专利名称：改良型腈水合酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有耐热性提高或底物特异性改变的改良型腈水合酶活性的蛋白质； 编码该蛋白质的基因DNA ;具有该基因DNA的重组载体；具有该重组载体的转化体或转导体；提取自该转化体或转导体培养物的腈水合酶及其制备方法；以及使用了该培养物或该处理物的酰胺化合物的制备方法。
背景技术：
近年来，人们发现了具有腈水合活性的酶——腈水合酶，该酶可通过水合作用将腈基转换为酰胺基，并且公开了利用该酶或具有该酶的微生物菌体以腈化合物制备对应的酰胺化合物的方法。与以往的化学合成方法相比，这种制备方法因具有高度的由腈化合物转化成对应的酰胺化合物的转化率和选择率而为人所知。生产腈水合酶的微生物，可列举例如属于棒杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红球菌属(Rhodococcus)、根瘤菌属(Rhizobium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、假诺卡氏属(Pseudonocardia)等的微生物。其中玫瑰色红球菌 (Rhodococcus rhodochrous) J-I株已用于丙烯酰胺的工业生产,其有效性已被证实。另外， 编码生产该菌株的腈水合酶的基因也已查明(请参考专利文献I)。从降低反应时酶的用量和降低成本的观点出发，期待能获取耐热性进一步提高的酶。另一方面，不仅是利用从自然界存在的微生物离析得到的腈水合酶或其基因，出于改变腈水合酶的活性、底物特异性、Vmax, Km、热稳定性、底物稳定性、产物稳定性等目的， 人们尝试对腈水合酶引入突变。(参考专利文献2和3)专利文献I :特许第3162091号公报专利文献2 :国际公开2004/056990号手册(pamphlet)专利文献3 :特开2004-222538号公报
发明内容
腈水合酶是已用于丙烯酰胺工业生产的酶，但获取耐热性等性质较目前所使用的酶进一步提高的酶可降低酶反应时的成本。因此，本发明的目的在于进一步改良腈水合酶，提供耐热性更为提高的具有腈水合酶活性的蛋白质，编码该蛋白质的基因DNA，具有该基因DNA的重组载体，具有该重组载体的转化体或转导体，提取自该转化体或转导体培养物的腈水合酶及其制备方法以及使用了该培养物或处理物的酰胺化合物的制备方法。
另外,玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous) J-I株的腈水合酶虽然已用于以丙烯腈为原料的丙烯酰胺的工业生产，但对于芳香腈反应活性低，在期待开发出对于芳香腈反应活性高的酶的同时，从降低催化剂成本的观点出发，也期待开发出热稳定、不易失活的酶。因此，本发明以改良腈水合酶获得耐热性提高的酶以及/或者获得对芳香腈反应活性提高的酶为目的。本发明人为解决上述课题经过深入研究，发现在来源于玫瑰色红球菌 (Rhodococcus rhodochrous) J-I株的腈水合酶的氨基酸序列中，通过将其中至少一个以上的氨基酸残基用选自天然氨基酸组的残基取代，该酶耐热性得以提高以及/或者对芳香腈的反应活性得以提高，从而完成了本发明。即，本发明如下所述(I)以下(a)的蛋白质(a)由下述氨基酸序列组成并且具有耐热性腈水合酶活性的蛋白质，所述氨基酸序列指野生型腈水合酶的α亚基的氨基酸序列上，第42位天冬酰胺残基、第80位丙氨酸残基、第118位丙氨酸残基及第132位天冬氨酸残基中至少有一个氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列，所述野生型腈水合酶的α亚基的氨基酸序列如SED ID Ν0:4所示；(2)以下(a)、(b)的蛋白质(a)由下述氨基酸序列组成并且具有耐热性腈水合酶活性的蛋白质，所述氨基酸序列指野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列上第167位天冬酰胺残基被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列上，第144位亮氨酸残基或第219位缬氨酸残基被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列，所述野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列如SED ID Ν0:2所示；(b)由下述氨基酸序列组成并且具有耐热性腈水合酶活性的蛋白质，所述氨基酸序列指野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列上第167位天冬酰胺残基被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列以及野生型腈水合酶的α亚基的氨基酸序列上第129位缬氨酸残基或第196位亮氨酸残基被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列，所述野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列如SED ID NO :2所示，所述野生型腈水合酶的α亚基的氨基酸序列如SED ID NO 4 所示；(3) 一种基因DNA，该基因DNA编码如权利要求1_2中任一项所述的蛋白质。