专利名称：免疫原性组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫学领域，特别地，涉及肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)抗原及其在免疫中的用途。
背景技术：
肺炎链球菌是相当普遍存在的人病原体，在健康儿童和成人的上呼吸道中经常发现。这些细菌可感染数个器官(包括肺、中枢神经系统(CNS)、中耳和鼻道)并引起一系列的疾病(即有症状的感染)，例如窦感染、中耳炎、支气管炎、肺炎、脑膜炎和菌血症(败血症)。尽管抗生素治疗，肺炎球菌性脑膜炎(这些肺炎球菌性疾病的最严重形式)还是与显著的死亡率和发病率有关(Quagliarello等(1992)N. Engl. J. Med. 327 :864-872)。两岁以下的儿童和老年人特别易受有症状的肺炎球菌感染。目前，有两种可得的肺炎球菌疫苗类型。第一种包含来自23种类型的肺炎链球菌的荚膜多糖，它们总共代表约90 %引起肺炎球菌感染的菌株的荚膜类型。然而，该疫苗在幼儿中不是非常免疫原性的，幼儿是高度易受肺炎球菌感染的年龄组，因为他们在2岁之前不对多糖抗原产生良好的免疫反应。在成年人中，该疫苗对菌血症性肺炎已显示约60%有效，但由于年龄或基础医疗条件，在肺炎球菌感染风险较高的成年人中有效性较差(Fedson和 Musher 2004, “Pneumococcal Polysaccharide Vaccine (肺炎球菌多糖疫苗)”,第529-588 页；载于 Vaccines. S. A. Plotikin 和 ff. A. Orenstein (主编),W. B. Saunders andCo.，Philadelphia, PA ；Shapiro 等，N. Engl. J. Med. 325 :1453-1460 (1991))。第二种可得的类型是缀合疫苗。这些疫苗包含与蛋白载体缀合的血清型特异性荚膜多糖抗原，引起血清型-特异性保护(9)。目前可得的是7-价和13-价缀合疫苗7_价包含7种多糖抗原(来源于血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的荚膜)，而13-价包含13种多糖抗原(除了 7-价涵盖的那些外，还来源于血清型1、3、5、6A、7F和19A的荚膜)。亦开发了 9-价和11-价缀合疫苗，且各包含对不被7-价涵盖的血清型特异的多糖(即9-价中的血清型I和5和11-价中的型3和7F)。缀合疫苗的生产是复杂和昂贵的，部分由于需要产生7(或9或11)种与蛋白载体各自缀合的不同多糖。这样的疫苗也不能很好地涵盖发展中世界的感染，在发展中世界，不被缀合疫苗涵盖的肺炎链球菌的血清型是非常常见的(Di Fabio等，Pediatr. Infect.Dis. J. 20 :959-967(2001) ；Mulholland, Trop.Med. Int. Health 10 :497-500(2005))。使用7-价缀合疫苗亦显示引起具有不被疫苗中所包含的7种多糖代表的荚膜类型的菌株的定植增加和疾病(Bogaert 等，Lancet Infect. Dis. 4 :144-154 (2004) ;Eskola 等，N. Engl.J. Med. 344-403-409(2001) ;Mbelle 等，J. Infect. Dis. 180 :1171-1176 (1999))。
作为目前可得的基于多糖的疫苗的备选，许多肺炎链球菌抗原已被建议作为针对肺炎链球菌的基于蛋白的疫苗的可能候选物。然而，到目前为止，没有这样的疫苗在市场上是目前可得的。因此，仍需要对肺炎链球菌的有效治疗。概述描述用于引起针对链球菌感染(例如肺炎链 球菌)的免疫反应的免疫原性组合物和方法。更具体地，本公开涉及包含免疫原性PcpA多肽和/或多组氨酸三联体家族的免疫原性多肽(PhtX:PhtA、B、D、E)的免疫原性组合物、用于其产生的方法及其用途。也提供免疫原性PcpA和PhtX多肽(例如PhtD)(包括PcpA和PhtD的片段以及各自的变体)和编码这些多肽的核酸。免疫原性组合物包含免疫原性PcpA多肽和/或多组氨酸三联体家族的免疫原性多肽(PhtX =PhtA, B、D、E)和/或解毒的肺炎链球菌溶血素。另外提供制备针对链球菌多肽的抗体的方法和使用这样的抗体用于治疗和/或预防链球菌感染(例如肺炎链球菌感染)的方法。还提供组合物，例如药物组合物(例如,疫苗组合物)，其包含一种或多种免疫原性PcpA多肽、PhtX多肽和/或解毒的肺炎链球菌溶血素蛋白。