专利名称：免疫原性组合物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫原性组合物，其中抗原通过静电相互作用与树突细胞配体联系。 本发明进一步涉及所述组合物用于诱导受试者免疫应答的用途。
背景技术：
人们对于可用于提高人类和其它动物免疫应答特别是预防疾病的组合物的开发有着日益增长的兴趣。在产生免疫应答的过程中，抗原与树突细胞相遇是必要的。树突细胞是免疫细胞并且构成哺乳动物免疫系统的一部分。其主要功能是处理抗原材料并将其呈递在免疫系统其它细胞的表面上，因此其作为抗原呈递细胞发挥功能。之前已经认真思考过抗原对于树突细胞的靶向性并已证明树突细胞上的Toll样受体(Toll-like rec印tor)会对包括脂质的脂肽引起强烈的免疫应答(W0 2004/014956 & WO 2004/014957，将其公开并入本文以作参考)。对于能够诱导有效的抗体应答的任何肽，其必须包含特殊的氨基酸序列(被称为可被免疫系统识别的表位)。特别地，对于抗体应答，表位需要被B淋巴细胞表面存在的特异性免疫球蛋白(Ig)受体识别。正是所述细胞最终分化为能够产生对于所述表位的抗体特异性的浆细胞。除了所述B细胞表位，免疫原还必须包含表位，所述表位通过抗原呈递细胞(APC)向辅助T淋巴细胞上存在的特异性受体呈递，对于提供信号必不可少的所述细胞需要所述B细胞以分化为抗体产生细胞。在病毒感染的情况下以及在癌症的许多情况下，抗体包含在恢复中有限的益处以及对于能够杀死所述病毒感染细胞或癌症细胞的细胞毒性T细胞(CTL)产生应答的所述免疫系统。如同辅助T细胞，CTL首先通过与APC(携带其呈递于所述表面上的特异性肽表位)的相互作用被激活，此时与MHC I级分子而不是II分子联系。一旦激活所述CTL就可以吸引携带相同肽/I级复合体的靶细胞并导致其溶解。愈发明显的是，辅助T细胞在所述过程中发挥作用；在所述APC能够激活所述CTL之前，其必须首先接收来自所述辅助T细胞的信号以上调必需的共刺激分子的表达。辅助T细胞表位通过存在于APC表面上的分子结合，所述APC通过所述主要组织相容性复合体(MHC)的II级基因编码。然后，所述II级分子复合体和肽表位通过T辅助淋巴细胞表面上的特异性T细胞受体(TCR)识别。通过这种方法，在MHC分子前体下的以抗原表位呈递的T细胞可以被激活并提供对于B淋巴细胞分化所必需的信号。然后一般而言，免疫原必须包含能够被辅助T细胞识别的表位，除非所述表位会被B细胞或细胞毒性T细胞识别。显然所述类型的表位可能完全不同。对于B细胞表位， 由于B细胞受体直接结合于天然免疫原，因此构象是重要的。相反地，被T细胞识别的表位不依赖于表位的构象完整性，并且由大约九个氨基酸的短序列构成CTL以及由稍微较长的序列(对于长度的限制较少)构成辅助T细胞。对于所述表位的唯一要求是其能够分别被安置在所述I级或II级分子的结合裂缝中，并且所述复合物然后能够吸引所述T细胞受体。II级分子的结合位点是两端开放的，其允许肽链长度的极大变化(Brown，J. H.，T. S. Jardetzky, J. C. Gorga, L. J. Stern, R. G. Urban, J. L. Strominger 禾口 D. C. Wiley. 1993. Three-dimensional structure of the human class II histocompatibility antigen HLA-DRl. Nature 364 33)尽管已经报道了短如8个氨基酸残基的表位(Fahrer, A.M.