(4)以下(a)的基因 DNA (a)由下述碱基序列组成并且编码具有耐热性腈水合酶活性的蛋白质的基因 DNA，所述碱基序列指编码野生型腈水合酶的α亚基的基因的碱基序列上，第124 126 位、第238 240位、第352 354位及第394 396位的碱基中至少有一个被其他不同的碱基取代的碱基序列，所述编码野生型腈水合酶的α亚基的基因的碱基序列如SED ID NO 3所示；(5)以下(a)、(b)的基因 DNA (a)由下述碱基序列组成并且编码具有耐热性腈水合酶活性的蛋白质的基因 DNA，所述碱基序列指编码野生型腈水合酶的β亚基的基因的碱基序列上第499 501位碱基中至少有一个被其他不同的碱基取代的碱基序列上，第430 432位及第655 657 位的碱基中至少有一个碱基被其他不同的碱基取代的碱基序列，所述编码野生型腈水合酶的β亚基的基因的喊基序列如SED ID NO I所不；
(b)由下述碱基序列组成并且编码具有耐热性腈水合酶活性的蛋白质的基因 DNA，所述碱基序列指编码野生型腈水合酶的β亚基的基因的碱基序列上第499 501位碱基以及编码野生型腈水合酶的α亚基的基因的碱基序列上第385 387位以及第586 588位的碱基中至少有一个碱基被其他不同的碱基取代的碱基序列，所述编码野生型腈水合酶的β亚基的基因的碱基序列如SED ID NO: I所示，所述编码野生型腈水合酶的α亚基的基因的喊基序列如SED ID NO 3所不；(6) 一种重组载体,该重组载体含有如权利要求3-5中任一项所述的基因DNA。(7) 一种转化体或转导体，该转化体或转导体含有如权利要求6所述的重组载体。(8) 一种制备腈水合酶的方法，该方法培养如权利要求7所述的转化体或转导体， 从所得培养物提取腈水合酶。(9) 一种制备酰胺化合物的方法，该方法培养如权利要求7所述的转化体，使所得的培养物或处理物与腈基化合物接触，提取通过该接触生成的酰胺化合物。本发明提供与野生型腈水合酶相比耐热性提高以及/或者对于芳香腈反应活性提高的突变型腈水合酶以及编码该酶的基因。本发明进一步提供具有上述突变型腈水合酶基因的重组DNA，具有该重组DNA的转化(转导)体，使用该转化(转导)体制备酰胺化合物的方法。通过本发明，可以高效制备丙烯酰胺。
图I为质粒pJH601的组成图。图2为质粒p3R的组成图。图3为质粒pMH301的组成图。图4为质粒p52的组成图。图5A为质粒pCF002的组成图。图5B为质粒pFY529的组成图。
具体实施例方式以下详细说明本发明。本说明书中所引用的文献、公开公报、国际公开公报等其他专利公报作为参照并入本说明书。<腈水合酶>本发明通过使野生型腈水合酶的氨基酸序列部分突变，提供与野生型腈水合酶相比耐热性和/或底物特异性提高的改良型腈水合酶。“腈水合酶”是催化腈化合物转化为对应酰胺化合物的水合反应 (RCN+H20 - RCONH2)的酶。另外，“腈水合酶”的结构是由α亚基与β亚基聚合形成的高级结构。“野生型腈水合酶”指具有来源于作为酶源的微生物的野生株(亲株)的氨基酸序列的腈水合酶以及来源于野生株(亲株)的基因序列编码所得的腈水合酶。“野生型β亚基”或“野生型α亚基”指具有来源于野生株(亲株)的氨基酸序列的β亚基或α亚基以及来源于野生株(亲株)的基因序列编码所得的β亚基或α亚基。“野生型腈水合酶”可列举来源于各种微生物野生型的腈水合酶。微生物不仅限于具有编码腈水合酶的基因的微生物。优选具有来源于红球菌属微生物的氨基酸序列的腈水合酶以及来源于红球菌属微生物的基因序列编码所得的腈水合酶，所述红球菌属微生物例如可列举玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous) J-I (FERM BP-1478)、玫瑰色红球菌 (Rhodococcus rhodochrous) M8 (SU1731814)、玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous) M3 3 (VKM Ac_1515D)或玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous) ATCC39484 (特开平 2001-292772)等。或者是来源于史密氏杆菌(Bacillus smithii)(特开平09-248188)的腈水合酶亦可。特别优选的是具有来源于玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous) J-I 或玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)M8的氨基酸序列的腈水合酶以及来源于这两株的基因序列编码所得的腈水合酶。另外，玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous) M33 (VKM Ac-1515D)菌是由M8 (SU1731814)菌通过自然突变产生的作为腈水合酶表达株而被筛选出的菌株。