任选地，组合物可包含佐剂。组合物亦可包含一种或多种药学上可接受的赋形剂，相对于没有一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物，其增加多肽/蛋白的热稳定性。在一个实例中，相对于没有一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物，一种或多种药学上可接受的赋形剂使PcpA、PhtX和/或解毒的肺炎链球菌溶血素蛋白的热稳定性增加O. 5°C以上。组合物可为液体形式、干粉形式、冷冻干燥的、喷雾干燥的和或泡沫干燥的。一种或多种药学上可接受的赋形剂可例如选自缓冲剂、张度剂、简单碳水化合物、糖、碳水化合物聚合物、氨基酸、寡肽、多氨基酸、多元醇及其醚、洗涤齐IJ、脂质、表面活性齐U、抗氧化齐U、盐、人血清白蛋白、明胶、甲醛或者它们的组合。还提供诱导受试者中对肺炎链球菌的免疫反应的方法,其涉及给予受试者本文所述的组合物。还提供本发明的组合物在诱导受试者中对肺炎链球菌的免疫反应中的用途或在制备用于在该目的中使用的药物中的用途。本发明提供数个优势。例如，将本发明的组合物给予受试者引起针对许多肺炎链球菌菌株感染的免疫反应。此外，本发明的多价组合物包含肺炎链球菌免疫原性多肽的特定组合，当给予时，其不经历抗原干扰并可提供累加效应。使用本文所述的赋形剂可引起组合物内的多肽/蛋白的热稳定性增加。本发明的其他特征和优势从下述详述、附图和权利要求中将显而易见。附图简述参考附图，从下述描述将进一步理解本发明，其中图I描绘用不同剂量的PcpA和PhtD免疫的小鼠的血清抗-蛋白IgG抗体效价(实施例2)。在该研究中，将重组PhtD和PcpA与Α100Η佐剂组合作为单价或二价制剂。将Balb/c小鼠以3周间隔皮下免疫3次，并在第一次免疫前和第一、第二和第三次免疫后收集血液。通过终点ELISA评估IgG效价。所有已接受PcpA和PhtD蛋白的小鼠在免疫后都产生了抗原-特异性抗体反应。图2a_d描绘用50 μ g抗原/剂量的PcpA和/或PhtD免疫的大鼠的血清抗-蛋白IgG抗体效价。在该研究中，将大鼠在第0、21和42天使用50 μ g抗原/剂量用对照Tris缓冲盐水(IOmM Tris pH 7. 4,150mM NaCl)、佐以氢氧化铝的二价PhtD和PcPA、无佐剂的二价PhtD和PcPA或者佐以氢氧化铝的PcpA免疫大鼠。将来自测试前、第44天和第57天出血的血清通过ELISA测试抗PhtD的抗体效价和PcpA特异性IgG抗体效价。图3描绘各组的免疫小鼠的存活百分比(实施例5)。在该研究中，使用鼻内攻击模型评价重组PhtD和PcpA的二价制剂。用致死剂量的肺炎链球菌菌株(MD，14453或941192)攻击免疫的动物。图4a、4b。图4a描绘通过终点稀释ELISA测量的总抗原-特异性IgG效价和各组的几何平均效价(+/-SD)。图4b描绘通过定量ELISA测量的总抗原-特异性效价。在该研究中(实施例7)，(使用两个不同批次的各PhtD和PcpA)制备PhtD和PcpA的二价组合物并与磷酸盐处理的A100H(2mM)配制。将多组的6只雌性CBA/j小鼠用合适的制剂以3周间隔肌内或皮下免疫3次。第3次(最后)出血后，用致死剂量的肺炎链球菌菌株MD攻击小鼠。图5描绘各组的存活百分比。在该研究中(实施例6)，(使用两个不同批次的各 PhtD和PcpA)制备PhtD和PcpA的二价组合物并与磷酸盐处理的A100H(2mM)配制。将多组的6只雌性CBA/j小鼠用合适的制剂以3周间隔肌内或皮下免疫3次。第3次出血后，用致死剂量的肺炎链球菌菌株MD攻击小鼠。图6描绘通过相应的兔抗血清识别在Mn2+缺失的培养基中生长的各种肺炎球菌菌株的细菌表面上的PcpA和PhtD (实施例9)。图7描绘纯化的人抗-PcpA和抗-PhtD抗体与菌株WU2的细菌细胞表面上的蛋白(PcpA、PhtD)的结合(实施例9)。图8描绘每log给予的稀释血清所观察到的％存活(实施例10)。图9描绘通过ELISA测量的总IgG效价的概况(实施例11)。