， Geysen, H. Μ. , White, D. 0. , Jackson, D. C.禾口 Brown, L. Ε. Analysis of the requirements for class II-restricted T_cell recognition of a single determinant reveals considerable diversity in the T_cell response and degeneracy of peptide binding to I-ED J. Immunol. 1995. 155 :2849_2857)。
发明内容
本发明人已经开发了包含抗原和树突细胞靶向组分的免疫原性组合物，其中所述抗原与所述树突细胞靶向组分静电联系。第一方面，本发明提供包含抗原和树突细胞靶向组分的免疫原性组合物，其中所述抗原包含带负电区域，并且其中所述树突细胞靶向组分包含共价结合于树突细胞配体的带正电基团，并且其中所述抗原的带负电区域与所述树突细胞靶向组分静电联系。第二方面，本发明提供包含抗原和树突细胞靶向组分的免疫原性组合物，其中所述抗原包含带正电区域，并且其中所述树突细胞靶向组分包含共价结合于树突细胞配体的带负电基团，并且其中所述抗原的带正电区域与所述树突细胞靶向组分静电联系。第三方面，本发明提供提高受试者免疫应答的方法，所述方法包含为受试者施用本发明的第一或第二方面的免疫原性组合物。
在下文中，OVA =卵清蛋白；HEL =鸡蛋清溶菌酶；R4(S2Pam2Cys)=图5中1处显示的构造；E4(S2Pam2Cys)=图5中2处显示的构造；CFA =完全弗氏佐剂。图1由接种R4(S2Pam2Cys-OVA)复合物引起的抗体和细胞介导的应答。㈧对成组的BALB/c小鼠接受皮下接种单独的25 μ g OVA、在CFA中乳化的OVA或者与等摩尔的或 5倍摩尔过量的R4 (S2Pam2Cys)混合的0VA。26天后，动物接受第二次相同剂量的抗原。在第一次接种抗原27天后(〇)和第二次接种抗原13天后(·)从血液中获取血清。通过 ELISA测定抗体水平，并且单独的抗体滴度与由横棒表示的平均值一同展示。(B)在第50 天给小鼠第三次接种并在7天后获得脾脏。对脾细胞进行细胞内细胞因子染色以检测产生 SIINFEKL-特异性IFN-γ的⑶8+T细胞的存在。数据以三份样品的平均值和标准偏差表示。图2由接种阳离子和阴离子脂肽_蛋白质复合物引起的OVA和HEL特异性抗体应答。BALB/c小鼠接受皮下接种单独的25 μ g HEL(A)或OVA(B)、在CFA中乳化的所述HEL 或OVA或已与所述抗原混合的等量WR4(S2Pam2Cys)或E4 (S2Pam2Cys。在最初(〇)接种后 28天对小鼠采血，在第32天强化免疫并在第46天(·)再次取血。然后通过ELISA测定抗体水平。单独的动物滴度与由横棒表示的平均值一同展示。图3卵清蛋白-脂肽复合物的沉降。将递增量的支链R4(S2Pam2Cys)或直链 Pam2Cys-SK4脂肽与Inmol的卵清蛋白(OVA)在平底96-孔平板中的总体积为100 μ 1的PBS 中混合。然后通过测定溶液于450nm处的光密度以测量所述溶液的浊度。图4卵清蛋白-R4 (S2Pam2Cys)脂肽溶液的HPLC分析。在含有(A) IOOnmol支链R4(S2Pam2Cys)脂肽、(B)Inmol卵清蛋白(OVA)或(C)离心(1.2X IO5G)后在总体积为 100 μ 1的PBS中的R4(S2Pam2Cys)脂肽和卵清蛋白混合物的溶液的上清液中进行HPLC分析。