腈水合酶突变体的制作方法

专利名称：腈水合酶突变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种腈水合酶突变体、编码该腈水合酶突变体的基因、含有该基因的 DNA、含有该基因的质粒、由该质粒形成的转化体以及使用该转化体生产腈水合酶突变体的方法。
背景技术：
近年来，已经发现了作为具有腈水合活性的酶的腈水合酶，该酶能够通过水合作用将各种化合物的腈基转变成酰胺基，并且公开了多种生产该酶的微生物株。为了在工业上使用腈水合酶从腈化合物制造酰胺化合物，降低酰胺化合物的制造成本中所占的该酶的制造成本是重要的。更具体而言，必须提高酶制备物的每单位重量的活性值。作为通过增加酶制备物中的酶量提高活性值的方法，已尝试对编码该酶的基因进行克隆，利用基因工程方法使该酶大量表达。例如，已制备出可使来源于嗜热假诺卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)的腈水合酶在转化体内大量表达的质粒及通过该质粒进行转化而得到的细胞株。此外，可以利用该细胞株来生产该腈水合酶，以及可以通过将该细胞株或由该细胞株得到的该腈水合酶与腈化合物接触来制造对应的酰胺化合物(参见专利文献1)。另一方面，如果能实现酶分子自身的高活化，则可以进一步提高酶制备物的活性值。到目前为止，正尝试探索下述腈水合酶突变体，该突变体通过在不破坏其活性的情况下对腈水合酶的氨基酸序列中的特定氨基酸残基导入突变，而使基质特异性、酶稳定性等得到改良(参见专利文献2 4)。需要说明的是，作为来源于紫红红球菌的腈水合酶突变体，有专利文献5、6中所记载的腈水合酶突变体。专利文献1 日本特开平9-275978号公报专利文献2 日本特开2004-194588号公报专利文献3 日本特开2005-160403号公报专利文献4 国际公开第2004/056990号说明书专利文献5 日本特开2007-143409号公报专利文献6 日本特开2008-253182号公报

发明内容
但是，与专利文献1中记载的野生型腈水合酶相比、其反应初速度及酶稳定性同时提高的具体突变体尚属未知。期待可以通过使反应初速度及酶稳定性同时提高来削减酰胺化合物的制造成本。本发明的目的在于提供一种具有高的反应初速度及酶稳定性的腈水合酶。S卩，本发明如下所述。
[1] 一种腈水合酶突变体，其特征在于，包含至少1个氨基酸取代为其他氨基酸的取代，所述取代通过3个以下1个以上氨基酸取代而改善腈水合酶的2个以上的性质。[2]如[1]所述的腈水合酶突变体，其特征在于，所述被改善的性质为反应初速度及热稳定性。[3]如[1]或[2]所述的腈水合酶突变体，其特征在于，含有序列表的序列号1表示的α亚单位和序列表的序列号2表示的β亚单位，并且含有选自由下述(a) (1)组成的氨基酸取代位置中的至少1个氨基酸取代为其他氨基酸的取代(a) α亚单位的第92位；(b) α亚单位的第94位；(c) α亚单位的第197位；(d) β亚单位的第4位；(Θ)β亚单位的第对位；(f) β亚单位的第79位；(g) β亚单位的第96位；(h) β亚单位的第107位；⑴β亚单位的第2 位；(j) β亚单位的第110位及β亚单位的第231位；(k) β亚单位的第206位及β亚单位的第230位；(1) α亚单位的第13位、α亚单位的第27位、及β亚单位的第110位。[4]如[3]所述的腈水合酶突变体，其特征在于，进一步包含选自由下述(m) (u)组成的氨基酸取代位置中的至少1个氨基酸取代为其他氨基酸的取代(m)为(b)或(g)时，α亚单位的第13位；(η)为(b)或(h)时，α亚单位的第27位；(ο) (d)及(f)；(ρ)为(f)时，β亚单位的第230位；(q) (a)及(i)；(r)为(i)时，α亚单位的第13号及β亚单位的第206位；(s)为(a)及(d)时，β亚单位的第206位；(t)为(c)及(h)时，β亚单位的第230位；(u)为(f)时，β亚单位的第230位及β亚单位的第231位。[5]如[3]所述的腈水合酶突变体，其特征在于，为(e)时，进一步包含选自由 (a)、(c)、(f)、⑴、(h)、β亚单位的第230位、及β亚单位的第231位组成的组中的至少 1个氨基酸取代为其他氨基酸的取代。[6]如[1] [5]中任一项所述的腈水合酶突变体，其特征在于α亚单位的第13位氨基酸被取代时，Ile被取代为Leu ；α亚单位的第27位氨基酸被取代时，Met被取代为Ile ；α亚单位的第92位氨基酸被取代时，Asp被取代为Glu ；α亚单位的第94位氨基酸被取代时，Met被取代为Ile ；α亚单位的第197位氨基酸被取代时，Gly被取代为Cys ；
β亚单位的第4位氨基酸被取代时，Val被取代为Met ；β亚单位的第M位氨基酸被取代时，Val被取代为Ile ；β亚单位的第79位氨基酸被取代时，His被取代为Asn ；β亚单位的第96位氨基酸被取代时，Gln被取代为Arg ；β亚单位的第107位氨基酸被取代时，Pro被取代为Met ；β亚单位的第110位氨基酸被取代时，Glu被取代为Asn ；β亚单位的第206位氨基酸被取代时，Pro被取代为Leu ；β亚单位的第2 位氨基酸被取代时，Val被取代为Ile ；β亚单位的第230位氨基酸被取代时，Ala被取代为Glu ；β亚单位的第231位氨基酸被取代时，Ala被取代为Val。[7]如[3] [6]中任一项所述的腈水合酶突变体，其特征在于，进一步包含选自由下述(aa) (br)组成的氨基酸取代中的至少1个氨基酸取代(aa)将α亚单位的第36位的Thr取代为Met、及将α亚单位的第1 位的Phe 取代为Tyr ；(ab)将α亚单位的第148位的Gly取代为Asp、及将α亚单位的第204位的Val 取代为Arg ；(ac)将β亚单位的第51位的Phe取代为Val、及将β亚单位的第108位的Glu 取代为Asp ；(ad)将β亚单位的第118位的Phe取代为Val、及将β亚单位的第200位的Ala 取代为Glu ；(ae)将β亚单位的第160位的Arg取代为Trp、及将β亚单位的第186位的Leu 取代为Arg ；(af)将α亚单位的第6位的Leu取代为Ilirjf α亚单位的第36位的Thr取代为Met、及将α亚单位的第1 位的Phe取代为Tyr ；(ag)将α亚单位的第19位的Ala取代为Valjf α亚单位的第71位的Arg取代为His、及将α亚单位的第1 位的Phe取代为Tyr ；(ah)将α亚单位的第36位的Thr取代为Met、将α亚单位的第148位的Gly取代为Asp、及将α亚单位的第204位的Val取代为Arg ；(ai)将β亚单位的第10位的Ilir取代为Asp、将β亚单位的第118位的Phe取代为Val、及将β亚单位的第200位的Ala取代为Glu ；(aj)将β亚单位的第37位的Phe取代为Leu、将β亚单位的第108位的Glu取代为Asp、及将β亚单位的第200位的Ala取代为Glu ；(ak)将β亚单位的第37位的Phe取代为Valjf