专利名称：用于生物样本中低丰度rna种类特异性检测的方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测生物样本中低丰度RNA种类的方法和试剂盒，并且涉及一种用于检测生物样本中支原体污染的方法和试剂盒。
背景技术：
最广泛推广和最成功的检测和分析RNA分子的方法是所谓的RT/PCR(逆转录/聚合酶链反应)。在这该方法中，RNA分子通过逆转录酶(RT)被转录成cDNA分子，然后通过基于的PCR方法被检测和/或分析。该领域早期的研究人员已经使用禽类成髓瘤细胞病毒RT或莫洛尼鼠白血病病毒 RT用于逆转录。然而，使用RNA作为模板用于cDNA合成的显著问题是这些嗜温的病毒性 RT不能通过稳定的RNA 二级结构合成cDNA。为了克服该问题，可以在提高的反应温度下进行逆转录，其可能分解二级RNA结构，另外提高引物延伸的特异性。这需要的使用热稳定性酶比如嗜热栖热菌iThermus thermophilus DNA聚合酶(Tth pol)用于逆转录，该酶在最适温度70°C下具有活性。然而，热稳定性酶用于逆转录还会产生新的问题。特别地，当设法检测和/或分析生物样本中低丰度RNA种类时，用于逆转录的热稳定性酶可能在随后的RT/PCR步骤期间催化产生非特异性反应产物。这尤其会发生在样品具有大本底总RNA的情况中，并且导致标靶RNA检测极限的大幅度增加，达到远高于可能需要的水平例如生物药物产品的质量对照所需要水平。为了克服该问题，在逆转录之后所有的处理和RT/PCR步骤不得不在高温下并在热启动(hotstart)条件下进行。然而，这往往是不切实际的和不利的，特别是当以工业规模工作时。特别相关的是，通常在大本底总RNA中低丰度RNA种类的灵敏检测的应用是生物样本中支原体污染的检测。支原体是具有已知最小的能自我复制的基因组中之一的细菌性微生物。而大多数支原体是天生地无害的共生体，它们中有些能感染它们的天然寄主并且引起严重程度不同的疾病。支原体，尤其是支原体属和莱德劳无胆甾原体(Acholeplasma)属中的种类，也频繁地引起原始细胞系和连续细胞系的污染，并且代表了涉及来源于细胞的生物制品和药物产品的研发和生产中的研究实验室和工业实验室的严重问题。这样，尽管在细胞系增殖加工和处理期间通常采用所有的预防措施，支原体污染仍然经常引起问题。对于细胞系和来源于细胞的生物制品的支原体测试，推荐的分析方案包括使用肉汤/琼脂培养和指示剂细胞系测试。肉汤/琼脂培养方法的目的在于检测可培养的支原体试剂，而指示剂细胞系被用于检测挑剔的不可培养的支原体种类。尽管这两个方法的组合使得能够进行有效的支原体检测，但是总体测试工序是昂贵的、费力的且耗时的(最少观天)。此外，存在许多不可培养的支原体种类，它们不适用该方法。人们最近开发出新颖的以扩增核酸、尤其是来源于支原体的核蛋白体RNA为基础的支原体测试方法。就成本、分析的灵敏度、简单性和时间而言，这些方法具有某些优点。然而，目前可利用的方法中的检测限仍然在生物药物产品的质量控制所需要之上，特别是当使用具有总RNA或其他高分子大本底的样品工作时。因此，在该技术领域仍需要改善当前的RT/PCR方法，以便允许提高生物样本中低丰度RNA种类的检测限。通过权利要求中表征的实施方式实现了上述问题的解决。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种改进的用于检测生物样本中低丰度RNA种类的方法。特别地，本发明涉及用于检测生物样本中低丰度RNA种类的所述方法和试剂盒。进一步地，本发明的另一个目的是提供一种改进的用于检测样品中支原体污染的方法和试剂盒。
具体实施例方式在一个方面，本发明涉及一种用于检测生物样本中低丰度标靶RNA种类的方法， 包括下述步骤
(a)使用逆转录酶(RT)，将RNA逆转录成cDNA；
(b)使RT失活；以及
(c)通过聚合酶链反应(PCR)检测标靶cDNA。在此使用的术语“生物样本”涉及任何含有或者怀疑含有生物学相关高分子的样本，例如来源于生物药物产品生产工艺中多个阶段的样本，例如疫苗或者重组体蛋白、细胞培养上清液、细胞裂解液、细胞抽提物、食品或者环境的样品；来源于人或动物身体的样本， 比如全血、血清、血浆、尿液、体液或者斑迹；任何生物来源的其它样品；以及任何含有或者怀疑含有RNA的其他组合物。在本发明的一种优选实施方式中，生物样本具有细胞组分大本底。在此使用的术语“细胞组分”涉及细胞器、蛋白质、多肽、细胞膜、脂类、核酸，特别是非靶向RNA种类、以及其组合或片段。在本发明的另一个优选的实施方式中，生物样本具有总RNA大本底。在此使用的术语“总RNA大本底”是指这样一种情况标靶RNA在IO4个总RNA分子中以少于一个分子存在，优选在IO6个总RNA分子中以少于一个分子存在，更优选在IO8 个总RNA分子中以少于一个分子存在，最优选在101°个总RNA分子中以少于一个分子存在。