys Val Val Ala Lys50 55 60gct tgg gtt gat cct gat tac aaa gaa aga ttg ctt cgg gat ggg910Ala Trp Val Asp Pro Asp Tyr Lys Glu Arg Leu Leu Arg Asp Gly65 70 75act tcg gct att gca gag ctt ggc ttt tta ggg ttg cag ggg gag964Thr Ser Ala Ile Ala Glu Leu Gly Phe Leu Gly Leu Gln Gly Glu80 85 90cac atg gtt gtt gtc gaa aat acg cct aaa gtt cat aat gta gta1009His Met Val Val Val Glu Asn Thr Pro Lys Val His Asn Val Val95 100 105gtt tgt acg cta tgt tcc tgc tat ccg tgg cct gtc cta ggc ttg1054Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val Leu Gly Leu110 115 120cct cct tca tgg tat aaa agt gct tca tac agg gct cga att gtt1099Pro Pro Ser Trp Tyr Lys Ser Ala Ser Tyr Arg Ala Arg Ile Val125 130 135tca gag cca aga act gta ctt aaa gag ttt ggg ctt gaa ctg gat1144Ser Glu Pro Arg Thr Val Leu Lys Glu Phe Gly Leu Glu Leu Asp140 145 150gat gat gtt gaa att agg gtt tgg gac agc agt gct gaa att cga1189Asp Asp Val Glu Ile Arg Val Trp Asp Ser Ser Ala Glu Ile Arg155 160 165tat tta gtt ctt cca gaa aga cct gca ggt act gaa ggg tgg tcg1234Tyr Leu Val Leu Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Glu Gly Trp Ser170 175 180
gaa gag gaa ctg gct aaa ctt gta acg cgt gac tct atg atc ggt1279Glu Glu Glu Leu Ala Lys Leu Val Thr Arg Asp Ser Met Ile Gly185 190 195gtg gcc aag ata aag tcg cct gtt aaa aaa taa ggggggacaa aa 1324Val Ala Lys Ile Lys Ser Pro Val Lys Lys200 205atg gtt caa tca aat ctt caa ata aaa ccg gat gag att cta cct1369Met Val Gln Ser Asn Leu Gln Ile Lys Pro Asp Glu Ile Leu Pro1 5 10 15gaa cct agg aga aca gaa aat gag ccg gtt ttt aat tcc ccg tgg1414Glu Pro Arg Arg Thr Glu Asn Glu Pro Val Phe Asn Ser Pro Trp20 25 30gaa gcc cgg att ttt gct atg aca atc aat ttg tat gac aaa aaa1459Glu Ala Arg Ile Phe Ala Met Thr Ile Asn Leu Tyr Asp Lys Lys35 40 45ttc ttt gat tgg gag gac ttt cga caa gga tta ata gct gaa att1504Phe Phe Asp Trp Glu Asp Phe Arg Gln Gly Leu Ile Ala Glu Ile50 55 60gca gtt gcg gac agc ctt cct gag aat gaa cga cca acc tac tac1549Ala Val Ala Asp Ser Leu Pro Glu Asn Glu Arg Pro Thr Tyr Tyr65 70 75gaa agt tgg ctg gcc gct ttg gaa aag ttg tta atc aag gat ggt1594Glu Ser Trp Leu Ala Ala Leu Glu Lys Leu Leu Ile Lys Asp Gly80 85 90ata tta aca aaa gaa caa ata gat gaa cgc act aaa gaa ttg aaa1639Ile Leu Thr Lys Glu Gln Ile Asp Glu Arg Thr Lys Glu Leu Lys95 100 105gaa ggt ata aga aaa agt tgc tag1663Glu Gly Ile Arg Lys Ser Cys110<210>4<211>112<212>PRT<213>嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌<223>ORF3<400>4Met Val Gln Ser Asn Leu Gln Ile Lys Pro Asp Glu Ile Leu Pro Glu1 5 10 15Pro Arg Arg Thr Glu Asn Glu Pro Val Phe Asn Ser Pro Trp Glu Ala20 25 30Arg Ile Phe Ala Met Thr Ile Asn Leu Tyr Asp Lys Lys Phe Phe Asp35 40 45Trp Glu Asp Phe Arg Gln Gly Leu IIe Ala Glu Ile Ala Val Ala Asp50 55 60