β亚单位的第108位的Glu取代为Asp、及将β亚单位的第200位的Ala取代为Glu ；(al)将β亚单位的第41位的Phe取代为lie、将β亚单位的第51位的Phe取代为Val、及将β亚单位的第108位的Glu取代为Asp ；(am)将β亚单位的第46位的Met取代为Lysjf β亚单位的第108位的Glu取代为Arg、及将β亚单位的第212位的Ser取代为Tyr ；(an)将β亚单位的第48位的Leu取代为Valjf β亚单位的第108位的Glu取代为Arg、及将β亚单位的第212位的Ser取代为Tyr ；(ao)将β亚单位的第127位的Leu取代为kr、将β亚单位的第160位的Arg 取代为iTrp、及将β亚单位的第186位的Leu取代为Arg ；(ap)将α亚单位的第6位的Leu取代为Thrjf α亚单位的第19位的Ala取代为Valdf α亚单位的第1 位的Phe取代为Tyrjf β亚单位的第46位的Met取代为 Lysjf β亚单位的第108位的Glu取代为Arg、及将β亚单位的第212位的Ser取代为 Tyr ；(aq)将α亚单位的第6位的Leu取代为Ilirjf α亚单位的第19位的Ala取代为Val、将α亚单位的第1 位的Phe取代为Tyrjf β亚单位的第48位的Leu取代为 ValJf β亚单位的第108位的Glu取代为Arg、及将β亚单位的第212位的Ser取代为 Tyr ；(ar)将α亚单位的第6位的Leu取代为Ala、将α亚单位的第19位的Ala取代为Valjf α亚单位的第1 位的Phe取代为Tyrjf β亚单位的第127位的Leu取代为 kr、将β亚单位的第160位的Arg取代为Trp、及将β亚单位的第186位的Leu取代为 Arg ；(as)将α亚单位的第6位的Leu取代为Ilirjf α亚单位的第36位的Thr取代为Met、将α亚单位的第1 位的Phe取代为Tyrjf β亚单位的第10位的Thr取代为 Asp、将β亚单位的第118位的Phe取代为Val、及将β亚单位的第200位的Ala取代为 Glu ；(at)将α亚单位的第19位的Ala取代为Val、将α亚单位的第71位的Arg取代为His、将α亚单位的第1 位的Phe取代为Tyrjf β亚单位的第37位的Phe取代为 Leu、将β亚单位的第108位的Glu取代为Asp、及将β亚单位的第200位的Ala取代为 Glu ；(au)将α亚单位的第19位的Ala取代为Val、将α亚单位的第71位的Arg取代为His、将α亚单位的第1 位的Phe取代为Tyrjf β亚单位的第37位的Phe取代为 Val、将β亚单位的第108位的Glu取代为Asp、及将β亚单位的第200位的Ala取代为 Glu ；(av)将α亚单位的第36位的Thr取代为Met、将α亚单位的第148位的Gly取代为Asp、将α亚单位的第204位的Val取代为Arg、将β亚单位的第41位的Phe取代为lie、将β亚单位的第51位的Phe取代为Val、及将β亚单位的第108位的Glu取代为 Asp ；(aw)将α亚单位的第148位的Gly取代为Asp、将α亚单位的第204位的Val取代为Arg、将β亚单位的第108位的Glu取代为Asp、及将β亚单位的第200位的Ala取代为Glu ；(ax)将α亚单位的第36位的Thr取代为Gly、及将α亚单位的第188位的Thr 取代为Gly ；(ay)将α亚单位的第36位的Thr取代为Ala、及将α亚单位的第48位的Asn 取代为Gln ；(az)将α亚单位的第48位的Asn取代为Glu、及将β亚单位的第146位的Arg
14取代为Gly ；(ba)将α亚单位的第36位的Thr取代为Trp、及将β亚单位的第176位的Tyr 取代为Cys ；(bb)将β亚单位的第176位的Tyr取代为Met、及将β亚单位的第217位的Asp 取代为Gly ；(be)将α亚单位的第36位的Thr取代为kr、及将β亚单位的第33位的Ala 取代为Val ；(bd)将β亚单位的第176位的Tyr取代为Ala、及将β亚单位的第217位的Asp 取代为Val ；(be)将β亚单位的第40位的Thr取代为Val、及将β亚单位的第218位的Cys 取代为Met ；(bf)将β亚单位的第33位的Ala取代为Met、及将β亚单位的第176位的Tyr 取代为iThr ；(bg)将β亚单位的第40位的Thr取代为Leu、及将β亚单位的第217位的Asp 取代为Leu ；(bh)将β亚单位的第40位的Thr取代为lie、及将β亚单位的第61位的Ala 取代为Val ；(bi)将β亚单位的第61位的Ala取代为Thr、及将β亚单位的第218位的Cys 取代为；(bj)将β亚单位的第112位的Lys取代为Val、及将β亚单位的第217位的Asp 取代为Met ；(bk)将β亚单位的第61位的Ala取代为Trp、及将β亚单位的第217位的Asp 取代为His ；(bl)将β亚单位的第61位的Ala取代为Leu、及将β亚单位的第112位的Lys 取代为Ile ；(bm)将β亚单位的第146位的Arg取代为Gly、及将β亚单位的第217位的Asp 取代为；(bn)将β亚单位的第171位的Lys取代为Ala、及将β亚单位的第217位的Asp 取代为iThr ；(bo)将β亚单位的第150位的Ala取代为kr、及将β亚单位的第217位的Asp 取代为Cys ；(bp)将β亚单位的第61位的Ala取代为Gly、及将β亚单位的第150位的Ala 取代为Asn ；(bq)将β亚单位的第61位的Ala取代为kr、及将β亚单位的第160位的Arg 取代为Met ；(br)将β亚单位的第160位的Arg取代为Cys、及将β亚单位的第168位的Thr 取代为Glu。[8] 一种编码[1] [7]中任一项所述的腈水合酶突变体的基因。[9] 一种编码腈水合酶突变体的基因，其包含序列表的序列号3表示的编码α亚单位的基因和序列表的序列号4表示的编码β亚单位的基因，其特征在于，包含选自由下
述(a) (1)组成的碱基取代位置中的至少1个的碱基取代，
(a)序列号:3的碱基序列的第274位-、第276位；
(b)序列号3的碱基序列的第280位-、第282位；
(C)序列号:3的碱基序列的第589位-、第591位；
(d)序列号:4的碱基序列的第10位 第12位；
(e)序列号4的碱基序列的第69位 第71位；
(f)序列号:4的碱基序列的第235位-、第M7位；
(g)序列号4的碱基序列的第286位-、第观8位；
(h)序列号:4的碱基序列的第319位-、第321位；
⑴序列号4的碱基序列的第676位-、第678位；
(J)序列号4的碱基序列的第3 位 第330位、及序列号693位
(k)序列号4的碱基序列的第616位 第618位、及序列号688 位- 第690位；
(1)序列号:3的碱基序列的第37位 第39位、及序列号3
,第
-步包含选自由
