专利名称：：新型ft－0554物质及其生产方法
技术领域：
：本发明涉及适用于治疗寄生虫(尤其蠕虫)侵染的新型FT-0554物质及其生产方法。卫生条件的改善和抗蠕虫药的发展使寄生虫病日益减少。但是近来，输入寄生虫病(importparasitosis)、动物传染病性寄生虫病、机会性寄生虫病(opportunisticparasitosis)和源自易腐食品的寄生虫病正在流行并且成为严重问题。此外，寄生虫病对牲畜饲养和农业产生大的经济负担。就寄生虫中的蠕虫侵染来说，目前，应用除虫菌素、甲苯达唑、吡喹酮和其它药物处理蠕虫。目前应用的抗蠕虫药(例如除虫菌素、甲苯达唑和吡喹酮)在有效性和毒性方面不总是足以令人满意，所以迫切需要能解决这些问题的抗蠕虫药。因此，本发明提供了新型FT-0554物质(它能满足上述需要)及其生产。我们研究了NADH-反丁烯二酸还原酶(它是在蠕虫的电子传递体系中的有希望的对抗抗蠕虫药的目标物质之一)，并且探索了微生物培养中的筛选。我们发现了，新型FT-0554物质具有NADH-反丁烯二酸还原酶抑制活性，于是根据该认识完成了本发明。本发明一个目的是提供由式[Ⅰ]化合物所示的FT-0554物质本发明另一目的是提供一种生产式[Ⅰ]的FT-0554物质的方法该方法包括培养属于真菌并且具有FT-0554物质生产活性的微生物，在培养基中积累FT-0554物质，以及从培养基分离FT-0554物质。本发明又一个目的是提供一种上述方法中用到的微生物，它属于真菌并且具有FT-0554物质生产活性，即黑曲霉(Aspergillusniger)FT-0554。本发明还有一个目的是提供一种微生物，它属于真菌并且具有FT-0554物质生产活性，即黑曲霉FT-0554。生产FT-0554物质的微生物是一种具有FT-0554物质生产活性的真菌且不受限制。用于生产FT-0554的微生物优选的实例是本发明人从最近收集的多孔动物(sponge)分离的真菌菌株FT-0554。所述微生物的分类学特性被阐述如下。菌株FT-0554的分类学特性。(1)在各种培养基上的培养特性肉眼观察该微生物菌株在25℃下培养7天后的结果如表1中所示。表1(2)形态特性本发明的微生物在下列培养基上表现为良好的生长含海水50％(盐含量3．4％)的蔡氏-酵母提取物琼脂培养基，麦芽提取物琼脂培养基，含蔗糖20％的蔡氏-酵母提取物琼脂培养基，以及马铃薯-葡萄糖琼脂培养基，有大量分生孢子。对生长在蔡氏-酵母提取物琼脂培养基上的茵落显微观察显示有间隔的透明茵丝，基内菌丝体上笔直生长了长度为500μm～2．5mm的分生孢子梗，以及基质中的足细胞。分生孢子梗的顶部是肥大的球形至近球形结构，形成直径为35～60μm的泡囊。很多曲霉(aspergillae)由尺寸分别为8．4～11．4×2．4～3．4μm和5．4～8．6×2．8～3．3μm的梗基和瓶梗构成。所有的泡囊都被梗基覆盖，形成从球形到圆柱形分节的分生孢子头。分生孢子是具有光滑至粗糙表面、直径尺寸为3～4．5μm的球形物。(3)生理特性1)最佳生长条件该菌株的最佳生长条件是pH5～7、温度16～36℃和海水浓度1)50～100％。1)应用了盐浓度为3．4％的天然海水2)生长条件该菌株的生长范围是pH3～10、温度12～45℃和海水浓度2)0～100％。2)应用了盐浓度为3．4％的天然海水3)性质需氧的如上所示，将该微生物菌株FT-0554的培养条件、分类学特性和生理特性与已知的微生物菌株作了比较。经鉴定，该菌株属于黑曲霉并称之为黑曲霉FT-0554。该微生物菌株已作为“黑曲霉FT-0554FERMP-16399”于1997年9月1日被保藏在国立生命科学和人体技术研究所，工业科学和技术署，国际科学和技术部，1～3，Higashi1-chome，Tsukuba-shi，lbaraki-ken，日本。此外，于1998年7月31日将该微生物菌株按布达佩斯条约转到国立生命科学和人体技术研究所中的微生物保藏机构，工业科学和技术署，国际科学和技术部，1～3，Higashi1-chome，Tsukuba-shi，lbaraki-ken，日本，并被所述国际保藏机构给予保藏号“FERMBP-6443”。本发明的FT-0554物质的生产可这样进行培养属于具有FT-0554物质生产活性的真菌的微生物，从培养的物质中分离并且纯化该产品。在本发明中应用的微生物菌株可以是上述微生物菌株，它的变种和突变株，以及属于真菌、具有FT-0554物质生产活性的所有菌株。用于生产上述FT-0554物质的营养源可以是真菌的营养源。氮源的实例有商业上可获得的蛋白胨、肉汁、玉米浆、棉籽粉、花生粉、大豆粉、酵母提取物、NZ胺、酪蛋白水解物、硝酸钠、硝酸铵和硫酸铵。碳源的实例有碳水化合物，例如甘油、淀粉、葡萄糖、半乳糖和甘露糖，或者例如脂肪和油这样的碳源，以及无机盐，例如氯化钠、磷酸盐、碳酸钙和硫酸镁。可应用这些物质或其组合。如果需要的话，可添加痕量金属盐和动物油、植物油或矿物油作为防沫剂。