(D)将由含有所述脂肽和OVA 二者的所述混合物得到的沉淀物材料溶解在50%丙酮的水溶液中，然后通过HPLC分析。在所有含有R4(S2Pam2Cys)的样品中，对应于所述脂肽的峰的确认通过质谱来验证。图5在末端位置包含带正电的(精氨酸，R;赖氨酸，K)或带负电的(天冬氨酸，D; 谷氨酸，Ε)氨基酸以使其各自的静电荷展示于环境中的支链的(构造1-5)和直链的(构造 6-8)免疫原性组合物的一些实例的示意图。每个免疫原性组合物还含有二棕榈酰-S-甘油基半胱氨酸(Pam2Cys)，其是Toll样受体2的配体。两个丝氨酸残基(Ser)也包含在内。 在构造2的情况下所述肽结构以N — C的方向组装，图中所示的所有其它结构均以C — N 组装。正性和负性静电电荷以2-、2+、1-、1+等显示，其取决于电荷的大小。Ac=在谷氨酸位于N-末端的情况下用于抑制α氨基正电荷的乙酰基。发明详述本发明发现共价结合于树突细胞靶向基团的带电部分与抗原静电联系以构成免疫原性复合物，所述免疫原性复合物可用于提高免疫应答。因此，本发明提供了包含抗原和树突细胞靶向组分的免疫原性组合物，其中所述抗原包含带负电区域，并且其中所述树突细胞靶向组分包含与树突细胞配体共价结合的带正电基团，并且其中所述抗原的带负电区域与所述树突细胞靶向组分静电联系。 在本发明的这个方面，重要的是所述抗原包括能够与所述带电靶向组分发生静电相互作用的带负电区域或领域。然而，所述抗原具有整体的负电荷不是必不可少的，尽管是优选的。通过加入带负电基团还可能增加所述抗原的负电荷。例如，对于多肽抗原而言，天冬氨酸或谷氨酸残基链可以被加入到所述多肽中。优选地，所述带正电基团包含至少一个带正电氨基酸。还优选地，所述带正电基团是支链的或直链的肽，优选为支链的。在多种实施方案中，所述肽包括至少一个精氨酸、组氨酸、鸟氨酸或赖氨酸残基或其组合。优选地，所述肽包含至少四个精氨酸残基和/或至少四个赖氨酸残基。特别优选地，所述带正电基团包含支链肽，所述支链肽包含至少4个精氨
酸残基。第二方面，在本发明提供了包含抗原和树突细胞靶向组分的免疫原性组合物，其中所述抗原包含带正电区域，并且其中所述树突细胞靶向组分包含共价结合于树突细胞配体的带负电基团，并且其中所述抗原的带正电区域与所述树突细胞靶向组分静电联系。在本发明的这个方面，重要的是所述抗原包括能够与所述带电靶向组分发生静电相互作用的带正电区域或领域。然而，所述抗原具有整体的正电荷不是必不可少的，尽管是优选的。通过加入带正电基团还可能增加所述抗原的正电荷。例如，对于多肽抗原而言，赖氨酸、精氨酸或组氨酸残基链可以被加入到所述多肽中。优选地，所述带负电基团包含至少一个带负电氨基酸。还优选地，所述带负电基团是支链的或直链的肽，优选为支链的。在多种实施方案中，所述肽包括至少一个天冬氨酸或谷氨酸残基或其组合。优选地，所述肽包含至少四个天冬氨酸残基和/或至少四个谷氨酸残基。特别优选地，所述带正电基团包含支链肽，所述支链肽包含至少4个谷氨酸残基。在本发明的优选实施方案中，所述抗原不是核酸。还优选地，所述抗原与所述树突细胞靶向组分仅通过静电相互作用联系。可在本发明中使用的一系列树突细胞配体列举在表1中。然而，优选地，所述树突细胞配体是TLR配体。所述TLR配体可包含脂质或肽聚糖或脂蛋白或脂多糖。特别地，所述TLR配体可包含棕榈酰基、肉豆蔻酰基、硬脂酰基、月桂酰基、辛酰基或癸酰基。优选地， 所述 TLR 配体选自 Pam2Cys、Pam3Cys、Ste2Cys、Lau2Cys 和 0ct2Cys。在某个实施方案中，所述TLR配体结合TLR-2，所述TLR配体可与TLR-I或TLR-6 联系。第三方面，本发明提供了提高受试者免疫应答的方法，所述方法包含为受试者施用根据本发明的第一或第二方面的免疫原性组合物。