位 第81位、及序列号4的碱基序列的第3 位 第330位。[10]如[9]所述的编码腈水合酶突变体的基因，其特征在于，进-下述(m) (u)组成的碱基取代位置中的至少1个碱基取代(m)为(b)或(g)时，序列号3的碱基序列的第37位 第39位；(η)为(b)或(h)时，序列号3的碱基序列的第79位 第81位；(ο) (d)及(f)；(ρ)为(f)时，序列号4的碱基序列的第688位 690位；(q) (a)及⑴；(r)为⑴时，序列号3的碱基序列的第37 39位及序列号4的碱基序列的第 616位 第618位；(s)为(a)及(d)时，序列号4的碱基序列的第616位 第618位；(t)为(c)及(h)时，序列号4的碱基序列的第688位 第690位；(u)为(f)时，序列号4的碱基序列的第688位 第690位、及序列号4的碱基序列的第691位 第693位。[11]如[9]所述的编码腈水合酶突变体的基因，其特征在于，为(e)时，进一步包含选自由(a)、(c)、(f)、⑴、(h)、序列号4的碱基序列的第688位 第690位、及序列号 4的碱基序列的第691位 第693位组成的碱基取代位置中的至少1个碱基取代为其他碱基的取代。[12]如[9] [11]中任一项所述的编码腈水合酶突变体的基因，其特征在于序列号3的碱基序列的第37位 第39位被碱基取代时，ATC被取代为CTC ；序列号3的碱基序列的第79位 第81位被碱基取代时，ATG被取代为ATC ；序列号3的碱基序列的第274位 第276位被碱基取代时，GAC被取代为GAG ；序列号3的碱基序列的第280位 第282位被碱基取代时，ATG被取代为ATC ；
序列号3的碱基序列的第589位 第591位被碱基取代吋，GGC被取代为TGC ；序列号4的碱基序列的第10位 第12位被碱基取代吋，GTG被取代为ATG ；序列号4的碱基序列的第69位 第71位被碱基取代吋，GTC被取代为ATC ；序列号4的碱基序列的第235位 第237位被碱基取代吋，CAC被取代为AAC ；序列号4的碱基序列的第286位 第288位被碱基取代吋，CAG被取代为CGT ；序列号4的碱基序列的第319位 第321位被碱基取代吋，CCC被取代为ATG ；序列号4的碱基序列的第3 位 第330位被碱基取代吋，GAG被取代为AAC ；序列号4的碱基序列的第616位 第618位被碱基取代吋，CCG被取代为CTG ；序列号4的碱基序列的第676位 第678位被碱基取代吋，GTC被取代为ATC ；序列号4的碱基序列的第688位 第690位被碱基取代吋，GCG被取代为GAG ；序列号4的碱基序列的第691位 第693位被碱基取代吋，GCC被取代为GTC。[13]如[9] [12]中任一项所述的编码腈水合酶突变体的基因，其特征在干，包 含选自由下述(aa) (br)組成的碱基取代位置中的至少1个碱基取代，且具有腈水合酶 活性(aa)将序列号3的碱基序列的第106位 第108位的ACG取代为ATG、及将序列 号3的碱基序列的第376位 第378位的TTC取代为TAC ；(ab)将序列号3的碱基序列的第442位 第444位的GGC取代为GAC、及将序列 号3的碱基序列的第610位 第612位的GTC取代为CGC ；(ac)将序列号4的碱基序列的第151位 第153位的TTC取代为GTC、及将序列 号4的碱基序列的第322位 第3M位的GAG取代为GAT ；(ad)将序列号4的碱基序列的第352位 第3M位的TTC取代为GTC、及将序列 号4的碱基序列的第598位 第600位的GCC取代为GAG ；(ae)将序列号4的碱基序列的第478位 第480位的CGG取代为TGG、及将序列 号4的碱基序列的第556位 第558位的CTG取代为CGG ；(af)将序列号3的碱基序列的第16位 第18位的CTG取代为ACG、将序列号3 的碱基序列的第106位 第108位的ACG取代为ATG、及将序列号3的碱基序列的第376 位 第378位的TTC取代为TAC ；(ag)将序列号3的碱基序列的第55位 第57位的GCG取代为GTG、将序列号3 的碱基序列的第211位 第213位的CGT取代为CAT、及将序列号3的碱基序列的第376 位 第378位的TTC取代为TAC ；(ah)将序列号3的碱基序列的第106位 第108位的ACG取代为ATG、将序列号 3的碱基序列的第442位 第444位的GGC取代为GAC、及将序列号3的碱基序列的第610 位 第612位的GTC取代为CGC ；(ai)将序列号4的碱基序列的第28位 第30位的ACC取代为GAC、将序列号4 的碱基序列的第352位 第3M位的TTC取代为GTC、及将序列号4的碱基序列的第598 位 第600位的GCC取代为GAG ；(aj)将序列号4的碱基序列的第109位 第111位的TTC取代为CTC、将序列号 4的碱基序列的第322位 第3M位的GAG取代为GAT、及将序列号4的碱基序列的第598 位 第600位的GCC取代为GAG ；
(ak)将序列号4的碱基序列的第109位 第111位的TTC取代为GTC、将序列号 4的碱基序列的第322位 第3 位的GAG取代为GAT、及将序列号4的碱基序列的第598 位 第600位的GCC取代为GAG ；(al)将序列号4的碱基序列的第121位 第123位的TTC取代为ATC、将序列号 4的碱基序列的第151位 第153位的TTC取代为GTC、及将序列号4的碱基序列的第322 位 第3 位的GAG取代为GAT ；(am)将序列号4的碱基序列的第136位 第138位的ATG取代为AAG、将序列号 4的碱基序列的第322位 第3 位的GAG取代为CGG、及将序列号4的碱基序列的第634 位 第636位的TCC取代为TAC ；(an)将序列号4的碱基序列的第142位 第144位的CTG取代为GTG、将序列号 4的碱基序列的第322位 第3 位的GAG取代为CGG、及将序列号4的碱基序列的第634 位 第636位的TCC取代为TAC ；(ao)将序列号4的碱基序列的第379位 第381位的CTG取代为TCG、将序列号 4的碱基序列的第478位 第480位的CGG取代为TGG、及将序列号4的碱基序列的第556 位 第558位的CTG取代为CGG ；(ap)将序列号3的碱基序列的第16位 第18位的CTG取代为ACG、将序列号 3的碱基序列的第55位 第57位的GCG取代为GTG、将序列号3的碱基序列的第376位 第378位的TTC取代为TAC、将序列号4的碱基序列的第136位 第138位的ATG取代为 AAG、将序列号4的碱基序列的第322位 第3M位的GAG取代为CGG、及将序列号4的碱基序列的第634位 第636位的TCC取代为TAC ；(aq)将序列号3的碱基序列的第16位 第18位的CTG取代为ACG、将序列号3 的碱基序列的第阳位 第57位的GCG取代为GTG、将序列号3的碱基序列的第376位 第378位的TTC取代为TAC、将序列号4的碱基序列的第142位 第144位的CTG取代为 GTG、将序列号4的碱基序列的第322位 第3M位的GAG取代为CGG、及将序列号4的碱基序列的第634位 