可使用那些能被所述生产菌株同化并且适用于生产FT-0554物质的物质。可应用培养真菌的所有已知培养基。大量生产FT-0554物质可以优选通过液体培养基进行。可应用的培养温度处于微生物生产菌株的生长和FT-0554物质的生产的范围内。可通过根据FT-0554物质生产菌株的性质选择合适的条件而进行培养。FT-0554物质可通过水不溶混的有机溶剂(例如氯仿和乙酸乙酯)从培养液提取。除了上述提取方法之外，还可应用用于亲脂性物质的已知分离方法来获得纯化的物质，例如吸附色谱法、凝胶过滤色谱法、从薄层层析划痕、离心式逆流层析、HPLC等，应用或不应用其组合或重复操作。本发明的FT-0554物质的物理化学特性如下所示。(1)性质白色粉末或无定形(2)分子量361．2374(M+H，高分辨快原子轰击质谱)(3)分子式C22H32O4(4)比旋光(c=0．1，1-丙醇)(5)UV吸收极大值(在1-丙醇中)如图1中所示，极大吸收在205nm(肩峰，ε=10800)和231nm(ε=21000)处。(6)IR吸收极大值(KBr压片)如图2中所示，极大吸收在3430，2960，2920，2850，1740，1660，1460，1400，1380，1180，1120和1000cm-1处。(7)1H-NMR在含氘氯仿中的化学位移(ppm)和自旋-自旋耦合常数(Hz)见表2(8)13C-NMR在含氘氯仿中的化学位移(ppm)见表2(9)在溶剂中的溶解性能溶于氯仿、乙醇、1-丙醇、甲苯和乙酸乙酯，不溶于水和正己烷(10)颜色反应对硫酸和碘呈阳性。表2<tablesid="table1"num="001"><table>13C1H170．6s145．2d5．79dd(1H，J=6．9，15．2)138．9d5．46dd(1H，J=7．6，15．2)137．9d6．37dd(1H，J=10．2，15．2)133．7s127．0d5．76d(1H，J=10．9Hz)126．0d6．02dd(1H，J=10．2，15．2)124．6d6．17dd(1H，J=10．9，15．2)122．0d5．48dd(1H，J=7．9，15．2)80．2d4．92d(1H，J=7．9)68．0d4．57s(1H)58．5d3．52s(1H)58．2s47．2t1．96dd(1H，J=7．7，13．7)2．09dd(1H，J=7．1，13．7)38．6d2．06m(1H)34．8d2．42m(1H)29．8t1．31dq(2H，J=7．1，7．3)20．2q0．98d(3H，J=6．8)19．4q0．97d(3H，J=6．8)17．8q1．45s(3H)16．5q1．69s(3H)11．8q0．85t(3H，J=7．3)</table></tables>在表2中，S单峰，d双峰，t三重峰，q四重峰，m多重峰，H质子数，以及J自旋-自旋耦合常数(Hz)。由于详细检定了FT-0554物质的物理化学特性和光谱数据，所以确定FT-0554物质具有如下化学结构。如上所示，详细解释了FT-0554物质的物理化学特性，但是，尚未报导具有相同特性的化合物。因此，FT-0554物质被定义为新物质。本发明FT-0554的NADH-反丁烯二酸还原酶抑制活性被解释如下。将Ascarissuum的肌肉在120mM磷酸钠溶液(pH7．0)中均化并在3，000×g下离心10分钟，收集上清液。将上清液在10，000×g下进一步离心20分钟，收集沉淀。将该沉淀悬浮于120mM磷酸钠溶液(pH7．0)而得线粒体级分。在将10μl溶于50％二甲亚砜溶液的试验样品加入96孔小平板后，往其中添加含0．35mMNADH、7．2mM反丁烯二酸二钠和18mg／ml牛血清白蛋白的120mM磷酸钠溶液(pH7．0)，在37℃下的小平板读出器ELx808(Bio-TekIndustriesCo．)中预保温5分钟。将Ascarissuum的线粒体级分10μl(蛋白质含量0．3mg)加到其中，在37℃下保温10分钟。每15秒测定NADH在340nm处的吸收。定量测定NADH-反丁烯二酸还原酶活性的结果(用340nm处的吸光度斜率的降低表示)，结果测得FT-0554物质实现50％抑制NADH-反丁烯二酸还原酶活性时是2．8μM。所以，FT-0554物质有望用作治疗或预防蠕虫病的药物。本发明的FT-0554物质的抗微生物活性如下。将本发明化合物的氯仿溶液(1mg／ml)10μl蘸在滤纸圆片(AdvantecCo．，直径6mm)上，使它风干而脱除溶剂。该风干脱除溶剂。将干燥的圆片放在含试验生物体的琼脂板上，在37℃或27℃下保温24小时，测量滤纸圆片周围抑制区的直径。结果如表3中所示。