权利要求
1.一种免疫原性组合物，其包含抗原和树突细胞靶向组分，其中所述抗原包含带负电区域并且其中所述树突细胞靶向组分包含与树突细胞配体共价连接的带正电基团并且其中所述抗原的带负电区域与所述树突细胞靶向组分静电联系。
2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述抗原具有整体负电荷。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的免疫原性组合物，其中所述带正电基团包含至少一个带正电的氨基酸。
4.根据权利要求1至3任一项所述的免疫原性组合物，其中所述带正电基团是支链的或直链的肽。
5.根据权利要求3所述的免疫原性组合物，其中所述肽包含至少一个精氨酸或赖氨酸残基。
6.根据权利要求3或权利要求4所述的免疫原性组合物，其中所述肽包含至少四个精氨酸残基和/或至少四个赖氨酸残基。
7.一种免疫原性组合物，其包含抗原和树突细胞靶向组分，其中所述抗原包含带正电区域并且其中所述树突细胞靶向组分包含与树突细胞配体共价连接的带负电基团并且其中所述抗原的带正电区域与所述树突细胞靶向组分静电联系。
8.根据权利要求7所述的免疫原性组合物，其中所述抗原具有整体正电荷。
9.根据权利要求7或权利要求8所述的免疫原性组合物，其中所述带负电基团包含至少一个带负电的氨基酸。
10.根据权利要求7至9任一项所述的免疫原性组合物，其中所述带负电基团是支链的或直链的肽。
11.根据权利要求10所述的免疫原性组合物，其中所述肽包含至少一个天冬氨酸或谷氨酸残基。
12.根据权利要求10或权利要求11所述的免疫原性组合物，其中所述肽包含至少四个天冬氨酸残基和/或至少四个谷氨酸残基。
13.根据权利要求1至12任一项所述的免疫原性组合物，其中所述抗原不是核酸。
14.根据权利要求1至13任一项所述的免疫原性组合物，其中所述抗原与树突细胞靶向组分仅通过静电相互作用联系。
15.根据权利要求1至14任一项所述的免疫原性组合物，其中所述树突细胞配体是 TLR配体。
16.根据权利要求15所述的免疫原性组合物，其中所述TLR配体包含脂质或肽聚糖或脂蛋白或脂多糖。
17.根据权利要求15或权利要求16所述的免疫原性组合物，其中所述TLR配体包含棕榈酰基、肉豆蔻酰基、硬脂酰基、月桂酰基、辛酰基或癸酰基。
18.根据权利要求15至17任一项所述的免疫原性组合物，其中所述TLR配体选自 Pam2Cys λ Pam3Cys、Ste2Cys、Lau2Cys 禾口 Oct2Cys0
19.根据权利要求15至18任一项所述的免疫原性组合物，其中所述TLR配体结合 TLR-l、TLR-2 或 TLR-6。
20.根据权利要求15至19任一项所述的免疫原性组合物，其中所述TLR配体结合 TLR-2。
21. 一种提高受试者免疫应答的方法，所述方法包含为受试者施用根据权利要求1至 20任一项所述的免疫原性组合物。
全文摘要
本发明提供包含抗原和树突细胞靶向组分的免疫原性组合物。带电基团共价连接于树突细胞配体并与树突细胞靶向组分静电联系。
文档编号A61K38/38GK102448485SQ200980159611
公开日2012年5月9日 申请日期2009年4月16日 优先权日2009年4月9日
发明者B·Y·L·蔡, D·C·杰克逊, W·曾 申请人:墨尔本大学