第636位的TCC取代为TAC ；(ar)将序列号3的碱基序列的第16位 第18位的CTG取代为GCG、将序列号3 的碱基序列的第阳位 第57位的GCG取代为GTG、将序列号3的碱基序列的第376位 第378位的TTC取代为TAC、将序列号4的碱基序列的第379位 第381位的CTG取代为 TCG、将序列号4的碱基序列的第478位 第480位的CGG取代为TGG、及将序列号4的碱基序列的第556位 第558位的CTG取代为CGG ；(as)将序列号3的碱基序列的第16位 第18位的CTG取代为ACG、将序列号 3的碱基序列的第106位 第108位的ACG取代为ATG、将序列号3的碱基序列的第376 位 第378位的TTC取代为TAC、将序列号4的碱基序列的第28位 第30位的ACC取代为GAC、将序列号4的碱基序列的第352位 第3M位的TTC取代为GTC、及将序列号4的碱基序列的第598位 第600位的GCC取代为GAG ；(at)将序列号3的碱基序列的第55位 第57位的GCG取代为GTG、将序列号 3的碱基序列的第211位 第213位的CGT取代为CAT、将序列号3的碱基序列的第376 位 第378位的TTC取代为TAC、将序列号4的碱基序列的第109位 第111位的TTC取代为CTC、将序列号4的碱基序列的第322位 第3 位的GAG取代为GAT、及将序列号4的碱基序列的第598位 第600位的GCC取代为GAG ；(au)将序列号3的碱基序列的第55位 第57位的GCG取代为GTG、将序列号 3的碱基序列的第211位 第213位的CGT取代为CAT、将序列号3的碱基序列的第376 位 第378位的TTC取代为TAC、将序列号4的碱基序列的第109位 第111位的TTC取代为GTC、将序列号4的碱基序列的第322位 第3 位的GAG取代为GAT、及将序列号4 的碱基序列的第598位 第600位的GCC取代为GAG ；(av)将序列号3的碱基序列的第106位 第108位的ACG取代为ATG、将序列号 3的碱基序列的第442位 第444位的GGC取代为GAC、将序列号3的碱基序列的第610 位 第612位的GTC取代为CGC、将序列号4的碱基序列的第121位 第123位的TTC取代为ATC、将序列号4的碱基序列的第151位 第153位的TTC取代为GTC、及将序列号4 的碱基序列的第322位 第3M位的GAG取代为GAT ；(aw)将序列号3的碱基序列的第442位 第444位的GGC取代为GAC、将序列号 3的碱基序列的第610位 第612位的GTC取代为CGC、将序列号4的碱基序列的第322 位 第3M位的GAG取代为GAT、及将序列号4的碱基序列的第598位 第600位的GCC 取代为GAG ；(ax)将序列号3的碱基序列的第106位 第108位的ACG取代为号3的碱基序列的第562位 第564位的ACC取代为GGC ；(ay)将序列号3的碱基序列的第106位 第108位的ACG取代为号3的碱基序列的第142位 第144位的AAC取代为CAA ；(az)将序列号3的碱基序列的第142位 第144位的AAC取代为号4的碱基序列的第436位 第438位的CGG取代为GGG ；(ba)将序列号3的碱基序列的第106位 第108位的ACG取代为号4的碱基序列的第5 位 第5 位的TAC取代为TGC ；(bb)将序列号4的碱基序列的第526位 第5 位的TAC取代为号4的碱基序列的第649位 第651位的GAC取代为GGC ；(be)将序列号3的碱基序列的第106位 第108位的ACG取代为号4的碱基序列的第97位 第99位的GCG取代为GTG ；(bd)将序列号4的碱基序列的第526位 第5 位的TAC取代为号4的碱基序列的第649位 第651位的GAC取代为GTC ；(be)将序列号4的碱基序列的第118位 第120位的ACG取代为号4的碱基序列的第652位 第6M位的TGC取代为ATG ；(bf)将序列号4的碱基序列的第97位 第99位的GCG取代为ATG、及将序列号 4的碱基序列的第5 位 第5 位的TAC取代为ACC ；(bg)将序列号4的碱基序列的第118位 第120位的ACG取代为CTG、及将序列号4的碱基序列的第649位 第651位的GAC取代为CTC ；(bh)将序列号4的碱基序列的第118位 第120位的ACG取代为ATT、及将序列号4的碱基序列的第181位 第183位的GCC取代为GTC ；(bi)将序列号4的碱基序列的第181位 第183位的GCC取代为ACG、及将序列号4的碱基序列的第652位 第6M位的TGC取代为TCC ；
GGG、及将序列 GCG、及将序列 GAA、及将序列 TGG、及将序列 ATG、及将序列 TCG、及将序列 GCC、及将序列 GTG、及将序列
(bj)将序列号4的碱基序列的第334位 第336位的AAG取代为GTG、及将序列号4的碱基序列的第649位 第651位的GAC取代为ATG ；(bk)将序列号4的碱基序列的第181位 第183位的GCC取代为TGG、及将序列号4的碱基序列的第649位 第651位的GAC取代为CAC ；(bl)将序列号4的碱基序列的第181位 第183位的GCC取代为CTC、及将序列号4的碱基序列的第334位 第336位的AAG取代为ATT ；(bm)将序列号4的碱基序列的第436位 第438位的CGG取代为GGG、及将序列号4的碱基序列的第649位 第651位的GAC取代为AGC ；(bn)将序列号4的碱基序列的第511位 第513位的AAG取代为GCG、及将序列号4的碱基序列的第649位 第651位的GAC取代为ACC ；(bo)将序列号4的碱基序列的第448位 第450位的GCG取代为TCG、及将序列号4的碱基序列的第649位 第651位的GAC取代为TGT ；(bp)将序列号4的碱基序列的第181位 第183位的GCC取代为GGC、及将序列号4的碱基序列的第448位 第450位的GCG取代为AAT ；(bq)将序列号4的碱基序列的第181位 第183位的GCC取代为TCG、及将序列号4的碱基序列的第478位 第480位的CGG取代为ATG ；(br)将序列号4的碱基序列的第478位 第480位的CGG取代为TGT、及将序列号4的碱基序列的第502位 第504位的ACG取代为GAG。[14] 一种被连接的DNA，所述DNA在[9] [13]中任一项所述的编码腈水合酶突变体的基因的5’末端上游进一步包含含有基因表达所必需的启动子序列的DNA，并且在该启动子的3’末端的下游包含序列号7中所包含的核糖体结合序列。[15] 一种质粒，含有[14]所述的DNA0[16] 一种转化体，是利用[15]所述的质粒将宿主细胞进行转化而得到的。[17] 一种腈水合酶突变体的生产方法，其特征在于，包括下述步骤将[16]中所述的转化体在培养基中进行培养，在该转化体中生产基于质粒所含有的腈水合酶基因的腈水合酶突变体。根据本发明，在含有序列表的序列号1表示的α亚单位和序列表的序列号2表示的β亚单位的腈水合酶中，包含选自由上述(a) (1)组成的氨基酸取代位置中的至少一个氨基酸被取代为其他氨基酸的取代。由此，可以同时提高腈水合酶的反应初速度及酶稳定性，提高酶制备物的每单位重量的活性值，同时可降低在工业利用中由温度变化等引起的酶失活的风险。因此，能够以更少的酶量稳定地生产酰胺化合物，由此可以降低酰胺化合物的制造成本。根据本发明，能够提供一种与野生型腈水合酶相比反应初速度及酶稳定性得以提高的新型腈水合酶突变体，能够降低酰胺化合物的制造成本中所占的该酶的制造成本。