该菌株的腈水合酶本身的氨基酸序列和基因序列没有突变(美国专利第 5827699 号)。在此，耐热性提高指来源于突变株的加热处理后的酶的残留活性比来源于亲株的经相同处理的酶的残留活性高10%以上。“残留活性”指用经加热处理后的菌体进行活性测定时酰胺化合物的生成量与用等量未经处理的菌体进行活性测定时酰胺化合物的生成量的比值。作为加热处理方法可将培养液和收集、洗净的培养菌体置于容器中，将此容器置于水浴或培养箱等加热装置中保温一定时间即可。此时，为提高酶稳定性也可添加腈化合物或酰胺化合物后进行加热处理。加热处理的条件应适当研究处理温度与处理时间，优选设定使亲株活性降低至50%以下的条件。具体而言指在50°C至70°C的范围内进行5分钟至30分钟的处理。未处理菌体使用4°C下冷藏的培养液和收集、洗净的培养菌体。活性测定使用加热处理或未处理的菌体，使底物腈化合物与该菌体接触，转化为对应的酰胺化合物后定量该酰胺化合物。底物可使用可与腈水合酶发生反应的任何腈化合物，优选丙烯腈。 反应条件例如在底物浓度为2. 5%、反应温度为10°C至30°C、反应时间为10分钟至30分钟的范围内进行。添加磷酸使酶反应终止，利用HPLC和气相色谱分析生成的丙烯酰胺。本发明的改良型腈水合酶，例如，可通过改变来源于玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous) J-I株的腈水合酶的氨基酸序列，筛选与亲株腈水合酶活性相比耐热性提高的改良型腈水合酶而得到。上述改变方法可以采用使羟胺或亚硝酸等作为变异源的药物与Jl菌接触或作用的方法、紫外线照射突变诱导法、在编码来源于Jl菌的腈水合酶的基因 (以下称为腈水合酶基因)中用PCR引入随机突变的方法等。本发明中，发现了野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列(例如序列编号2)中第167位天冬酰胺被丝氨酸取代的改良型腈水合酶。本发明不仅筛选出上述这种改良型腈水合酶，还筛选出耐热性进一步提高的改良型腈水合酶。该筛选方法是通过筛选符合上述 “耐热性”定义的突变体(突变基因)进行的。由此得到的酶，是具有下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列指腈水合酶的 β亚基的氨基酸序列(例如序列编号2)上，第24位苯丙氨酸残基、第88位异亮氨酸残基、 第92位谷氨酸残基、第93位谷氨酸残基、第96位组氨酸残基、第103位谷氨酸残基、第167 位天冬酰胺残基及第225位酪氨酸残基中至少有一个氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列。还包括具有下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列指腈水合酶的α亚基的氨基酸序列(例如序列编号4)上，第42位天冬酰胺残基、第80位丙氨酸残基、第118位丙氨酸残基及第132位天冬氨酸残基中至少有一个氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列。本发明进一步包括具有下述氨基酸序列并且具有腈水合酶活性的蛋白质，所述氨基酸序列指野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列(序列编号2)上第167位天冬酰胺残基被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列中，β亚基的氨基酸序列的第144位亮氨酸残基、 第219位缬氨酸残基以及α亚基的氨基酸序列(序列编号4)上第129位缬氨酸残基及第 196位亮氨酸残基中至少有一个氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列。上述的复合突变体可通过任意方法制备，例如，可通过一条合成的核苷酸链进行特定位置的取代的方法或将多个含有不同单突变的DNA片断利用限制性内切酶切割再重新连接的方法制备。只要不破坏耐热性，允许在上述突变基础上出现I个或多个(例如I个或者数个) 氨基酸的取代、缺失以及/或者增加。例如，野生型腈水合酶β亚基的氨基酸序列(例如序列编号2)中或野生型腈水合酶α亚基的氨基酸序列(例如序列编号4)中的I 2个氨基酸残基被其他氨基酸残基取代是允许的，或者，编码野生型腈水合酶β亚基的基因(例如序列编号3)或编码野生型腈水合酶α亚基的基因(例如序列编号3)所示的碱基序列编码所得的氨基酸序列中I 2个氨基酸残基被其他氨基酸残基取代也是允许的。以下，说明优选的氨基酸突变形态。本发明中，为叙述方便，可以使用氨基酸的单字母字符号及α或β亚基的氨基酸序列的氨基酸编号说明突变的形态。例如，F0 24L这一标记表示β亚基(例如序列编号2)的氨基酸序列中的第24位氨基酸由苯丙氨酸被取代为亮氨酸。又如，N0 167S这一标记表示β亚基(例如序列编号2)的氨基酸序列中的第167位氨基酸由天冬酰胺被取代为色氨酸。〈突变与取代的形态(I)>此形态为使腈水合酶的α或β亚基的至少一个的氨基酸残基突变。单突变1.F3 24L2. I β 88F3. Εβ 92Κ4. Εβ 93G5. Ηβ 96R6. Εβ 103D7. Νβ 167S8. Υβ 225Η9. Na 42D10. A a 80Τll.Aa 118V12. Da 132Ν复合突变I. Εβ 93G, Εβ 103Dz 264位的碱基序列‘ TTC)。