在本发明的一种优选实施方式中，标靶RNA存在的含量少于每毫升样本中10000 个拷贝、优选少于每毫升样本中1000个拷贝、更优选每毫升样本中少于100个拷贝、并且最优选少于每毫升样本中10个拷贝。根据本发明的一个优选实施方式，根据本发明的方法使用RT将RNA逆转录成cDNA 是在热启动条件下进行的。在此使用的术语“热启动条件”涉及任何下述条件其中在加入引物延伸的酶之前，将反应混合物加热至或高于引物/核酸复合物的解链温度，或者其中引物延伸的酶在室温下无活性、并且通过高温活化步骤被活化，所述高温活化步骤在引物/核酸复合物的解链温度或高于此温度下进行。 在本发明的一种优选实施方式中，本发明的方法进一步包括在使用RT将RNA逆转录成cDNA后，使用相同的RT扩增标靶cDNA的步骤。该进一步的步骤被称作“I^rimePCR”， 并且优选在热启动条件下进行5至15个循环，更优选在热启动条件下进行5至11个循环， 并且最优选在热启动条件下进行5或10个循环。因此，在另一个方面，本发明涉及一种用于检测生物样本中低丰度RNA种类的方法，包括下述步骤
(a)使用逆转录酶(RT)，将RNA逆转录成cDNA；
(b)使用步骤(a)中的RT，通过聚合酶链反应(PCR)扩增cDNA；
(c)使RT失活；以及
(d)通过PCR检测标靶cDNA。本领域中已知的兼具RT (即RNA依赖性DNA聚合酶)和DNA聚合酶(即DNA依赖性DNA聚合酶)活性的酶包括例如嗜热栖热菌Thermus thermophilus DNA聚合酶(Tth pol)。特定酶显示出特定活性的条件也是本技术领域公知的。就Tth pol而言，逆转录酶活性被Mn2+离子促进，并且DNA聚合酶活性被Mg2+离子促进。在本发明的一种优选实施方式中，在本发明的方法中使用的RT是嗜热栖热菌 Thermus thermophilus DNA聚合酶(Tth pol)。在进一步优选的实施方式中，Tth pol是通过重组法产生的(rTth-pol)。在本发明的另一个优选的实施方式中，RT在本发明的方法中被失活，优选通过选自于下组的方法失活热处理、用苯酚处理、用蛋白酶K处理、以及用离液(chaotropic)试剂处理。根据本发明的热处理包括加热含有RT的反应混合物至80-100°C、优选至 90-100°C、更优选至95°C。热处理的持续时间是15至90分钟、优选30至75分钟、更优选 60分钟。在特别优选的实施方式中，热处理包括加热含有RT的反应混合物至95°C保持60 分钟。根据本发明用蛋白酶K处理包括向反应混合物中加入1至10个单位的蛋白酶K， 更优选加入2至5个单位的蛋白酶K，最优选加入5个单位的蛋白酶K。蛋白酶K处理的持续时间是30至90分钟、优选45至75分钟、最优选60分钟。在特别优选的实施方式中，用蛋白酶K处理包括加入5个单位的蛋白酶K保持60分钟。在本发明的一种优选实施方式中，在本发明的方法中通过用离液试剂处理使RT 失活。根据本发明用离液试剂处理包括向含有RT的反应混合物中加入一定含量的离液试剂并保持足以使RT失活的一段时间。特定的离液试剂含量和时间为本领域技术人员所熟知。在本发明的更优选的实施方式中，离液试剂选自下组脲，高氯酸锂和胍盐。在最优选的实施方式中，离液试剂是胍盐。在本发明进一步优选的实施方式中，本发明的方法还包括在使用离液试剂使RT 失活后从反应混合物中除去离液试剂的步骤。从反应混合物中除去离液试剂的方法为本领域技术人员所熟知，并且包括例如通过使用DNA结合性离心柱(spin column)纯化反应混合物中包含的核酸。通过PCR检测标靶cDNA也被称为“boost PCR”。在本发明的一种优选实施方式中，在本发明方法中的聚合酶链反应(PCR)是实时PCR。在此使用的术语“实时PCR”涉及任何基于聚合酶链反应(PCR)、并且允许扩增并同时定量标靶DNA分子的方法。在本发明的一种优选实施方式中，标靶RNA源自于支原体。在此使用的术语“支原体”涉及任何柔膜细菌纲的成员，包括支原体属(Mycoplasma)、脲原体属⑴reaplasma)、 中间原体属(Mesoplasma)、虫原体属(Entomoplasma)、螺原体属(Spiroplasma)，无胆甾原体属(Achol印lasma)、无甾醇原体属(Asterol印lasma)、以及热原体属(Thermoplasma)。 在本发明更优选的实施方式中，支原体选自下组莱德劳无胆甾原体(Acholeplasma laidlawii)、鸡败血支原体(Mycoplasma gallisepticum)、猪鼻炎支原体(Mycoplasma hyorhinis)，人支原体(Mycoplasma hominis)、发酵支原体(Mycoplasma fermentans)、滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae)、以及口腔支原体(Mycoplasma orale)。在本发明进一步优选的实施方式中，标靶RNA是16S核蛋白体RNA(16SrRNA)。在另一个方面，本发明涉及一种用于检测生物样本中支原体污染的方法，包括下述步骤