具体实施例方式上述目的、及其他目的、特征及优点通过以下所述的优选实施方式进一步明确。以下，更详细地说明本发明。本发明的腈水合酶突变体包含至少1个氨基酸被取代为其他氨基酸的取代，所述
20取代通过3个以下1个以上的氨基酸取代而改善腈水合酶的2个以上的性质。所谓本发明的腈水合酶突变体所改善的性质有与将腈基水合、转变为酰胺基的反应本身相关的物性和酶稳定性。所谓与反应本身相关的物性有酶的活性、基质特异性、 Vmax, Km及反应初速度。酶稳定性中包括热稳定性、对基质的稳定性、对产物的稳定性。本发明的腈水合酶突变体优选包含改善来源于嗜热菌的腈水合酶的性质的至少1个的氨基酸被取代为其他氨基酸的取代。作为嗜热菌的例子，可以优选使用属于假诺卡氏菌(Pseudonocardia)属的菌，具体可以举出嗜热假诺卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)。更具体而言，本发明的腈水合酶突变体是在含有序列表的序列号1表示的α亚单位和序列表的序列号2表示的β亚单位的腈水合酶中，如表I所示，选自(a) (1)中至少1个的氨基酸取代位置被取代为其他氨基酸。由此，本发明的腈水合酶突变体能够具有比专利文献1记载的野生型腈水合酶高的反应初速度及酶稳定性。(表I)
权利要求
1.一种腈水合酶突变体，其特征在于，包含至少1个氨基酸取代为其他氨基酸的取代， 所述取代通过3个以下1个以上的氨基酸取代而改善腈水合酶的2个以上的性质。
2.如权利要求1所述的腈水合酶突变体，其特征在于，所述被改善的性质为反应初速度及热稳定性。
3.如权利要求1或2所述的腈水合酶突变体，其特征在于，含有序列表的序列号1表示的α亚单位和序列表的序列号2表示的β亚单位，并且含有选自由下述(a) (1)组成的氨基酸取代位置中的、至少1个氨基酸取代为其他氨基酸的取代(a)α亚单位的第92位；(b)α亚单位的第94位；(c)α亚单位的第197位；(d)β亚单位的第4位；(e)β亚单位的第M位；(f)β亚单位的第79位；(g)β亚单位的第96位；(h)β亚单位的第107位；(i)β亚单位的第2 位；(j) β亚单位的第110位及β亚单位的第231位； (k) β亚单位的第206位及β亚单位的第230位； (1) α亚单位的第13位、α亚单位的第27位、及β亚单位的第110位。
4.如权利要求3所述的腈水合酶突变体，其特征在于，进一步包含选自由下述(m) (u)组成的氨基酸取代位置中的、至少1个氨基酸取代为其他氨基酸的取代(m)为(b)或(g)时，α亚单位的第13位； (η)为(b)或(h)时，α亚单位的第27位； (ο) (d)及(f)；(P)为(f)时，β亚单位的第230位； (q) (a)及⑴；(r)为(i)时，α亚单位的第13号及β亚单位的第206位；(s)为(a)及(d)时，β亚单位的第206位；(t)为(c)及(h)时，β亚单位的第230位；(u)为(f)时，β亚单位的第230位及β亚单位的第231位。
5.如权利要求3所述的腈水合酶突变体，其特征在于，为(e)时，进一步包含选自由 (a)、(c)、(f)、⑴、(h)、β亚单位的第230位、及β亚单位的第231位组成的组中的至少 1个氨基酸取代为其他氨基酸的取代。
6.如权利要求1 5中任一项所述的腈水合酶突变体，其特征在于 α亚单位的第13位氨基酸被取代时，Ile被取代为Leu ；α亚单位的第27位氨基酸被取代时，Met被取代为Ile ； α亚单位的第92位氨基酸被取代时，Asp被取代为Glu ； α亚单位的第94位氨基酸被取代时，Met被取代为Ile ； α亚单位的第197位氨基酸被取代时，Gly被取代为Cys ；β亚单位的第4位氨基酸被取代时，Val被取代为Met ； β亚单位的第M位氨基酸被取代时，Val被取代为Ile ； β亚单位的第79位氨基酸被取代时，His被取代为Asn ； β亚单位的第96位氨基酸被取代时，Gln被取代为Arg ； β亚单位的第107位氨基酸被取代时，Pro被取代为Met ； β亚单位的第110位氨基酸被取代时，Glu被取代为Asn ； β亚单位的第206位氨基酸被取代时，Pro被取代为Leu ； β亚单位的第2 位氨基酸被取代时，Val被取代为Ile ； β亚单位的第230位氨基酸被取代时，Ala被取代为Glu ； β亚单位的第231位氨基酸被取代时，Ala被取代为Val。
7.如权利要求3 6中任一项所述的腈水合酶突变体，其特征在于，进一步包含选自由下述(aa) (br)组成的氨基酸取代中的至少1个氨基酸的取代(aa)将α亚单位的第36位的Thr取代为Met、及将α亚单位的第1 位的Phe取代为 Tyr ；(ab)将α亚单位的第148位的Gly取代为Asp、及将α亚单位的第204位的Val取代为Arg ；(ac)将β亚单位的第51位的Phe取代为Val、及将β亚单位的第108位的Glu取代为 Asp ；(ad)将β亚单位的第118位的Phe取代为Val、及将β亚单位的第200位的Ala取代为Glu ；(ae)将β亚单位的第160位的Arg取代为Trp、及将β亚单位的第186位的Leu取代为Arg ；(af)将α亚单位的第6位的Leu取代为Thr、将α亚单位的第36位的Thr取代为 Met、及将α亚单位的第1 位的Phe取代为Tyr ；(ag)将α亚单位的第19位的Ala取代为Valjfα亚单位的第71位的Arg取代为 His、及将α亚单位的第1 位的Phe取代为Tyr ；(ah)将α亚单位的第36位的Thr取代为Met、将α亚单位的第148位的Gly取代为 Asp、及将α亚单位的第204位的Val取代为Arg ；(ai)将β亚单位的第10位的Thr取代为Asp、将β亚单位的第118位的Phe取代为 Val、及将β亚单位的第200位的Ala取代为Glu ；(aj)将β亚单位的第37位的Phe取代为Leu、将β亚单位的第108位的Glu取代为 Asp、及将β亚单位的第200位的Ala取代为Glu ；(ak)将β亚单位的第37位的Phe取代为Valjf β亚单位的第108位的Glu取代为 Asp、及将β亚单位的第200位的Ala取代为Glu ；(al)将β亚单位的第41位的Phe取代为lie、将β亚单位的第51位的Phe取代为 Val、及将β亚单位的第108位的Glu取代为Asp ；(am)将β亚单位的第46位的Met取代为Lysjf β亚单位的第108位的Glu取代为 