,276位的碱基序列‘ AAA)。
,279位的碱基序列‘
ATC”被取
GAA ”被取
GAG”被取2· Εβ 93G，Da 132N3. Ηβ 96R, Na 42D4. Εβ 92Κ, A a 80T产生上述的氨基酸取代时的碱基取代如下所述。应予说明，编码β亚基、a亚基的基因DNA，分别以序列编号I、序列编号3所示的序列为例予以说明。单突变I :序列编号I中，第70 72位的碱基序列“TTC”被取代为CTT、CTC、CTA 或CTG。特别优选第70位的T被取代为C (TTC — CTC)。单突变2 :序列编号I所示的碱基序列中，第262 代为TTT或TTC。特别优选第262位的A被取代为T (ATC ■单突变3 :序列编号I所示的碱基序列中，第274 代为AAA或AAG。特别优选第274位的G被取代为A (GAA ■单突变4 :序列编号I所示的碱基序列中，第277 代为GGG、GGC、GGA或GGT。特别优选第278位的A被取代为G (GAG — GGG)。单突变5 :序列编号I所示的碱基序列中，第286 288位的碱基序列“CAC”被取代为CGC、CGG、CGA或CGT。特别优选第287位的A被取代为G (CAC — CGC)。单突变6 :序列编号I所示的碱基序列中，第307 309位的碱基序列“GAG”被取代为GAC或GAT。特别优选第309位的G被取代为T (GAG —单突变7 :序列编号I所示的碱基序列中，第499
代为AGC或AGT。特别优选第500位的被A取代为G (AAC —单突变8 :序列编号I所示的碱基序列中，第673
代为CAC或CAT。特别优选第673位的T被取代为C (TAC —单突变9 :序列编号3所示的碱基序列中，第124
代为GAC或GAT。特别优选第124位的A被取代为G (AAC —单突变10 :序列编号3所示的碱基序列中，第238 取代为ACC、ACG、ACA或ACT。特别优选第238位的G被取代为A (GCC — ACC)。单突变11 :序列编号3所示的碱基序列中，第352 354位的碱基序列“GCC”被取代为GTC、GTG、GTA或GTT。特别优选第353位的C被取代为T (GCC — GTC)。单突变12 :序列编号3所示的碱基序列中，第394 396位的碱基序列“GAC”被取代为AAC或AAT。特别优选第394位的G被取代为A (GAC — AAC)。复合变异I 4的碱基序列的取代与单变异的取代相同。<突变与取代形态(2) >此形态为使腈水合酶的β亚基的氨基酸序列至少2处发生突变或者β亚基的氨基酸序列至少I处并且a亚基的氨基酸序列至少I处发生突变。I. Νβ 167S, 144Η2. Νβ 167S, νβ 219Α3. Νβ 167S, Va 129Α4· Νβ 167S，144Η，νβ 219Α5· N β 167S, L β 144Η, V β 219Α, V a 129Α, L a 196Ρ产生上述的氨基酸取代时的碱基取代如下所述
GAT)。
,501位的碱基序列 AGC)。
'675位的碱基序列 CAC)。
,126位的碱基序列 GAC)。
240位的碱基序列
AAC ”被取
TAC ”被取
AAC ”被取
iGCd
N β 167S :序列编号I所示的碱基序列中，第499 501位的碱基序列“AAC”被取代为AGC或AGT。特别优选第500位的A被取代为G (AAC — AGC)。L β 144Η :序列编号I所示的碱基序列中，第430 432位的碱基序列“CTC”被取代为CAC或CAT。特别优选第431位的T被取代为A (CTC — CAC)。νβ 219A :序列编号I所示的碱基序列中，第655 657位的碱基序列“GTC”被取代为GCT、GCC、GCA或GCG。特别优选第656位的T被取代为C (GTC — GCC)。V α 129Α :序列编号3所示的碱基序列中，第385 387位的碱基序列“GTG”被取代为GCT、GCC、GCA或GCG。特别优选第386位的T被取代为C (GTG — GCG)。L α 196Ρ :序列编号3所示的碱基序列中，第586 588位的碱基序列“CTC”被取代为CCT、CCC、CCA或CCG。特别优选第587位的T被取代为C (CTC — CCC)。〈突变与取代的形态(3)>此变异形态是腈水合酶的β亚基的氨基酸序列中至少第26位或第48位氨基酸残基被其他氨基酸取代。S卩，本发明提供对于芳香腈反应活性提高以及/或者耐热性提高的腈水合酶。“腈水合酶”是催化腈化合物转化为对应酰胺化合物的水合反应(RCN+2H20 — RCONH2)的酶。在此，“对于芳香腈反应活性提高的腈水合酶”是指对3-氰基吡啶的比活性提高