(a)从样本中提取总RNA；
(b)使用逆转录酶(RT)，将RNA逆转录成cDNA；
(c)使用步骤(b)中的RT，通过聚合酶链反应(PCR)扩增来源于支原体16S核蛋白体 RNA(16S rRNA)的 cDNA ；
(d)通过添加离液试剂使RT失活；
(e)从反应混合物中除去离液试剂；以及
(f)通过聚合酶链反应(PCR)检测来源于支原体16SrRNA的cDNA。从样本中提取总RNA的手段为本领域技术人员所熟知，并且包括用苯酚/氯仿提取和用异丙醇沉淀。在本发明的一种优选实施方式中，待检测的支原体污染是样品中大约lOcfu/mL 支原体以下的污染。用于支原体16S rRNA逆转录的引物、以及用于通过PCR扩增来源于支原体16S rRNA的cDNA的引物为本领域技术人员所熟知。在本发明的一种优选实施方式中，用于检测样品中支原体污染的方法中使用RT 将RNA逆转录成cDNA是在热启动条件下进行的。在本发明的另一个优选的实施方式中，在用于检测样品中支原体污染的方法中使用的RT是嗜热栖热菌Thermus thermophilus DNA聚合酶(Tth pol)。在进一步优选的实施方式中，Tth pol是通过重组法产生的(rTth-pol)。在本发明进一步优选的实施方式中，在用于检测样品中支原体污染的方法中使用的离液试剂选自下组脲，高氯酸锂和胍盐。在最优选的实施方式中，离液试剂是胍盐。在本发明进一步优选的一个实施方式中，在用于检测样品中支原体污染的方法中使用的PCR是实时PCR。在另一个方面，本发明涉及一种用于检测生物样本中低丰度标靶RNA种类的试剂盒，其包括至少一种RT和用于使RT失活的手段。用于使RT失活的手段可以是蛋白酶K或离液试剂。该试剂盒可以进一步包括例如用于逆转录的引物、用于检测特异性cDNA的引物、载体RNA、校准物RNA、校准物DNA、合适的酶、缓冲液、试剂、反应容器和耗材。在另一个方面，本发明涉及一种用于检测生物样本中支原体污染的试剂盒，其包括至少一种重组嗜热栖热菌！"hermits thermophilus DNA聚合酶(rTth-pol)、适用于支原体16S rRNA逆转录的引物、适用于扩增来源于支原体16S rRNA的cDNA的引物、用于使 rTth-pol失活的离液试剂、用于从反应混合物中除去离液试剂的装置、以及用于通过PCR 例如实时PCR检测来源于支原体16S rRNA的cDNA的引物。用于除去离液试剂的装置可以是DNA结合性离心柱。该试剂盒可以进一步包括例如用于从样本中提取总RNA的手段、载体RNA、校准物RNA、校准物DNA、合适的酶、缓冲液、试剂、反应容器和/或耗材。用于提取总RNA的手段可以是苯酚、氯仿和异丙醇、或含有苯酚、氯仿和异丙醇的缓冲液。以下用实施例进一步阐明本发明，但并不是对本发明作任何限制。 实施例一般工序该方法从离心所关注的生物样本开始，接着从样本团块中提取总RNA。然后使用重组嗜热栖热菌iThermus thermophilus DNA聚合酶(rTth-pol)，在Mn2+存在的条件下在热启动条件下将RNA逆转录成cDNA。在Mn2+螯合并且加入Mg2+后，在热启动条件下，rTth-pol 进行PCR扩增5个循环，或者10个循环(Prime PCR)。然后将PCR反应产物转入含有胍的缓冲液以使rTth-pol失活。基于离心柱(spin column)的试剂盒进行纯化，得到纯化的 Prime PCR的PCR产物，然后在双重的实时PCR(boost PCR)中与DNA标准(校准物DNA) — 起共扩增。作为选择之一，可以在RNA提取开始时将RNA标准(校准物RNA)加入，以便从开始就标准化并控制该工序。