图10a-f单价和二价制剂(用AlO(OH)或磷酸盐处理的AlO(OH) (PTH)配制)中PcpA和PhtD的稳定性。使用AlO(OH)或具有终浓度为2mM磷酸盐的PTH制备制剂，然后在各种温度(即5°C、25°C、37°C或45°C )下孵育。然后通过RP-HPLC评估完整的抗原浓度。图IlPhtD和PcpA在应激条件下的稳定性，如通过ELISA评价。将100 μ g/mL的二价制剂在37°C孵育12周并通过ELISA评价抗原性。图12A 在 10%山梨糖醇(_)、10% 海藻糖(·)、10% 蔗糖(A)、TBS pH 9. O ( )和TBS pH 7.4( O )存在下，通过RP-HPLC研究赋形剂对PcpA(在50°C储存3天)稳定性的影响。图12B在10%山梨糖醇、10%海藻糖、10%蔗糖、TBS pH 9. O和TBS pH 7. 4存在下，通过定量夹心ELISA研究赋形剂对PcpA (在50°C储存3天)抗原性的影响。将制剂在50°C储存3天。对于各制剂，在零时(白条)和三天储存后(黑条)评价抗原性。图13pH对有佐剂的蛋白物理稳定性的影响。将PcpA(A)、PhtD(B)和PlyDl (C)佐以不同PH值的氢氧化铝或磷酸铝，并通过荧光迹线的导数分析获得Tm值。图14描绘通过终点稀释ELISA测量的总抗原_特异性IgG效价和各组的几何平均效价(+/-SD) ο图15A、B、C描绘给予小鼠的每抗原剂量引起的总抗原-特异性IgG效价，如通过ELISA测量。
发明详述描述用于引起哺乳动物中针对肺炎链球菌的免疫反应以及用于治疗和预防哺乳动物中由肺炎链球菌引起的疾病的组合物和方法，哺乳动物例如人。提供包含免疫原性PcpA多肽和/或多组氨酸三联体家族的免疫原性多肽(PhtX PhtA, PhtB, PhtD, PhtE)的免疫原性组合物、用于其产生的方法及其用途。组合物可包含解毒的肺炎链球菌溶血素或其免疫原性片段。方法包括被动和主动免疫法，其包括给予(例如皮下、肌内)包含一种或多种实质上纯的肺炎球菌(例如，肺炎链球菌)多肽、抗多肽自身的抗体或者它们的组合的免疫原性组合物。本发明亦包括链球菌属(例如，肺炎链球菌)多肽，包含肺炎球菌多肽的免疫原性组合物(例如，疫苗)，产生这样的组合物的方法和产生肺炎球菌(例如，肺炎链球菌)抗体的方法。下文进一步描述这些方法和组合物。本发明的组合物包含一、二、三或更多种免疫原性多肽。组合物可单独或组合地包含例如PcpA的免疫原性多肽、多组氨酸三联体家族蛋白成员(例如，PhtA, PhtB, PhtD和PhtE，本文引用为PhtX蛋白)的免疫原性多肽、解毒的肺炎链球菌溶血素多肽。亦可在组
合物中包含这些多肽的免疫原性片段和融合物(例如PhtB和PhtE的融合物)。这些免疫原性多肽可任选与肺炎球菌糖或其他肺炎球菌多肽组合使用。在一个多组分实例中，免疫原性组合物包含免疫原性PcpA多肽和一种或多种免疫原性Phtx多肽。这种组合物的一个优选实施方案包含免疫原性PhtD多肽和免疫原性PcpA多肽。在另一实例中，组合物包含免疫原性PcpA多肽、免疫原性PhtX多肽(例如，PhtD)和解毒的肺炎链球菌溶血素。在本文实施例中描述免疫原性组合物(例如，以二价和三价形式)的某些实施方案。多肽免疫原性PcpA多肽包含全长PcpA氨基酸序列(存在或不存在信号序列)、其片段及其变体。适用于本文所述的组合物中使用的PcpA多肽包括例如来自肺炎链球菌菌株B6的GenBank登录号CAB04758、来自肺炎链球菌菌株TIGR4的GenBank登录号NP_和来自肺炎链球菌菌株R6的GenBank登录号NP_359536的那些，和来自肺炎链球菌菌株14453的那些。肺炎链球菌14453基因组中的全长PcpA的氨基酸序列是SEQID NO :2。用于与本发明一起使用的优选PcpA多肽包含与SEQ IDNO 2或SEQ ID NO 7具有50%以上(例如60、65、70、75、80、85、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99· 5 以上)同一性的氨基酸序列。用于与本发明一起使用的优选多肽包含SEQ IDNO 2的至少8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250个以上的连续氨基酸的片段。优选的片段包含来自SEQ ID NO :2的表位。其他优选的片段缺失来自SEQ ID NO :2的N端的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25以上)氨基酸和/或来自SEQ ID NO 2的C端的一个或多个氨基酸，同时保留SEQ ID NO :2的至少一个表位。另外优选的片段缺失来自SEQ ID NO :2的N端的信号序列。优选的PcpA多肽是SEQ ID NO :7。任选地，PcpA的免疫原性多肽包含一个或多个富亮氨酸区(LRR)。这些LLR存在于天然存在的PcpA中，或与天然存在的LRR具有约60-约99 %序列同一性(包括，例如80 %、85%、90%或95%序列同一性)。