Arg、及将β亚单位的第212位的Ser取代为Tyr ；(an)将β亚单位的第48位的Leu取代为Valjf β亚单位的第108位的Glu取代为Arg、及将β亚单位的第212位的Ser取代为Tyr ；(ao)将β亚单位的第127位的Leu取代为kr、将β亚单位的第160位的Arg取代为 ^Ρ、及将β亚单位的第186位的Leu取代为Arg ；(ap)将α亚单位的第6位的Leu取代为Thr、将α亚单位的第19位的Ala取代为 Valjf α亚单位的第1 位的Phe取代为Tyrjf β亚单位的第46位的Met取代为Lys、 将β亚单位的第108位的Glu取代为Arg、及将β亚单位的第212位的Ser取代为Tyr ； (aq)将α亚单位的第6位的Leu取代为Thr、将α亚单位的第19位的Ala取代为 Valjf α亚单位的第1 位的Phe取代为Tyrjf β亚单位的第48位的Leu取代为Val、 将β亚单位的第108位的Glu取代为Arg、及将β亚单位的第212位的Ser取代为Tyr ； (ar)将α亚单位的第6位的Leu取代为Ala、将α亚单位的第19位的Ala取代为 Valjf α亚单位的第1 位的Phe取代为Tyrjf β亚单位的第127位的Leu取代为kr、 将β亚单位的第160位的Arg取代为Trp、及将β亚单位的第186位的Leu取代为Arg ； (as)将α亚单位的第6位的Leu取代为Thr、将α亚单位的第36位的Thr取代为 Met、将α亚单位的第1 位的Phe取代为Tyrjf β亚单位的第10位的Thr取代为Asp、 将β亚单位的第118位的Phe取代为Val、及将β亚单位的第200位的Ala取代为Glu ； (at)将α亚单位的第19位的Ala取代为Valjf α亚单位的第71位的Arg取代为 His、将α亚单位的第1 位的Phe取代为Tyrjf β亚单位的第37位的Phe取代为Leu、 将β亚单位的第108位的Glu取代为Asp、及将β亚单位的第200位的Ala取代为Glu ； (au)将α亚单位的第19位的Ala取代为Valjf α亚单位的第71位的Arg取代为 His、将α亚单位的第1 位的Phe取代为Tyrjf β亚单位的第37位的Phe取代为Val、 将β亚单位的第108位的Glu取代为Asp、及将β亚单位的第200位的Ala取代为Glu ； (av)将α亚单位的第36位的Thr取代为Met、将α亚单位的第148位的Gly取代为 Asp、将α亚单位的第204位的Val取代为Arg、将β亚单位的第41位的Phe取代为lie、 将β亚单位的第51位的Phe取代为Val、及将β亚单位的第108位的Glu取代为Asp ；(aw)将α亚单位的第148位的Gly取代为Asp、将α亚单位的第204位的Val取代为Arg、将β亚单位的第108位的Glu取代为Asp、及将β亚单位的第200位的Ala取代为 Glu ；(ax)将α亚单位的第36位的Thr取代为Gly、及将α亚单位的第188位的Thr取代为 Gly ；(ay)将α亚单位的第36位的Thr取代为Ala、及将α亚单位的第48位的Asn取代为 Gln ；(az)将α亚单位的第48位的Asn取代为Glu、及将β亚单位的第146位的Arg取代为 Gly ；(ba)将α亚单位的第36位的Thr取代为Trp、及将β亚单位的第176位的Tyr取代为 Cys ；(bb)将β亚单位的第176位的Tyr取代为Met、及将β亚单位的第217位的Asp取代为Gly ；(be)将α亚单位的第36位的Thr取代为kr、及将β亚单位的第33位的Ala取代为 Val ；(bd)将β亚单位的第176位的Tyr取代为Ala、及将β亚单位的第217位的Asp取代为Val ；(be)将β亚单位的第40位的Thr取代为Val、及将β亚单位的第218位的Cys取代为 Met ；(bf)将β亚单位的第33位的Ala取代为Met、及将β亚单位的第176位的Tyr取代为 iThr ；(bg)将β亚单位的第40位的Thr取代为Leu、及将β亚单位的第217位的Asp取代为 Leu ；(bh)将β亚单位的第40位的Thr取代为lie、及将β亚单位的第61位的Ala取代为 Val ；(bi)将β亚单位的第61位的Ala取代为Thr、及将β亚单位的第218位的Cys取代为 Ser ；(bj)将β亚单位的第112位的Lys取代为Val、及将β亚单位的第217位的Asp取代为Met ；(bk)将β亚单位的第61位的Ala取代为 ρ、及将β亚单位的第217位的Asp取代为 His ；(bl)将β亚单位的第61位的Ala取代为Leu、及将β亚单位的第112位的Lys取代为 Ile ；(bm)将β亚单位的第146位的Arg取代为Gly、及将β亚单位的第217位的Asp取代为；(bn)将β亚单位的第171位的Lys取代为Ala、及将β亚单位的第217位的Asp取代为Thr ；(bo)将β亚单位的第150位的Ala取代为kr、及将β亚单位的第217位的Asp取代为Cys ；(bp)将β亚单位的第61位的Ala取代为Gly、及将β亚单位的第150位的Ala取代为 Asn ；(bq)将β亚单位的第61位的Ala取代为kr、及将β亚单位的第160位的Arg取代为 Met ；(br)将β亚单位的第160位的Arg取代为Cys、及将β亚单位的第168位的Thr取代为Glu。
8.一种编码权利要求1至7中任一项所述的腈水合酶突变体的基因。
9.一种编码腈水合酶突变体的基因，其包含序列表的序列号3表示的编码α亚单位的基因和序列表的序列号4表示的编码β亚单位的基因，其特征在于，包含选自由下述 (a) (1)组成的碱基取代位置中的至少1个的碱基取代，(a)序列号3的碱基序列的第274位 第276位；(b)序列号3的碱基序列的第280位 第282位；(c)序列号3的碱基序列的第89位 第591位；(d)序列号4的碱基序列的第10位 第12位；(e)序列号4的碱基序列的第69位 第71位；(f)序列号4的碱基序列的第235位 第237位；(g)序列号4的碱基序列的第286位 第288位；(h)序列号4的碱基序列的第319位 第321位；(i)序列号4的碱基序列的第676位 第678位；(j)序列号4的碱基序列的第3 位 第330位、及序列号4的第691位 第693位； (k)序列号4的碱基序列的第616位 第618位、及序列号4的碱基序列的第688 位 第690位；(1)序列号3的碱基序列的第37位 第39位、及序列号3的碱基序列的第79位 第81位、及序列号4的碱基序列的第3 位 第330位。
10.如权利要求9所述的编码腈水合酶突变体的基因，其特征在于，进一步包含选自由下述(m) (u)组成的碱基取代位置中的至少1个碱基取代(m)为(b)或(g)时，序列号3的碱基序列的第37位 第39位； (η)为(b)或(h)时，序列号3的碱基序列的第79位 第81位； (ο) (d)及(f)；(P)为(f)时，序列号4的碱基序列的第688位 690位； (q) (a)及⑴；(r)为(i)时，序列号3的碱基序列的第37 39位及序列号4的碱基序列的第616 位 第618位；(s)为(a)及(d)时，序列号4的碱基序列的第616位 第618位； (t)为(c)及(h)时，序列号4的碱基序列的第688位 第690位； (u)为(f)时，序列号4的碱基序列的第688位 第690位、及序列号4的碱基序列的第691位 第693位。