I.5倍以上的酶。筛选方法为筛选符合上述“突变”定义的突变体(突变基因)。通过上述方法得到的对于芳香腈反应活性提高的酶是具有下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列为序列编号2 ( β亚基)的氨基酸序列上，第48位色氨酸残基被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列。耐热性提高的酶是具有下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列为序列编号 2 ( β亚基)的氨基酸序列上，第26位组氨酸残基被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列。序列编号2所示的氨基酸序列(野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列)的第 48位色氨酸被精氨酸取代时，不仅具有使腈水合酶耐热性提高的效果，在对丙烯腈(短链脂肪族腈)具有底物特异性的基础上，还使腈水合酶对3-氰基吡啶(芳香腈)的反应活性提闻。以下说明优选的氨基酸突变形态。例如，Wi3 48R这一标记表示β亚基(序列编号I)的第48位氨基酸残基由色氨酸被取代为组氨酸。(I)对于芳香腈反应活性提高的突变W β 48R(2)耐热性提高的突变Ηβ 26R(3)复合突变48R, Ηβ 26R产生上述的氨基酸取代时的碱基取代如下所述。ff^48R :序列编号I中，第142 144位的碱基序列“TGG”被取代为CGT、CGC、CGA、 CGG、AGA或AGG。特别优选第142位的T被取代为C (TGG — CGG)。H β 26R :序列编号I中，第76 78位的碱基序列“CAC”被取代为CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG。特别优选第77位的A被取代为G (CAC — CGC)。〈复合突变〉进一步，通过将上述〈突变与取代的形态 > 中(I) (3)中所记载的多个突变组合起来制备复合突变体的方法，可以制得同时具备两种性质的突变酶。复合突变体可通过任意方法制备，例如，可通过一条合成的核苷酸链进行特定位置的取代的方法或将多个分别含有单个突变的DNA片断利用限制性内切酶切割再重新连接的方法获得。只要不破坏突变的性质，允许在上述突变基础上出现氨基酸序列的缺失、被取代、 增加等。例如，在上述已实施突变的氨基酸序列上，允许缺失I个或多个(例如I 10个， 优选I 5个)氨基酸残基，允许增加I个或多个(例如I 10个，优选I 5个)氨基酸残基，或者，允许I个或多个(如I 10个，优选I 5个)氨基酸残基被其他氨基酸残基所取代。〈引入突变的方法〉上述的引入单个突变或复合突变的腈水合酶基因的制备方法，通过Kunkel 法及Gapped duplex法等公知的方法实现，例如使用具有定点突变功能的试剂盒，如 QuickChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene 公司生产)、GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System(Invitrogen 公司生产)、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System(Mutan-K、Mutan-Super Express Km 等宝生物工程公司生产)来实现突变的引入[Nucleic. Acid. Res. 10,6487 (1982) ；Molecular Cloning 2nd Edt, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]。在Jl以外菌株的腈水合酶中，通过上述的突变位点、突变的氨基酸种类、DNA序列也可引起耐热性的提高。这些菌株包括上述的玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous) M8 (SU1731814)、玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous) M33 (VKM Ac_1515D)、玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)ATCC39484(特开平 2001-292772)、史密氏杆菌 (Bacillus smithii)(特开平 09-248188)等。进一步，本发明的基因DNA还包括上述序列编号I或3所示的碱基序列中引入突变所得的碱基序列的互补碱基序列所得的DNA和严谨条件下可杂交的DNA。严格条件指 例如盐(钠)浓度150 900mM，温度55 75°C，优选盐(钠)浓度250 450mM，温度在 68。。。〈酰胺化合物耐受性〉本发明的改良型腈水合酶还具有酰胺化合物耐受性的性质。在此，酰胺化合物耐受性指与其他来源于野生株的腈水合酶相比，可以在酰胺化合物存在下保持腈水合酶活性。本发明的突变型腈水合酶所耐受的酰胺化合物并无特别限制，可列举例如用以下化学式所表示的化合物R-C0NH2(在此，R为取代或未被取代的烷基、取代或未被取代的烯基、取代或未被取代的环烷基、取代或未被取代的芳香基或者取代或未被取代饱和或不饱和杂环基)等。特别的， 优选式中R为CH2 = CH的丙烯酰胺。酰胺化合物耐受性，例如，可通过以下方法来评价，即在丙烯酰胺等酰胺化合物(例如30 50%等高浓度)存在下，分析具有本发明改良型腈水合酶的转化体的培养物或从转化体中分离的腈水合酶对丙烯腈等腈化合物底物的消耗量或消耗速度。