成熟PcpA蛋白(即缺失信号肽的蛋白)中的LRR可在WO2008/022302中公开的特定序列(例如WO 2008/022302的SEQ IDNO :1、2、41和45)中发现。PcpA的免疫原性多肽任选缺失通常存在于天然存在的成熟PcpA蛋白中的胆碱结合结构域锚序列。成熟PcpA蛋白的胆碱结合锚的天然存在的序列公开于WO 2008/022302的SEQ ID NO 520更具体地，免疫原性多肽包含具有一个或多个氨基酸取代的天然存在的PcpA的N端区，且该N端区与天然存在的PcpA有约60-约99%序列同一性或在两者之间的任何同一性(例如80、85、90和95%同一性)。在一个或多个保守氨基酸取代存在或不存在下和在信号序列存在或不存在下，N端区可包含SEQ ID NO :2 (或W02008/022302的SEQID NO :1、2、3、4、41或45)的氨基酸序列。N端区可包含与SEQ ID N0:1或7(在本文序列表中所示)或W02008/022302的SEQID NO :1、2、3、4或41有约60-约99%序列同一性(或80-99 %同一性之间的任何同一性)的氨基酸序列。SEQ ID NO :2 和 7 的免疫原性片段包含 SEQ ID NO :2 和 7 的 5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190 和 191 个氨基酸残基或者5-191之间任何数量的氨基酸残基。PcpA的免疫原性片段的实例公开于W02008/022302。 任选地，PcpA的免疫原性多肽缺失LRR。缺失LRR的免疫原性多肽的实例公开于WO 2008/022302 的 SEQ ID NO :29、SEQ IDNO 30 和 SEQ ID NO :31。适用于本发明组合物的免疫原性PhtX多肽包含全长PhtA、PhtB, PhtD或PhtE氨基酸序列(存在或不存在信号序列)、其免疫原性片段、其变体及其融合蛋白。适用于本文所述的组合物中使用的PhtD多肽包括，例如尤其GenBank登录号AAK06760、YP816370和NP35851的那些。肺炎链球菌14453基因组中的全长PhtD的氨基酸序列是SEQ ID NO :1。优选的PhtD多肽(来源于肺炎链球菌14453基因组)是SEQ ID NO :5。本发明的PhtX多肽的免疫原性片段能够引起对相应的全长成熟氨基酸序列特异的免疫反应。免疫原性PhtX(例如，PhtD)多肽包括连接有信号序列的全长蛋白、移除信号序列(例如，N端上的20个氨基酸)的成熟全长蛋白、PhtX的变体(天然存在的或另外例如合成来源的)和PhtX的免疫原性片段(例如，包含存在于天然存在的成熟PhtX蛋白中的至少15或20个连续氨基酸的片段)。PhtD的免疫原性片段的实例公开于PCT公布W02009/012588。用于与本发明一起使用的优选PhtD多肽包含与SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :5具有 50% 以上(例如 60、65、70、75、80、85、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99· 5 以上)同一性的氨基酸序列。用于与本发明一起使用的优选多肽包含SEQ ID N0:1的至少8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 个以上的连续氨基酸的片段。优选的片段包含来自SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 5的表位。其他优选的片段缺失来自SEQ ID NO 1的N端的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25以上)氨基酸和/或来自SEQ ID NO :1的C端的一个或多个氨基酸，同时保留SEQ ID NO :1的至少一个表位。另外优选的片段缺失来自SEQ ID NO :1的N端的信号序列。优选的PhtD多肽是 SEQ ID NO 5o肺炎链球菌溶血素(Ply)是涉及肺炎球菌发病机制的多个步骤(包括抑制纤毛搏动和破坏上皮细胞之间的紧密连接)的溶细胞-活化毒素(Hirst等Clinical andExperimental Immunology (2004))。数种肺炎链球菌溶血素是已知的,且(解毒后)可适用于本文所述的组合物中使用，包括例如尤其GenBank登录号Q04IN8、P0C2J9、Q7ZAK5和AB021381。