11.如权利要求9所述的编码腈水合酶突变体的基因，其特征在于，为(e)时，进一步包含选自由(a)、(c)、(f)、⑴、(h)、序列号4的碱基序列的第688位 第690位、及序列号 4的碱基序列的第691位 第693位组成的碱基取代位置中的至少1个碱基取代为其他碱基的取代。
12.如权利要求9至11中任一项所述的编码腈水合酶突变体的基因，其特征在于 序列号3的碱基序列的第37位 第39位被碱基取代时，ATC被取代为CTC ； 序列号3的碱基序列的第79位 第81位被碱基取代时，ATG被取代为ATC ； 序列号3的碱基序列的第274位 第276位被碱基取代时，GAC被取代为GAG ； 序列号3的碱基序列的第280位 第282位被碱基取代时，ATG被取代为ATC ； 序列号3的碱基序列的第589位 第591位被碱基取代时，GGC被取代为TGC ； 序列号4的碱基序列的第10位 第12位被碱基取代时，GTG被取代为ATG ； 序列号4的碱基序列的第69位 第71位被碱基取代时，GTC被取代为ATC ；序列号」4的碱基序列的第235位- 第237位被碱基取代时，CAC被取代为AAC序列号」4的碱基序列的第286位- 第288位被碱基取代时，CAG被取代为CGT序列号」4的碱基序列的第319位- 第321位被碱基取代时，CCC被取代为ATG序列号」4的碱基序列的第328位- 第330位被碱基取代时，GAG被取代为AAC序列号」4的碱基序列的第616位- 第618位被碱基取代时，CCG被取代为CTG序列号4的碱基序列的第676位 第678位被碱基取代时，GTC被取代为ATC ； 序列号4的碱基序列的第688位 第690位被碱基取代时，GCG被取代为GAG ； 序列号4的碱基序列的第691位 第693位被碱基取代时，GCC被取代为GTC。
13.如权利要求9至12中任一项所述的编码腈水合酶突变体的基因，其特征在于，包含选自由下述(aa) (br)组成的碱基取代位置中的至少1个碱基取代，且具有腈水合酶活性(aa)将序列号3的碱基序列的第106位 第108位的ACG取代为ATG、及将序列号3 的碱基序列的第376位 第378位的TTC取代为TAC ；(ab)将序列号3的碱基序列的第442位 第444位的GGC取代为GAC、及将序列号3 的碱基序列的第610位 第612位的GTC取代为CGC ；(ac)将序列号4的碱基序列的第151位 第153位的TTC取代为GTC、及将序列号4 的碱基序列的第322位 第3M位的GAG取代为GAT ；(ad)将序列号4的碱基序列的第352位 第3M位的TTC取代为GTC、及将序列号4 的碱基序列的第598位 第600位的GCC取代为GAG ；(ae)将序列号4的碱基序列的第478位 第480位的CGG取代为TGG、及将序列号4 的碱基序列的第556位 第558位的CTG取代为CGG ；(af)将序列号3的碱基序列的第16位 第18位的CTG取代为ACG、将序列号3的碱基序列的第106位 第108位的ACG取代为ATG、及将序列号3的碱基序列的第376位 第378位的TTC取代为TAC ；(ag)将序列号3的碱基序列的第55位 第57位的GCG取代为GTG、将序列号3的碱基序列的第211位 第213位的CGT取代为CAT、及将序列号3的碱基序列的第376位 第378位的TTC取代为TAC ；(ah)将序列号3的碱基序列的第106位 第108位的ACG取代为ATG、将序列号3 的碱基序列的第442位 第444位的GGC取代为GAC、及将序列号3的碱基序列的第610 位 第612位的GTC取代为CGC ；(ai)将序列号4的碱基序列的第观位 第30位的ACC取代为GAC、将序列号4的碱基序列的第352位 第3M位的TTC取代为GTC、及将序列号4的碱基序列的第598位 第600位的GCC取代为GAG ；(aj)将序列号4的碱基序列的第109位 第111位的TTC取代为CTC、将序列号4 的碱基序列的第322位 第3 位的GAG取代为GAT、及将序列号4的碱基序列的第598 位 第600位的GCC取代为GAG ；(ak)将序列号4的碱基序列的第109位 第111位的TTC取代为GTC、将序列号4 的碱基序列的第322位 第3 位的GAG取代为GAT、及将序列号4的碱基序列的第598 位 第600位的GCC取代为GAG ；(al)将序列号4的碱基序列的第121位 第123位的TTC取代为ATC、将序列号4 的碱基序列的第151位 第153位的TTC取代为GTC、及将序列号4的碱基序列的第322 位 第3 位的GAG取代为GAT ；(am)将序列号4的碱基序列的第136位 第138位的ATG取代为AAG、将序列号4 的碱基序列的第322位 第3 位的GAG取代为CGG、及将序列号4的碱基序列的第634位 第636位的TCC取代为TAC ；(an)将序列号4的碱基序列的第142位 第144位的CTG取代为GTG、将序列号4 的碱基序列的第322位 第3 位的GAG取代为CGG、及将序列号4的碱基序列的第634 位 第636位的TCC取代为TAC ；(ao)将序列号4的碱基序列的第379位 第381位的CTG取代为TCG、将序列号4 的碱基序列的第478位 第480位的CGG取代为TGG、及将序列号4的碱基序列的第556 位 第558位的CTG取代为CGG ；(ap)将序列号3的碱基序列的第16位 第18位的CTG取代为ACG、将序列号3的碱基序列的第阳位 第57位的GCG取代为GTG、将序列号3的碱基序列的第376位 第378 位的TTC取代为TAC、将序列号4的碱基序列的第136位 第138位的ATG取代为AAGjf 序列号4的碱基序列的第322位 第3 位的GAG取代为CGG、及将序列号4的碱基序列的第634位 第636位的TCC取代为TAC ；(aq)将序列号3的碱基序列的第16位 第18位的CTG取代为ACG、将序列号3的碱基序列的第阳位 第57位的GCG取代为GTG、将序列号3的碱基序列的第376位 第378 位的TTC取代为TAC、将序列号4的碱基序列的第142位 第144位的CTG取代为GTGjf 序列号4的碱基序列的第322位 第3 位的GAG取代为CGG、及将序列号4的碱基序列的第634位 第636位的TCC取代为TAC ；(ar)将序列号3的碱基序列的第16位 第18位的CTG取代为GCG、将序列号3的碱基序列的第阳位 第57位的GCG取代为GTG、将序列号3的碱基序列的第376位 第378 位的TTC取代为TAC、将序列号4的碱基序列的第379位 第381位的CTG取代为TCGjf 