与来源于母体株的腈水合酶相比，例如，当消耗量或消耗速度超过I. I倍时，可评价为具有酰胺化合物耐受性。<重组载体及转化(转导)体的制备>以下说明具有上述腈水合酶基因的载体和转化(转导)体的制备方法。为使腈水合酶基因能够在被转化或转导的宿主生物中表达，须将其重组入载体。例如，作为载体可列举质粒DNA、噬菌体DNA、反转座子DNA、人工染色体DNA等。作为宿主，可使用大肠杆菌、枯草杆菌等细菌、酵母、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等。大肠杆菌作为宿主时，优选使用表达效率高的表达载体，例如具有trc启动子的表达载体pKK233-2(安玛西亚生物科技公司生产)或pTrc99A (安玛西亚生物科技公司生
广)等。载体中除腈水合酶基因外还可连接启动子、终止子、增强子、拼接信号、polyA插入信号、筛选标记、核糖体结合序列(SD序列)等。另外，作为筛选标记可列举例如卡那霉素抗性基因、二氢叶酸还原酶基因、氨苄西林抗性基因、新霉素抗性基因等。以下，说明宿主的种类以及重组载体转化宿主的方法。细菌作宿主时，大肠杆菌可列举例如大肠杆菌(Escherichia coli)等，红球菌(Rhodococcus)可列举例如玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)ATCC12674、 玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)ATCC17895、玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous) ATCC19140等。这些ATCC菌株从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)得到。重组载体转化细菌的方法并无特别限制，只要是将DNA导入细菌的方法即可，可使用例如钙离子法、电穿孔法等。酵母作宿主时,可使用例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、毕赤酵母(Pichia pastoris)等。重组载体转化酵母的方法并无特别限制，只要是将DNA导入酵母的方法即可，可使用例如电穿孔法、原生质球转染法、醋酸锂法等。动物细胞作宿主时可使用绿猴C0S-7细胞、Vero, CHO细胞、小鼠L细胞、大鼠GH3 细胞、人FL细胞等。重组载体转化动物细胞的方法可使用例如电穿孔法、磷酸钙法、脂质转染法等。昆虫细胞作宿主时可使用Sf9细胞、Sf21细胞等。重组载体转化昆虫细胞的方法可使用例如磷酸钙法、脂质转染法、电穿孔法等。植物细胞作宿主时可列举烟草BY-2细胞等，但并不仅限于此。重组载体转化植物细胞的方法可使用例如农杆菌介导法、粒子枪法、PEG法、电穿孔法等。〈腈水合酶的制备〉下面说明腈水合酶及其制备方法。本发明的腈水合酶可通过培养以上述方法制备的具有腈水合酶基因的转化(转导)体，从其培养物提取而得到。10/32 页在此，培养物任指培养上清、培养细胞或培养菌体和细胞或菌体的破碎物。培养本发明的转化(转导)体的方法，可使用以下例举的宿主依常法进行。培养以大肠杆菌、酵母菌等微生物为宿主的转化体的培养基含有可以资化微生物的碳源、氮源、无机盐类等，只要其可直效培养转化体，可使用任意天然培养基、合成培养基。作为碳源，可列举葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉等碳水化合物，醋酸、丙酸等有机酸，乙醇、丙醇等醇类。作为氮源，除可用氨水、氯化铵、硫酸铵、醋酸铵、磷酸铵等无机酸或有机酸铵盐或其他含氮化合物外还可列举蛋白胨、肉糜、玉米浆等。作为无机物，可列举磷酸氢亚钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。培养通常在振荡培养或通气搅拌培养等需氧条件下、30-40°C下进行。pH的调整使用无机或有机酸、碱溶液等。培养中根据需要可在培养基中添加氨苄西林或四环素等抗生素。培养基中也可添加腈水合酶的补缺金属即钴离子或铁离子，还可添加腈类或酰胺类作为酶诱导剂。以诱导性启动子作启动子，用表达载体培养转化的微生物时，可根据需要在培养基中添加诱导物。例如，培养用具有可被异丙基_β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的启动子的表达载体转化的微生物时，可在培养基中添加IPTG。又如，培养用具有可被吲哚乙酸 (IAA)诱导的trp启动子的表达载体转化的微生物时，可在培养基中添加IAA。培养以动物细胞作宿主等到的转化体所用的培养基，可列举常用的RPMI1640培养基、DMEM培养基或在这些培养基中添加胎牛血清的培养基等。培养通常在5% CO2下， 37°C培养I 30天。培养中可根据需要在培养基中添加卡那霉素、青霉素等抗生素。从培养基中提取腈水合酶的方法可通过反复超声波处理、冷冻溶解后匀浆处理， 将菌体或细胞破碎从而提取目标蛋白质。转化体为植物细胞或植物组织时，培养可使用常用的植物培养用培养基，例如MS 基础培养基、LS基础培养基进行。培养方法可采用任意常用的固体培养法或液体培养法。