在一个实施方案中，Ply具有SEQ ID NO : 10中所示的氨基酸序列。用于与本发明一起使用的免疫原性肺炎链球菌溶血素多肽包括连接有信号序列的全长蛋白、移除信号序列的成熟全长蛋白、肺炎链球菌溶血素的变体(天然存在的或另外例如合成来源的)和肺炎链球菌溶血素的免疫原性片段(例如，包含存在于天然存在的成熟肺炎链球菌溶血素蛋白中的至少15或20个连续氨基酸的片段)。本发明的免疫原性肺炎链球菌溶血素多肽的免疫原性变体和片段能够引起对相应的全长成熟氨基酸序列特异的免疫反应。本发明的免疫原性肺炎链球菌溶血素多肽是解毒的；即，与由肺炎链球菌产生并释放的成熟野生型肺炎链球菌溶血素蛋白相比，它们没有或具有降低的毒性。本发明的免疫原性肺炎链球菌溶血素多肽可被例如化学(例如，使用甲醛处理)或遗传(例如，以突变形式重组产生)解毒。用于本发明中使用的免疫原性解毒的肺炎链球菌溶血素的优选实例公开于PCT公布号WO 2010/071986。如该篇申请中所公开，解毒的肺炎链球菌溶血素可为在野生型序 列的位置65、293和428上包含氨基酸取代的突变体肺炎链球菌溶血素蛋白。在优选的解毒的肺炎链球菌溶血素蛋白中，三个氨基酸取代包含T65 — C、G293 — C和C428 — A0优选的免疫原性并解毒的肺炎链球菌溶血素多肽是SEQ IDNO :9。用于与本发明一起使用的优选肺炎链球菌溶血素多肽包含与SEQ ID NO 9或SEQID NO :10具有 50% 以上(例如60、65、70、75、80、85、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99. 5以上)同一性的氨基酸序列。用于与本发明一起使用的优选多肽包含SEQ ID NO :9或
10的至少 8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 个以上的连续氨基酸的片段。优选的片段包含来自SEQ ID NO :9或SEQ IDNO 10的表位。其他优选的片段缺失来自SEQ ID NO :9或10的N端的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25以上)氨基酸和/或来自SEQ ID NO :9或10的C端的一个或多个氨基酸，同时保留SEQ ID NO 9或10的至少一个表位。另外优选的片段缺失来自SEQ ID NO 10的N端的信号序列。本文所述的PcpA、PhtX(例如，PhtD)和肺炎链球菌溶血素的免疫原性多肽及其片段包括变体。使用本领域公知的方法，针对其免疫原性能力选择本文所述的免疫原性多肽的这种变体，这种变体可包含一种或多种保守氨基酸修饰。免疫原性多肽(PcpA、PhtD、肺炎链球菌溶血素)的变体包含具有与公开的序列(即，SEQ ID NO :2或7 (PcpA) ；SEQ IDN0:1 或 5(PhtD) ；SEQ ID NO :9 或 10 (Ply))有约 60-约 99%序列同一性(或 60-99% 同一性之间的任何同一性)的氨基酸序列。氨基酸序列修饰包括取代、插入或缺失改变。取代、缺失、插入或其任何组合可在单个变体中组合，只要变体是免疫原性多肽即可。插入包括氨基和/或羧基端融合物以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。与氨基或羧基端融合物的那些相比，插入通常将为较小的插入，例如大约1-4个残基。缺失的特征是从蛋白序列中移除一个或多个氨基酸残基。通常在蛋白分子内的任何一个位点上缺失不超过约2-6个残基。通常通过位点特异性诱变编码蛋白的DNA中的核苷酸，藉此产生编码变体的DNA，并其后在重组细胞培养物中表达DNA，制备这些变体。用于在具有已知序列的DNA中的预定位点进行取代突变的技术是公知的，并包括但不限于M13引物诱变和PCR诱变。氨基酸取代通常为单残基但可同时在许多不同位置发生。取代的变体是其中至少一个残基已被移除并在该位置上插入不同的残基的那些。这种取代通常按照下表进行并称为保守取代。其他的取代是本领域技术人员是公知的。本文使用的氨基酸取代可为保守或非保守的。保守氨基酸取代可涉及将天然氨基酸残基用非天然残基取代，使得对该位置上氨基酸残基的尺寸、极性、电荷、疏水性或亲水性有很少或没有影响，并特别地，不导致免疫原性降低。合适的保守氨基酸取代在下文表I中示出。表I
权利要求
1.一种免疫原性组合物，其包含分离的免疫原性肺炎链球菌PcpA多肽和选自多组氨酸三联体家族蛋白的分离的免疫原性肺炎链球菌多肽。