Ser Leu Pro Glu Asn Glu Arg Pro Thr Tyr Tyr Glu Ser Trp Leu Ala65 70 75 80Ala Leu Glu Lys Leu Leu Ile Lys Asp Gly Ile Leu Thr Lys Glu Gln85 90 95Ile Asp Glu Arg Thr Lys Glu Leu Lys Glu Gly Ile Arg Lys Ser Cys100 105 110<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增部分嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q6的部分DNA片段的简并PCR引物<400>5gtncaraarg tncaycayaa yg22<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增部分嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q6的部分DNA片段的简并PCR引物<400>6ccncaraarc cngcncarac 20<210>7<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增部分嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q6的部分DNA片段的简并PCR引物<400>7caycancanc ayytncc 17<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增部分嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q6的部分DNA片段的简并PCR引物<400>8acrttrtgrt gnacyttytg nac 23<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增部分嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q6的部分DNA片段的简并PCR引物
<400>9gtytgngcng gyttytgngg 20<210>10<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增部分嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q6的部分DNA片段的简并PCR引物<400>10ggnarrtgnt gntgrtg 17<210>11<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增部分嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q6的部分DNA片段的简并PCR引物<400>11atgaayggnc cncayga 17<210>12<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增部分嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q6的部分DNA片段的简并PCR引物<400>12aarmgngayt tyggncc 17<210>13<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增部分嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q6的部分DNA片段的简并PCR引物<400>13athathaarc aygaycarga rcc 23<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增部分嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q6的部分DNA片段的简并PCR引物<400>14arrtcrtgng gnccrttcat 20<210>15<211>20
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增部分嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q6的部分DNA片段的简并PCR引物<400>15thrtcrtgyt tdatdatngg 20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增部分嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q6的部分DNA片段的简并PCR引物<400>16tcytcytcra araanarngg 20<210>17<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增部分嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q6的部分DNA片段的简并PCR引物<400>17gcgraartcy yccca 15<210>18<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增部分嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q6的部分DNA片段的简并PCR引物<400>18ccartgytcr tarttcc17<210>19<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增部分嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q6的部分DNA片段的简并PCR引物<400>19agatagtcta aatctcgact tatgg 25<210>20<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增部分嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q6的部分DNA片段的简并PCR引物