从培养物中提取腈水合酶的方法是，首先，通过以纤维素酶、蛋白酶等酶进行的细胞溶解处理、超声破碎处理、磨碎处理等破坏细胞。然后，过滤或离心除去不溶物，得到粗蛋白质溶液。从上述粗溶液纯化本发明的蛋白质，通过单独或适当结合使用盐析、各种色谱 (例如凝胶过滤色谱、离子交换色谱、亲和色谱)、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法进行。另外，在菌体外或细胞外生产本发明的蛋白质时，使用培养液本身或通过离心除去菌体或细胞。然后，通过单独或适当结合使用常用的蛋白质分离纯化生物化学方法，例如硫酸铵沉淀、凝胶色谱、离子交换色谱、亲和色谱等，可从上述培养物中分离纯化本发明的蛋白质。另外，本发明中，也可以利用编码本发明的腈水合酶的基因DNA或上述载体，通过完全不使用生物细胞的无细胞蛋白质合成体系合成并提取目标蛋白质。无细胞蛋白质合成体系是使用细胞提取液在试管等人工容器内合成蛋白质的体系，例如读取mRNA的信息，在核糖体上合成蛋白质的体系。应予说明，本发明所使用无细胞蛋白质合成体系也包含以DNA为模版合成RNA的无细胞转录体系。上述细胞提取液，可使用来源于真核细胞或来源于原核细胞的提取液，例如，小麦胚芽、兔网状红血球、小鼠L-细胞、HeLa细胞、CHO细胞、出芽酵母、大肠杆菌等的萃取液。 应予说明，这些提取液可以经过浓缩或不经浓缩。
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在此,DNA上密码化的遗传信息通过转录转化为mRNA,进而翻译转化为蛋白质。为在人工容器内再现这一过程合成蛋白质，需要核糖体、tRNA、各种蛋白质因子等，还需要构建可稳定翻译酶系并根据目的生产mRNA的系统。细胞提取液，例如可通过超滤、透析、聚乙二醇(PEG)沉淀等得到。本发明的无细胞蛋白质合成也可使用市售试剂盒进行。所述试剂盒可列举例如 PROTEI OS (东洋纺织)，TNT System (Promega普洛麦格)、PG-Mate 合成装置(东洋纺织)、RTS(Roche Diagnostics 罗氏诊断)等。通过无细胞蛋白质合成得到的突变型腈水合酶可以选择适当的色谱纯化。另外， 突变型腈水合酶的纯化可用SDS-PAGE等确认，活性测定可以通过测定腈化合物转化为酰胺化合物的转化率来进行。<酰胺化合物的制备>下面，说明利用转化(转导)体制备酰胺化合物的方法。上述培养法得到的培养物、酶等作为将腈化合物转化为对应酰胺化合物时的生物催化剂所使用。作为转换反应的底物使用的腈化合物，可根据生物催化剂的底物特异性适当选择。例如，来源于玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous) J-I株的腈水合酶适合的底物为丙烯腈。生物催化剂的使用形态、反应方式可根据生物催化剂的种类适当选择。例如，作为生物催化剂的使用形态，既可以使用上述培养物、纯化酶本身，也可以将它们固定于合适的载体上作为固定酶使用。实施例下面通过实施例对本发明进行更加详细地说明，但本发明并不限于以下实施例。 另外应予说明，玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous) J-I株，以FERM BP-1478为编号保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城县筑波市东I丁目I番地-I中央第6)(原保藏日1987年9月18日)。[实施例I]改良型腈水合酶基因的获得(I)(I)染色体DNA的制备玫瑰色红球菌(Rhodococcusrhodochrous) J-I 株接种于 100ml MYK 培养基 (0. 5%多聚蛋白胨、0. 3%酵母提取物、0. 3%麦芽提取物、I %葡萄糖、0. 2% K2HPO4^O. 2% KH2PO4, pH7. 0)中，30°C振荡培养72小时。培养后，收集菌体，将收集的菌体悬浮于4ml Saline-EDTA溶液(0. IM EDTA、0. 15M NaCl (pH8. O))中。混悬液中加入8mg溶菌酶，在37°C下振荡I 2小时后，在_20°C下冷冻。接着，边平稳振荡边加入IOml的Tris-SDS溶液(I % SDS、0. IM NaCUO. IM Tris-HCl (pH9. 0))，之后再加入蛋白酶K (Merck公司)(最终浓度0. lmg)，37°C振荡I小时。接着，加入等量的用TE饱和的苯酚溶液并搅拌(TE 10mM Tris-HClUmM EDTA (pH8. 0))，离心，取上层溶液，加入2倍量的乙醇后，用玻璃棒卷取DNA。以90 %、80 %、 70%的乙醇依次脱除苯酚。接着，将DNA溶解于3ml的TE缓冲液中，加入核糖核酸酶A溶液(已经100°C 15 分钟加热处理)至最终浓度10 μ g/ml，并在37°C下振荡30分钟。然后，加入蛋白酶K，在37°C下振荡30分钟后，加入等量的用TE饱和的苯酚溶液，离心使上层溶液与下层溶液分离。同样的操作对上层溶液重复两次之后，加入等量的氯仿(含4%异戊醇)，重复同样的提取操作(以下该操作称为苯酚处理)。之后取上层溶液加入2倍量的乙醇，用玻璃棒卷取回收DNA，得到染色体DNA样品。(2)质粒的构建首先，为了用作耐热性评价的对照，利用通常的PCR方法对野生型的腈水合酶基因进行扩增。PCR反应以下面记载的反应液组成、反应条件进行。应予说明，引物JH1_02(序列编号5)及引物NH_17(序列编号6)各自的序列上已预先引入了限制性内切酶NcoI和限制性内切酶Hindi 11的识别位点，扩增的DNA产物在两种限制性内切酶的切割下，可轻松地插入后述表达载体pTrc99A的NcoI部位-HindIII部位之间。<反应液组成>