2.一种用于在受试者中针对由肺炎链球菌感染引起的疾病赋予保护的免疫原性组合物，其包含分离的免疫原性肺炎链球菌PcpA多肽和选自多组氨酸三联体家族蛋白的分离的免疫原性肺炎链球菌多肽。
3.权利要求I或2的组合物，其中所述组合物包含分离的免疫原性肺炎链球菌PcpA多肽和分离的免疫原性肺炎链球菌PhtD多肽或者它们的融合蛋白。
4.权利要求3的组合物，其中所述PhtD多肽的氨基酸序列与如在SEQID NO: I中所示的氨基酸序列具有至少80%序列同一性。
5.权利要求3的组合物，其中所述PhtD多肽是重组产生的。
6.权利要求5的组合物，其中所述重组产生的PhtD多肽是缺失信号肽序列的N端截短物。
7.权利要求3的组合物，其中所述PhtD蛋白包含具有与如在SEQID NO: 5中所示的氨基酸序列有至少80%序列同一性的氨基酸序列的多肽。
8.权利要求1-7中任一项的组合物，其中所述PcpA多肽是重组产生的。
9.权利要求8的组合物，其中所述PcpA多肽是缺失信号肽序列的N端截短物。
10.权利要求I的组合物，其中所述PcpA多肽的氨基酸序列与如在SEQID NO: 2中所示的氨基酸序列具有至少80%序列同一性。
11.权利要求I的组合物，其中所述PcpA多肽的氨基酸序列与如在SEQID NO: 7中所示的氨基酸序列具有至少80%序列同一性。
12.一种免疫原性组合物，其包含具有与如在SEQ ID NO: I中所示的氨基酸序列有至少80%同一性的氨基酸序列的分离多肽和具有与如在SEQ ID NO: 2中所示的氨基酸序列有至少80%同一性的氨基酸序列的分离多肽。
13.—种免疫原性组合物，其包含具有与如在SEQ ID NO: 5中所示的氨基酸序列有至少80%同一性的氨基酸序列的分离多肽和具有与如在SEQ ID NO: 7中所示的氨基酸序列有至少80%同一性的氨基酸序列的分离多肽。
14.一种免疫原性组合物，其包含具有与如在SEQ ID NO: 2中所示的氨基酸序列有至少80%同一性的氨基酸序列的分离多肽和具有与如在SEQ ID NO: 5中所示的氨基酸序列有至少80%同一性的氨基酸序列的分离多肽。
15.权利要求3的组合物，其包含 约5-100 μ g/剂量的PhtD多肽和 约5-100 μ g/剂量的PcpA多肽。
16.权利要求1-15中任一项的组合物，其中所述组合物另外包含肺炎链球菌溶血素。
17.权利要求16的组合物，其中所述肺炎链球菌溶血素是解毒的。
18.权利要求17的组合物，其中所述解毒的肺炎链球菌溶血素是在野生型序列的位置65、293和428上包含氨基酸取代的突变体肺炎链球菌溶血素蛋白。
19.权利要求18的组合物，其中三个氨基酸取代包含T65— C、G293 — C和C428 — A0
20.权利要求18的组合物，其中所述组合物包含约5-100μ g/剂量的所述肺炎链球菌溶血素。
21.权利要求1-20中任一项的组合物，其中所述组合物另外包含佐剂。
22.权利要求21的组合物，其中所述佐剂选自氢氧化铝、磷酸铝和磷酸盐处理的氢氧化铝。
23.一种疫苗药盒，其包含权利要求1-20中任一项的免疫原性组合物和用于伴随或序贯给药的佐剂。
24.一种疫苗，其包含权利要求1-22中任一项的免疫原性组合物和药学上可接受的赋< >形剂。
25.—种用于制备权利要求24的疫苗的方法,其包括将权利要求1-22中任一项的免疫原性组合物与药学上可接受的赋形剂混合的步骤。
26.—种针对由肺炎链球菌感染引起的疾病免疫人受试者的方法,其包括给予受试者免疫有效量的权利要求1-22中任一项的免疫原性组合物或权利要求24的疫苗。
27.权利要求26的方法，其中所述人受试者是婴儿和所述疾病是脑膜炎和/或菌血症。
28.权利要求26的方法，其中所述人受试者是婴儿和所述疾病是肺炎和/或结膜炎。
29.权利要求26的方法，其中所述人受试者是婴儿和所述疾病是中耳炎。
30.权利要求26的方法，其中所述疾病是肺炎或浸润性肺炎球菌性疾病。
31.权利要求1-22的免疫原性组合物在制备用于治疗或预防由肺炎链球菌感染引起的疾病的药物中的用途。
32.一种引起哺乳动物中的针对肺炎链球菌的保护性免疫反应的方法，其包括给予所述哺乳动物免疫有效量的权利要求1-22中任一项的免疫原性组合物或权利要求24的疫苗。
33.权利要求1-22中任一项的组合物在制备用于预防受试者中由肺炎链球菌引起的疾病或降低其严重性的药物中的用途，其中给予受试者免疫有效量的组合物。
34.权利要求2的组合物，其另外包含至少一种用于针对由肺炎链球菌感染引起的疾病赋予保护的另外的抗原性组分。
35.权利要求I的组合物，其中所述分离的多肽各以不损害所述多肽各自免疫原性的量存在。