序列号4的碱基序列的第478位 第480位的CGG取代为TGG、及将序列号4的碱基序列的第556位 第558位的CTG取代为CGG ；(as)将序列号3的碱基序列的第16位 第18位的CTG取代为ACG、将序列号3的碱基序列的第106位 第108位的ACG取代为ATG、将序列号3的碱基序列的第376位 第 378位的TTC取代为TAC、将序列号4的碱基序列的第28位 第30位的ACC取代为GAC、 将序列号4的碱基序列的第352位 第3M位的TTC取代为GTC、及将序列号4的碱基序列的第598位 第600位的GCC取代为GAG ；(at)将序列号3的碱基序列的第55位 第57位的GCG取代为GTG、将序列号3的碱基序列的第211位 第213位的CGT取代为CAT、将序列号3的碱基序列的第376位 第378位的TTC取代为TAC、将序列号4的碱基序列的第109位 第111位的TTC取代为 CTC、将序列号4的碱基序列的第322位 第3 位的GAG取代为GAT、及将序列号4的碱基序列的第598位 第600位的GCC取代为GAG ；(au)将序列号3的碱基序列的第55位 第57位的GCG取代为GTG、将序列号3的碱基序列的第211位 第213位的CGT取代为CAT、将序列号3的碱基序列的第376位 第378位的TTC取代为TAC、将序列号4的碱基序列的第109位 第111位的TTC取代为 GTC、将序列号4的碱基序列的第322位 第3 位的GAG取代为GAT、及将序列号4的碱基序列的第598位 第600位的GCC取代为GAG ；(av)将序列号3的碱基序列的第106位 第108位的ACG取代为ATG、将序列号3的碱基序列的第442位 第444位的GGC取代为GAC、将序列号3的碱基序列的第610位 第612位的GTC取代为CGC、将序列号4的碱基序列的第121位 第123位的TTC取代为 ATC、将序列号4的碱基序列的第151位 第153位的TTC取代为GTC、及将序列号4的碱基序列的第322位 第3M位的GAG取代为GAT ；(aw)将序列号3的碱基序列的第442位 第444位的GGC取代为GAC、将序列号3的碱基序列的第610位 第612位的GTC取代为CGC、将序列号4的碱基序列的第322位 第3M位的GAG取代为GAT、及将序列号4的碱基序列的第598位 第600位的GCC取代为 GAG ；(ax)将序列号3的碱基序列的第106位 第108位的ACG取代为GGG、及将序列号3 的碱基序列的第562位 第564位的ACC取代为GGC ；(ay)将序列号3的碱基序列的第106位 第108位的ACG取代为GCG、及将序列号3 的碱基序列的第142位 第144位的AAC取代为CAA ；(az)将序列号3的碱基序列的第142位 第144位的AAC取代为GAA、及将序列号4 的碱基序列的第436位 第438位的CGG取代为GGG ；(ba)将序列号3的碱基序列的第106位 第108位的ACG取代为TGG、及将序列号4 的碱基序列的第5 位 第5 位的TAC取代为TGC ；(bb)将序列号4的碱基序列的第5 位 第5 位的TAC取代为ATG、及将序列号4 的碱基序列的第649位 第651位的GAC取代为GGC ；(be)将序列号3的碱基序列的第106位 第108位的ACG取代为TCG、及将序列号4 的碱基序列的第97位 第99位的GCG取代为GTG ；(bd)将序列号4的碱基序列的第5 位 第5 位的TAC取代为GCC、及将序列号4 的碱基序列的第649位 第651位的GAC取代为GTC ；(be)将序列号4的碱基序列的第118位 第120位的ACG取代为GTG、及将序列号4 的碱基序列的第652位 第6M位的TGC取代为ATG ；(bf)将序列号4的碱基序列的第97位 第99位的GCG取代为ATG、及将序列号4的碱基序列的第5 位 第5 位的TAC取代为ACC ；(bg)将序列号4的碱基序列的第118位 第120位的ACG取代为CTG、及将序列号4 的碱基序列的第649位 第651位的GAC取代为CTC ；(bh)将序列号4的碱基序列的第118位 第120位的ACG取代为ATT、及将序列号4 的碱基序列的第181位 第183位的GCC取代为GTC ；(bi)将序列号4的碱基序列的第181位 第183位的GCC取代为ACG、及将序列号4 的碱基序列的第652位 第6M位的TGC取代为TCC ；(bj)将序列号4的碱基序列的第334位 第336位的AAG取代为GTG、及将序列号4 的碱基序列的第649位 第651位的GAC取代为ATG ；(bk)将序列号4的碱基序列的第181位 第183位的GCC取代为TGG、及将序列号4 的碱基序列的第649位 第651位的GAC取代为CAC ；(bl)将序列号4的碱基序列的第181位 第183位的GCC取代为CTC、及将序列号4 的碱基序列的第334位 第336位的AAG取代为ATT ；(bm)将序列号4的碱基序列的第436位 第438位的CGG取代为GGG、及将序列号4 的碱基序列的第649位 第651位的GAC取代为AGC ；(bn)将序列号4的碱基序列的第511位 第513位的AAG取代为GCG、及将序列号4 的碱基序列的第649位 第651位的GAC取代为ACC ；(bo)将序列号4的碱基序列的第448位 第450位的GCG取代为TCG、及将序列号4 的碱基序列的第649位 第651位的GAC取代为TGT ；(bp)将序列号4的碱基序列的第181位 第183位的GCC取代为GGC、及将序列号4 的碱基序列的第448位 第450位的GCG取代为AAT ；(bq)将序列号4的碱基序列的第181位 第183位的GCC取代为TCG、及将序列号4 的碱基序列的第478位 第480位的CGG取代为ATG ；(br)将序列号4的碱基序列的第478位 第480位的CGG取代为TGT、及将序列号4 的碱基序列的第502位 第504位的ACG取代为GAG。
14.一种被连接的DNA，所述DNA在权利要求9至13中任一项所述的编码腈水合酶突变体的基因的5’末端上游进一步包含含有基因表达所必需的启动子序列的DNA，并且在所述启动子的3’末端的下游包含序列号-J中所包含的核糖体结合序列。
15.一种质粒，含有权利要求14所述的DNA。
16.一种转化体，是利用权利要求15所述的质粒将宿主细胞进行转化而得到的。
17.一种腈水合酶突变体的生产方法，其特征在于，包括下述步骤将权利要求16中所述的转化体在培养基中进行培养，在所述转化体中生产基于质粒所含有的腈水合酶基因的腈水合酶突变体。
全文摘要
本发明的腈水合酶突变体包含至少1个氨基酸取代为其他氨基酸的取代，通过1个氨基酸取代而改善腈水合酶的2个以上的性质。
文档编号C12N15/09GK102216455SQ20098014513
公开日2011年10月12日 申请日期2009年11月12日 优先权日2008年11月14日
发明者德田淳子, 数野康, 望月大资, 松本和也 申请人:三井化学株式会社