权利要求
1.以下(a)的蛋白质(a)由下述氨基酸序列组成并且具有耐热性腈水合酶活性的蛋白质，所述氨基酸序列指野生型腈水合酶的α亚基的氨基酸序列上，第42位天冬酰胺残基、第80位丙氨酸残基、 第118位丙氨酸残基及第132位天冬氨酸残基中至少有一个氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列，所述野生型腈水合酶的α亚基的氨基酸序列如SED ID Ν0:4所示。
2.以下(a)、(b)的蛋白质(a)由下述氨基酸序列组成并且具有耐热性腈水合酶活性的蛋白质，所述氨基酸序列指野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列上第167位天冬酰胺残基被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列上，第144位亮氨酸残基或第219位缬氨酸残基被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列，所述野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列如SED ID Ν0:2所示；(b)由下述氨基酸序列组成并且具有耐热性腈水合酶活性的蛋白质，所述氨基酸序列指野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列上第167位天冬酰胺残基被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列以及野生型腈水合酶的α亚基的氨基酸序列上第129位缬氨酸残基或第 196位亮氨酸残基被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列，所述野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列如SED ID NO :2所示，所述野生型腈水合酶的α亚基的氨基酸序列如SED ID NO 4所示。
3.一种基因DNA，该基因DNA编码如权利要求1_2中任一项所述的蛋白质。
4.以下(a)的基因DNA(a)由下述碱基序列组成并且编码具有耐热性腈水合酶活性的蛋白质的基因DNA，所述碱基序列指编码野生型腈水合酶的α亚基的基因的碱基序列上，第124 126位、第 238 240位、第352 354位及第394 396位的碱基中至少有一个被其他不同的碱基取代的碱基序列，所述编码野生型腈水合酶的α亚基的基因的碱基序列如SED ID Ν0:3所示。
5.以下(a)、(b)的基因DNA(a)由下述碱基序列组成并且编码具有耐热性腈水合酶活性的蛋白质的基因DNA，所述碱基序列指编码野生型腈水合酶的β亚基的基因的碱基序列上第499 501位碱基中至少有一个被其他不同的碱基取代的碱基序列上，第430 432位及第655 657位的碱基中至少有一个碱基被其他不同的碱基取代的碱基序列，所述编码野生型腈水合酶的β亚基的基因的喊基序列如SED ID NO I所不；(b)由下述碱基序列组成并且编码具有耐热性腈水合酶活性的蛋白质的基因DNA，所述碱基序列指编码野生型腈水合酶的β亚基的基因的碱基序列上第499 501位碱基以及编码野生型腈水合酶的α亚基的基因的碱基序列上第385 387位以及第586 588 位的碱基中至少有一个碱基被其他不同的碱基取代的碱基序列，所述编码野生型腈水合酶的β亚基的基因的碱基序列如SED ID NO :1所示，所述编码野生型腈水合酶的α亚基的基因的喊基序列如SED ID NO 3所不。
6.一种重组载体，该重组载体含有如权利要求3-5中任一项所述的基因DNA。
7.一种转化体或转导体，该转化体或转导体含有如权利要求6所述的重组载体。
8.一种制备腈水合酶的方法，该方法培养如权利要求7所述的转化体或转导体，从所得培养物提取腈水合酶。
9.一种制备酰胺化合物的方法，该方法培养如权利要求7所述的转化体，使所得的培养物或处理物与腈基化合物接触，提取通过该接触生成的酰胺化合物。
全文摘要
本发明提供具有改良型腈水合酶活性的蛋白质，该蛋白质通过改变腈水合酶的氨基酸序列得到，与野生型腈水合酶活性相比耐热性提高；本发明还提供编码该蛋白质的基因DNA，具有该基因DNA的重组载体，具有该重组载体的转化体或转导体，提取自该转化体或转导体培养物的腈水合酶及其制备方法，以及酰胺化合物的制备方法。
文档编号C12N1/15GK102604921SQ201210081580
公开日2012年7月25日 申请日期2005年5月26日 优先权日2004年5月26日
发明者中村哲二, 氏原大, 汤不二夫, 渡边文昭, 酒井美纪 申请人:三菱丽阳株式会社