36.权利要求I的组合物在制备用于引起哺乳动物中的免疫反应的药物中的用途。
37.权利要求I的组合物在制备用于引起哺乳动物中的免疫反应以保护免受肺炎球菌感染的药物中的用途。
38.一种用于引起哺乳动物中的免疫反应的方法，其包括给予哺乳动物有效量的权利要求1-22中任一项的组合物的步骤。
39.一种用于治疗或预防哺乳动物中的链球菌属细菌物种感染的方法，其包括给予哺乳动物特异性结合与SEQ ID NO: I有至少80%同一性的多肽的抗体和特异性结合与SEQID NO: 2有至少80%同一性的多肽的抗体。
40.一种用于治疗或预防哺乳动物中的链球菌属细菌物种感染的方法，其包括给予哺乳动物特异性结合与SEQ ID NO: 5有至少80%同一性的多肽的抗体和特异性结合与SEQID NO: 7有至少80%同一性的多肽的抗体。
41.一种免疫原性组合物，其包含分离的免疫原性肺炎链球菌PcpA多肽、至少一种另外的肺炎链球菌多肽和水包油佐剂乳剂； 所述水包油佐剂乳剂包含至少鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子表面活性剂和疏水性非离子表面活性剂，其中所述乳剂是热可逆的且其中90%体积的油滴具有小于200 nm的尺寸。
42.一种用于在受试者中针对由肺炎链球菌引起的疾病赋予保护的免疫原性组合物，其包含分离的免疫原性肺炎链球菌PcpA多肽和至少一种另外的肺炎链球菌多肽，和水包油佐剂乳剂； 所述水包油佐剂乳剂包含至少鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子表面活性剂和疏水性非离子表面活性剂，其中所述乳剂是热可逆的且其中90%体积的油滴具有小于200 nm的尺寸。
43.权利要求41或42的免疫原性组合物，其中所述组合物另外包含肺炎链球菌溶血素。
44.权利要求43的免疫原性组合物，其中所述肺炎链球菌溶血素是解毒的。
45.权利要求44的免疫原性组合物，其中所述肺炎链球菌溶血素已被遗传解毒。
46.一种免疫原性组合物，其包含分离的免疫原性肺炎链球菌PhtD多肽、至少一种另外的肺炎链球菌多肽和水包油佐剂乳剂； 所述水包油佐剂乳剂包含至少鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子表面活性剂和疏水性非离子表面活性剂，其中所述乳剂是热可逆的且其中90%体积的油滴具有小于200 nm的尺寸。
47.一种用于在受试者中针对由肺炎链球菌引起的疾病赋予保护的免疫原性组合物，其包含分离的免疫原性肺炎链球菌PhtD多肽和至少一种另外的肺炎链球菌多肽，和水包油佐剂乳剂； 所述水包油佐剂乳剂包含至少鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子表面活性剂和疏水性非离子表面活性剂，其中所述乳剂是热可逆的且其中90%体积的油滴具有小于200 nm的尺寸。
48.权利要求46或47的免疫原性组合物，其中所述组合物另外包含肺炎链球菌溶血素。
49.权利要求48的免疫原性组合物，其中所述肺炎链球菌溶血素是解毒的。
50.权利要求49的免疫原性组合物，其中所述肺炎链球菌溶血素已被遗传解毒。
51.权利要求41-45中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物另外包含分离的免疫原性肺炎链球菌PhtD多肽。
52.权利要求46-50中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物另外包含分离的免疫原性肺炎链球菌PcpA多肽。
53.权利要求3的组合物，其中所述组合物包含约Iμ g/剂量-约10 μ g/剂量的各PhtD多肽和PcpA多肽。
54.权利要求3的组合物，其中所述组合物包含约10μ g/剂量-约100 yg/剂量的各PhtD多肽和PcpA多肽。
55.权利要求54的组合物，其中所述组合物包含约10μ g/剂量的各PhtD多肽和PcpA多肽。
56.权利要求54的组合物，其中所述组合物包含约25μ g/剂量的各PhtD多肽和PcpA多肽。
57.权利要求54的组合物，其中所述组合物另外包含约10μ g/剂量-约100 μ g/剂量的肺炎链球菌溶血素。
58.权利要求55或56中任一项的组合物，其中所述组合物另外包含肺炎链球菌溶血素。
59.权利要求57或58的组合物，其中所述肺炎链球菌溶血素是在野生型序列的位置65,293和428上包含氨基酸取代的突变体肺炎链球菌溶血素蛋白。