实验工序RNA提取。所有步骤在2mL反应试管中进行。将2mL的样品在4°C下以IOOOrpm 离心IOmin0将团块再悬浮于ImL的RNA-BeeTMCTel-kst公司，德克萨斯州)，加入5yL 的lmg/ml酵母tRNA，并且样品在离心机中于70°C和IOOOrpm下孵育20分钟。此后，加入 110 μ L氯仿，并且通过在13000rpm下离心5分钟而将各相分离。通过将500 μ L异丙醇加入得到的上层相中来沉淀RNA，并且样品被保存在干冰上5分钟。通过在13000rpm下离心 15分钟收集RNA团块，用500 μ L 70%乙醇洗涤，并且样品在13000rpm下离心lOmin。弃去上清液，将RNA团块溶于250 μ L的bidest水中。(bdH20)。逆转录。将6 μ LRT混合物(IyL IOx逆转录缓冲液(APPLY BI0SYSTEM,奥地利)、 IyL 的 IOmM MnCl2、0.5yL 的 10 μ M 反向引物、0. 8 μ L 的 2. 5mM 各种 dNTP，2. 2 μ L(5. 5U) rTth-pol和0. 5 μ LbdH2O)加至4 μ L的RNA萃取物中。逆转录在80°C下进行2min，在62°C 下5分钟，在70°C下IOmin，并且在80°C下^iiin。Prime PCR。将预先加热至85°C 士 5°C的40 μ L PCR混合物G μ LlOx螯合缓冲液 (APPLY BI0SYSTEM,奥地利)、5 μ L 的 25mM MgCl2、2. 5yL 的 10μΜ 正向弓丨物、2yL 的 10μΜ 反向引物和26. 5μ L的bdH20)加至从逆转录得到的反应混合物中。根据下面的方案进行 PCR :80°C下 2min，95°C下 2min，5x(在 95°C下 10 秒，62°C下 30 秒，72°C下 30 秒)。RT失活。在prime PCR后，将50 μ L仍然在热反应的混合物加至253 μ L失活缓冲液(3 μ L载体RNA (1 μ g/μ L酵母tRNA)和250 μ L缓冲液PBI (Qiaquick PCR纯化试剂盒；Qiagen公司，德国))并混合物。将样本施加于在2mL接收管中的Qiaquick微型离心柱 (Qiagen公司，德国)，并且在13000rpm下离心lmin。弃去接收管，将离心柱置于新鲜的接收管中，加入750 μ L缓冲液PE (Qiaquick PCR纯化试剂盒；Qiagen公司，德国)，并且样品于13000rpm下离心lmin。再次弃去接收管，并且在新鲜的接收管中将离心柱于13000rpm 下离心lmin。然后将离心柱置于新鲜的1.5mL反应试管中，加入50μ L的IOmM Tris (ρΗ 8. 0)，并且通过在13000rpm下离心Imin洗脱DNA。Boost PCR0将10 μ L洗脱的DNA放进光学试管中，并且加入5 μ L作为对照物的校准物 DNA 和 35 μ L TMPCR 混合物(lx TaqMan 缓冲液 A (APPLY BI0SYSTEM,奥地利)、5mM MgCl2、200nM每种引物、IOOnM每种探针、200 μ M的每种dNTP、9 %甘油(wt/体积)、0. 05 %明胶(》{/体积)、0.01%吐温20&{/体积)、2. 5U AmpliTaq Gold聚合酶(APPLY BI0SYSTEM, 奥地利))。根据下面的方案进行实时PCR :95°C下10min，40x(95°C下15秒，62°C下lmin)。
实施例1 检测来源于疫苗制造工艺的样本中的滑液囊支原体来源于疫苗制造工艺的样本中被掺入不同含量的滑液囊支原体，并且根据上述实验工序进行操作。为了表明RT失活的有益效果(样本1至6)，对照样品被包括进来，其中 RT未被失活(样本7至12)，或者其中根本没有加入RT (样本13至18)。在RNA提取、逆转录、prime PCR和RT失活后，通过实时PCR分析样本cDNA的存在。在该boost PCR之前，将限定含量的校准物DNA加至反应混合物中。使用不同组的引物，将该校准物DNA与标靶核酸一起扩增。使用不同的标记物探针区分来自校准物DNA和标靶DNA的信号。用于prime PCR和boost PCR的引物对于支原体16S rRNA是特异性的。结果概括于表1中，显示出来自实时PCR的Ct值，即检测特异性PCR产物所需要的循环数。较低的值意味着更简便的检测，反之Ct值40表明在整个实时PCR运行中没有产品可被检测到。
表1 检测来源于疫苗制造工艺的样本中的滑液囊支原体
权利要求
1.一种用于检测生物样本中低丰度标靶RNA种类的方法，其包括下述步骤(a)使用逆转录酶(RT)，将RNA逆转录成cDNA；(b)使RT失活；以及(c)通过聚合酶链反应(PCR)检测标靶cDNA。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物样本具有细胞组分大本底。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物样本具有总RNA大本底。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)是在热启动条件下进行的。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括在步骤(a)之后，使用步骤(a) 中的所述RT扩增标靶cDNA的步骤。