<400>20atgaacggcc cgcacgattt aggtgg 26<210>21<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增部分嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q6的部分DNA片段的简并PCR引物<400>21catatgaacg gcccgcacga tttaggtgg 29<210>22<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增部分嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌Q6的部分DNA片段的简并PCR引物<400>22cagatcttat tttttaacag gcgactttat cttggcg 37<210>23<211>29<212>PRT<213>嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌<223>腈水合酶α-亚基的N-末端氨基酸序列<400>23Met Ser Val Gln Lys Val His His Asn Val Leu Pro Glu Lys Pro1 5 10 15Ala Gln Thr Arg Thr Lys Ala Leu Glu Ser Leu Leu Ile Glu20 25<210>24<211>25<212>PRT<213>嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌<223>腈水合酶β-亚基的N-末端氨基酸序列<400>24Met Asn Gly Pro His Asp Leu Gly Gly Lys Arg Asp Phe Gly Pro1 5 10 15Ile Ile Lys His Asp Gln Glu Pro Leu Phe20 25<210>25<211>618<212>DNA<213>嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌<223>用于菌落杂交的探针(腈水合酶α-亚基)<400>25
atgagtgtac aaaaagttca tcacaacgtt ctgcctgaaa agcctgctca aactcggaca60aaggctttgg aatcgctgtt gatcgaatct ggattggtct ccactgatgc ccttgatgcg120attattgaag cctatgaaaa tgatattggg cctatgaatg gggcaaaagt tgttgcaaaa180gcttgggttg atcctgatta caaagaaaga ttgcttcggg atgggacttc ggctattgca240gagcttggct ttttagggtt gcagggggag cacatggttg ttgtcgaaaa tacgcctaaa300gttcataatg tagtagtttg tacgctatgt tcctgctatc cgtggcctgt cctaggcttg360cctccttcat ggtataaaag tgcttcatac agggctcgaa ttgtttcaga gccaagaact420gtacttaaag agtttgggct tgaactggat gatgatgttg aaattagggt ttgggacagc480agtgctgaaa ttcgatattt agttcttcca gaaagacctg caggtactga agggtggtcg540gaagaggaac tggctaaact tgtaacgcgt gactctatga tcggtgtggc caagataaag600tcgcctgtta aaaaataa 618
权利要求
1.一种DNA，其特征为所编码的蛋白质具有以下理化性质(a)具有腈水合酶活性；(b)底物特异性以丙烯腈、己二腈、乙腈、异丁腈、n-戊腈、n-丁腈、苄腈、己腈作为底物，表现出活性；(c)分子量作为至少由以下2种亚基构成的蛋白质，各亚基经还原型SDS-聚丙烯酰胺电泳确定的分子量如下亚基α分子量25000±2000亚基β分子量28000±2000(d)热稳定性当将水溶液中的酶于70℃温度下加热30分钟后，残存活性为加热前活性的35％以上；(e)即使用6重量％的丙烯腈作为底物，与6重量％以下底物浓度时相比，活性也没有减少；(f)即使在35重量％的丙烯酰胺水溶液中，仍具有以丙烯腈作为底物的活性。
2.下述(A)或(B)中的任一个DNA(A)特征如下的DNA由编码含有序列号1所示氨基酸序列的α亚基基因和编码含有序列号2所示氨基酸序列的β亚基基因的碱基序列的组合所构成；(B)一种DNA，所编码的蛋白质为在含有序列号1所示氨基酸序列的α亚基和含有序列号2所示氨基酸序列的β亚基的任一个、或两个中各自对1或多个氨基酸进行置换、缺失、添加、翻译后修饰，含有改变的、或没有被改变的α亚基和改变的、或没有被改变的β亚基，且该蛋白质具有腈水合酶活性。
3.下述(C)或(D)中的任一个DNA(C)特征如下的DNA由含有序列号3的第695-1312位序列的DNA和含序列号3的第1-681位序列的DNA的组合所构成；(D)一种DNA，所编码的蛋白质含有α亚基和β亚基，且具有腈水合酶活性，其中，α亚基是由含有序列号3的第695-1312位序列的DNA、或在严格的条件下与该DNA杂交的DNA中的任一个DNA所编码的；β亚基是由含有序列号3的第1-681位序列的DNA、或在严格的条件下与该DNA杂交的DNA中的任一个DNA所编码的；但上述(C)的情况除外。
4.权利要求1～3中任一项所述的DNA，其特征为再组合含有编码序列号4所示氨基酸序列的碱基序列的DNA，或编码特征为对该氨基酸序列中的1或多个氨基酸进行置换、缺失、添加、翻译后修饰、且编码的是与腈水合酶的活化有关的蛋白质的DNA中的任一个DNA。
5.权利要求1～3中任一项所述的DNA，其特征是再组合含有序列号3的1325-1663位序列的DNA、或编码特征为可与该DNA在严格的条件下进行杂交、且编码的是与腈水合酶活化有关的蛋白质的DNA中的任一个DNA。
6.一种DNA，含有编码具有序列号1所示氨基酸序列的腈水合酶α亚基的基因。
7.一种DNA，含有编码具有序列号2所示氨基酸序列的腈水合酶β亚基的基因。
8.一种DNA，其含有特征为与编码具有序列号4所示氨基酸序列的腈水合酶的活化有关的基因。