60.权利要求59的组合物，其中三个氨基酸取代包含T65— C、G293 — C和C428 — A0
61.权利要求54的组合物，其中所述组合物包含约50μ g/剂量的各PhtD多肽和PcpA多肽。
62.一种包含免疫原性PcpA多肽和一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物，其中相对于没有一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物，一种或多种药学上可接受的赋形剂增加免疫原性PcpA多肽的热稳定性。
63.一种包含免疫原性PhtX多肽和一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物，其中相对于没有一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物，一种或多种药学上可接受的赋形剂增加免疫原性Phtx多肽的热稳定性。
64.一种包含解毒的肺炎链球菌溶血素多肽和一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物，其中相对于没有一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物，一种或多种药学上可接受的赋形剂增加免疫原性解毒的肺炎链球菌溶血素多肽的热稳定性。
65.权利要求62、63或64的组合物，其中相对于没有一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物，一种或多种药学上可接受的赋形剂使多肽的热稳定性增加O. 5°C以上。
66.权利要求62、63或64的组合物，其另外包含佐剂。
67.权利要求66的组合物，其中所述佐剂包含铝化合物。
68.权利要求62、63或64的组合物，其中所述组合物为液体形式。
69.权利要求62、63或64的组合物，其中所述组合物是干粉形式、冷冻干燥的、喷雾干燥的或泡沫干燥的。
70.权利要求62、63或64的组合物，其中所述一种或多种药学上可接受的赋形剂选自缓冲剂、张度剂、简单碳水化合物、糖、碳水化合物聚合物、氨基酸、寡肽、多氨基酸、多元醇及其醚、洗涤剂、脂质、表面活性剂、抗氧化剂、盐或者它们的组合。
71.权利要求70的组合物，其中所述缓冲剂选自Tris-HCL、具有NaCl的Tris-HCL和HEPES，并且浓度为5-100mM。
72.权利要求70的组合物，其中所述糖选自浓度为1-30%的山梨糖醇、海藻糖和蔗糖。
73.权利要求70的组合物,其中所述一种或多种赋形剂包含在表11中列出的一种或多种赋形剂。
74.权利要求62、63或64的组合物，其中所述组合物包含山梨糖醇。
75.权利要求62、63或64的组合物，其中所述组合物包含5-100μ g/剂量的多肽和2-20% 山梨糖醇 pH 5. 5-8. 5。
76.一种制备包含免疫原性PcpA多肽和一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物的方法，其中相对于没有一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物，一种或多种药学上可接受的赋形剂增加PcpA多肽的热稳定性，所述方法包括提供免疫原性PcpA多肽并使所述多肽与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合。
77.—种诱导受试者中的针对肺炎链球菌的免疫反应的方法,所述方法包括给予受试者权利要求62-75中任一项的组合物。
78.权利要求62的组合物，其中所述组合物另外包含免疫原性PhtX多肽。
79.权利要求78的组合物，其中所述组合物包含免疫原性PhtD多肽。
80.权利要求62、63、78或79中任一项的组合物，其中所述组合物另外包含解毒的肺炎链球菌溶血素。
全文摘要
本发明涉及包含分离的免疫原性肺炎链球菌PcpA多肽和至少一种另外的抗原(例如，选自多组氨酸三联体家族蛋白的分离的免疫原性肺炎链球菌多肽(例如PhtD))的免疫原性组合物和使用这些组合物用于预防和治疗由肺炎链球菌引起的疾病的方法。
文档编号A61P31/04GK102802664SQ201080064532
公开日2012年11月28日 申请日期2010年12月20日 优先权日2009年12月22日
发明者S.加利钱, K.哈珀, B.朱蒂奇, M.奥赫斯-奥诺兰汉姆亨, G.莫尔菲尔德, F.奥萨, M-D.萨尔哈 申请人:赛诺菲巴斯德有限公司