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RT是重组的嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)DNA 聚合酶(rTth-pol)。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中通过选自于下组的方法使所述 RT失活热处理、用苯酚处理、用蛋白酶K处理、以及用离液试剂处理。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，通过用离液试剂处理使所述RT失活。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括在步骤(b)之后从反应混合物中除去所述离液试剂的步骤。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述离液试剂选自下组脲、高氯酸锂和胍
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述离液试剂是胍盐。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c)中的聚合酶链反应(PCR)是实时PCR。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标靶RNA源自于支原体。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述支原体选自下组莱德劳无胆甾原体、鸡败血支原体、猪鼻炎支原体、人支原体、发酵支原体、滑液囊支原体、以及口腔支原体。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述标靶RNA是16S核蛋白体RNA。
16.一种用于检测生物样本中支原体污染的方法，其包括下述步骤(a)从生物样本中提取总RNA；(b)使用逆转录酶(RT)，将RNA逆转录成cDNA；(c)使用步骤(b)中的RT，通过聚合酶链反应(PCR)扩增来源于支原体16S核蛋白体 RNA(16S rRNA)的 cDNA ；(d)通过添加离液试剂使RT失活；(e)从反应混合物中除去所述离液试剂；以及(f)通过聚合酶链反应(PCR)检测来源于支原体16SrRNA的cDNA。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，步骤(b)是在热启动条件下进行的。
18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述RT是重组的嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)DNA 聚合酶(rTth-pol)。
19.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述离液试剂选自下组脲、高氯酸锂和胍盐。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述离液试剂是胍盐。
21.如权利要求16所述的方法，其特征在于，步骤(f)中的聚合酶链反应(PCR)是实时PCR。
22.一种用于检测在总RNA大本底中的低丰度标靶RNA种类的试剂盒，其包含至少一种逆转录酶(RT)和用于使RT失活的装置。
23.一种用于检测生物样本中支原体污染的试剂盒，其包含至少一种重组嗜热栖热菌(Thermus thermophilus) DNA聚合酶(rTth-pol)、适用于支原体16S rRNA逆转录的引物、适用于扩增来源于支原体16S核蛋白体RNA(16S rRNA)的cDNA的引物、用于使所述 rTth-pol失活的离液试剂、用于从反应混合物中除去所述离液试剂的装置、以及用于通过实时PCR检测来源于支原体16S rRNA的cDNA的引物。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测生物样本中低丰度RNA种类的方法和试剂盒，并且涉及一种用于检测生物样本中支原体污染的方法和试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK102209794SQ200980145605
公开日2011年10月5日 申请日期2009年11月12日 优先权日2008年11月14日
发明者卡斯滕·乌尔班, 弗朗茨·格鲁贝尔, 托马斯·黑默勒 申请人:巴克斯特保健股份有限公司, 巴克斯特国际公司