9.权利要求1～8任一项所述的DNA，其中，该DNA来自于土壤芽孢杆菌(Geobacillus)属。
10.权利要求1～8任一项所述的DNA，其中，该DNA来自于嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)种。
11.权利要求1～8任一项所述的DNA，其中，该DNA来自于嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)Q-6株(FERM BP-08658)。
12.整合有权利要求1～11任一项所述的DNA的重组载体。
13.一种微生物，其为用权利要求1～11任一项所述的DNA转化的微生物、或嗜热葡糖苷酶土壤芽孢杆菌(Geobacillusthermoglucosidasius)Q-6株(FERM BP-08658)以及其变异体中的任一种微生物。
14.一种蛋白质、或含有该蛋白质的菌体处理物的制造方法，其特征为在培养基中培养用权利要求1～11任一项所述的DNA转化的微生物。
15.一种蛋白质、或含有该蛋白质的菌体处理物的制造方法，其特征为在培养基中培养属于土壤芽孢杆菌属的微生物，且该微生物可以生产具有下述理化性质的蛋白质(a)具有腈水合酶活性；(b)底物特异性以丙烯腈、己二腈、乙腈、异丁腈、n-戊腈、n-丁腈、苄腈、己腈作为底物表现出活性；(c)分子量作为至少由以下2种亚基构成的蛋白质，各亚基经还原型SDS-聚丙烯酰胺电泳确定的分子量如下亚基α分子量25000±2000亚基β分子量28000±2000(d)热稳定性当将水溶液中的酶于70℃温度下加热30分钟后，残存活性为加热前活性的35％以上；(e)即使用6重量％的丙烯腈作为底物，与6重量％以下底物浓度时相比，活性也没有减少；(f)即使在35重量％的丙烯酰胺水溶液中，仍具有以丙烯腈作为底物的活性。
16.一种蛋白质、或含有该蛋白质的菌体处理物，其是从通过权利要求14或权利要求15所述的任一种制造方法培养的微生物中获得的。
17.一种蛋白质，其特征为具有如下理化性质(a)具有腈水合酶活性；(b)底物特异性以丙烯腈、己二腈、乙腈、异丁腈、n-戊腈、n-丁腈、苄腈、己腈作为底物表现出活性；(c)分子量作为至少由以下2种亚基构成的蛋白质，各亚基经还原型SDS-聚丙烯酰胺电泳确定的分子量如下亚基α分子量25000±2000亚基β分子量28000±2000(d)热稳定性当将水溶液中的酶于70℃温度下加热30分钟后，残存活性为加热前活性的35％以上；(e)即使用6重量％的丙烯腈作为底物，与6重量％以下底物浓度时相比，活性也没有减少；(f)即使在35重量％的丙烯酰胺水溶液中，仍具有以丙烯腈作为底物的活性。
18.下述(A)或(B)中任一种蛋白质(A)特征为含有α亚基和β亚基的蛋白质，其中，α亚基含有序列号1所示氨基酸序列，β亚基含有序列号2所示氨基酸序列；(B)在序列号1所示氨基酸序列的α亚基和含有序列号2所示氨基酸序列的β亚基中的任一个、或两个中各自对1或多个氨基酸进行置换、缺失、添加、翻译后修饰，含有由经改变、或没有被改变的α亚基和改变的、或没有被改变的β亚基，且具有腈水合酶活性的蛋白质。
19.下述(C)或(D)中的任一种蛋白质(C)特征为含有α亚基和β亚基的蛋白质，其中，α亚基是由具有序列号3的695-1312位序列的DNA编码的，β亚基是由具有序列号3的1-681位序列的DNA编码的；(D)含有α亚基和β亚基且具有腈水合酶活性的蛋白质，其中α亚基是由具有序列号3的695-1312位序列的DNA编码的；β亚基是由具有序列号3的1-681位序列的DNA，或在严格的条件下与该DNA进行杂交的DNA中的任一个DNA编码的；但上述(C)的情况除外。
20.具有如下特征的蛋白质至少包含含有α亚基的多肽或其翻译后的被修饰物以及含有β亚基的多肽或其翻译后的被修饰物中的任一个，或两者，其中，α亚基为序列号1所示氨基酸序列，β亚基是序列表中的序列号2所示氨基酸序列。
21.酰胺化合物的制造方法，其特征是将具有如下理化性质的蛋白质、或含有该蛋白质的菌体处理物作用于腈化合物，获得由该腈化合物衍生的酰胺化合物，所说的理化性质包括(a)具有腈水合酶活性；(b)底物特异性以丙烯腈、己二腈、乙腈、异丁腈、n-戊腈、n-丁腈、苄腈、己腈作为底物表现出活性；(c)分子量作为至少由以下2种亚基构成的蛋白质，各亚基经还原型SDS-聚丙烯酰胺电泳确定的分子量如下亚基α分子量25000±2000亚基β分子量28000±2000(d)热稳定性当将水溶液中的酶于70℃温度下加热30分钟后，残存活性为加热前的35％以上；(e)即使用6重量％的丙烯腈作为底物，与6重量％以下底物浓度时相比，活性也没有减少；(f)即使在35重量％的丙烯酰胺水溶液中，仍具有以丙烯腈作为底物的活性。
22.酰胺化合物的制造方法，其特征是在培养基中培养用权利要求1～11中任一项所述的DNA转化的微生物、或属于土壤芽孢杆菌属的可生产具有下述理化性质的蛋白质的微生物中的任一种所得到的蛋白质、或含有该蛋白质的菌体处理物，所说的理化性质包括(a)具有腈水合酶活性；(b)底物特异性以丙烯腈、己二腈、乙腈、异丁腈、n-戊腈、n-丁腈、苄腈、己腈作为底物，表现出活性；(c)分子量作为至少由以下2种亚基构成的蛋白质，各亚基经还原型SDS-聚丙烯酰胺电泳确定的分子量如下亚基α分子量25000±2000亚基β分子量28000±2000(d)热稳定性当将水溶液中酶于70℃温度下加热30分钟后，剩余活性为加热前的35％以上；(e)即使用6重量％的丙烯腈作为底物，与6重量％以下底物浓度时相比，活性也没有减少；(f)即使在35重量％的丙烯酰胺水溶液中，仍具有以丙烯腈作为底物的活性。
全文摘要
本发明的目的在于提供使用除了保持热稳定性之外，还能在作为底物的腈化合物或作为生成物的酰胺化合物的高浓度存在下也保持高活性的腈水合酶制造酰胺化合物的方法。本发明在对来自于自然界的表达目的腈水合酶的新的微生物进行探索，在制备该微生物菌体以及该菌体处理物的同时，还克隆了该基因，制备了用异种微生物进行表达的重组微生物。如果利用本发明，即使在高温条件下、以及高浓度的腈化合物或高浓度的酰胺化合物存在下的反应中也可以有效地将腈化合物转变为酰胺化合物。
文档编号C12N15/09GK1806047SQ200480016170
公开日2006年7月19日 申请日期2004年6月10日 优先权日2003年6月10日
发明者古家加夫留, 玉木彰, 长泽伸一郎, 铃木绫乃 申请人:旭化成株式会社