表3<tablesid="table2"num="002"><table>试验生物体抑制区直径(mm)大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)KB213(NIHJ)-大肠埃希氏菌KB176(NIHJJC-2，IF012734)-铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)P-3KBi05+水稻黄单胞菌(Xanthomonasoryzae)KB888-藤黄微球菌(Micrococcusluteus)KB40(PCI1001)-金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)KB210-耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)KB42(ATCC607)-枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)KB27(PCI219)-脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)KB169(ATCC23745)-莱氏无胆甾原体(Acholeplasmalaidrawii)KB174-白假丝酵母(Candidaalbicans)KF112酿酒酵母(Saccharomycescervisiae)KF26-黑曲霉KF103(ATCC6275)-PyriculariaoryzaeKF180±总状毛霉(Mucorracemosus)KF223(IFO4581)10</table></tables>如表3中所示，本发明的FT-0554物质对某些微生物具有弱的生长抑制活性。图1示出本发明的FT-0554物质在1-丙醇溶液(50μM)中的UV谱。图2示出本发明的FT-0554物质(KBr压片)的IR谱。如下实施例阐述了本发明，但不能认为是限制本发明。实施例将一菌杯在琼脂斜面培养基中培养的黑曲霉FT-0554(FERMBP-6443)接种入含下列物质的液体培养基(pH7．0)葡萄糖2．0％，聚胨(NihonSeiyakuCo．)0．5％，琼脂0．1％，酵母提取物(OrientalYeastCo．)0．2％，硫酸镁七水合物0．05％和磷酸二氢钾0．1％(溶于50％天然海水(应用了盐浓度为3．4％的天然海水)中)，分成100ml盛于500ml锥形瓶中，在27℃下摇合培养2天。将每1ml该种子培养液接种入含马铃薯葡萄糖肉汁(DifcoInc．)2．4％(溶于50％天然海水(应用了盐浓度为3．4％的天然海水)中)的液体培养基，分成各100ml盛于500ml锥形瓶(×30瓶)中，在27℃下摇合培养96小时。将培养后的液体培养基离心，用乙醇3升提取得到的菌丝体。真空除去乙醇。再次用正己烷提取菌丝体，真空浓缩而得1．9g粗物质Ⅰ。将该物质加到填充了正己烷的硅胶(95g，MerckArt．7734)柱上，用正己烷-乙酸乙酯(10∶1)的混合物洗涤，再用正己烷-乙酸乙酯(10∶2)洗脱。真空浓缩洗脱液而得22．7mg粗物质Ⅱ。将粗物质Ⅱ装填在硅胶薄层板(MerckArt，5744)上，用正己烷-乙酸乙酯(1∶1)展开。将活性级分刮下，用氯仿-甲醇(2∶1)洗脱。真空浓缩洗脱液而得13．4mg粗物质Ⅲ。再将物质Ⅲ加到SephadexLH-20柱上，用氯仿-甲醇(1∶2)洗脱。真空浓缩洗脱液而得10．0mgFT-0554物质(白色粉末)。如上文阐释的那样，本发明的FT-0554物质有望成为治疗寄生虫病的良好且有用的药剂。权利要求1．式[Ⅰ]的FT-0554物质2．一种生产式[I]的FT-0554物质的方法，该方法包括在培养基中培养属于真菌并且具有FT-0554物质生产活性的微生物，在所述培养基中积累FT-0554物质，以及从所述培养物质分离FT-0554物质。3．权利要求2的方法，其中，所述属于真菌并且具有FT-0554物质生产活性的微生物是黑曲霉FT-0554。4．一种属于真菌并且具有FT-0554物质生产活性的微生物。5．权利要求4的微生物，其中，所述微生物是黑曲霉FT-0554。6．黑曲霉FT-0554FERMBP-6443。7．权利要求2的方法，其中，所述属于真菌并且具有FT-0554物质生产活性的微生物是黑曲霉FT-0554FERMBP-6443。8．权利要求4的微生物，其中，所述微生物是黑曲霉FT-0554PERMBP-6443。9．包含FT-0554物质的NADH-反丁烯二酸还原酶抑制剂。全文摘要适用作体外寄生虫病(尤其是蠕虫病)的药物的新物质FT－0554;以及生产该物质的方法,该方法包括:在培养基中培养一种微生物,该微生物属于霉菌并能生产式(Ⅰ)表示的FT－0554,于是在培养物中积累FT－0554,以及从该培养物收获FT－0554。文档编号C07D493/04GK1278824SQ98811039公开日2001年1月3日申请日期1998年9月17日优先权日1997年11月11日发明者大村智,盐见和朗,增间碌郎,岩井让申请人:社团法人北里研究所