含F/2A序列的抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体及其构建方法

专利名称：含F/2A序列的抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体及其构建方法
技术领域：
本发明涉及慢病毒表达载体，尤其是一种含F/2A序列的抗pl85ertB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体及其构建方法
背景技术：
c-erbB2/HER2/neu编码产物pl85eAB2是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，属于表皮生长因子受体(EGFR)家族成员。C-erbB2/HER-2/neu基因的扩增和pl85ertB2蛋白的过度表达见于多种恶性肿瘤，包括乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、子宫内膜癌、胃癌、前列腺癌和肺腺癌。pl85eAB2过度表达提示肿瘤预后差，如转移、复发、易耐药及存活期短等。pl85ertB2作为肿瘤抗原，是一个理想的肿瘤治疗靶点。美国食品及药物管理局(FDA)已于1998年10月正式批准将一株抗pl85ertB2人源化抗体Trastuzumab (商品名Herceptin)用于临床治疗pl85erbB2高表达的转移性乳腺癌。但是，国外进口抗体药物价格昂贵，如何开发出拥有自主知识产权的抗pl85OTbB2基因工程抗体对于国内患者具有十分重要的实际意义，其中，表达载体构建尤为关键。目前构建载体表达抗体分子的主要方式有三类一是将轻、重链基因分别连接至不同表达载体；二是轻、重链基因在同一载体上但处于不同的表达单元；三是以内部核糖体进入位点(IRES)连接轻、重链，使轻重链处于同一表达单元。但是，这些方式存在一些缺陷，如被表达的基因起始效率低，启动子之间相互干扰，上游基因与下游基因的表达不平衡等，造成轻、重链表达水平存在显著差异，导致完整抗体分子表达水平较低。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种含F/2A序列的抗pl85ertB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体及其构建方法，为今后抗pl85MbB2嵌合抗体的基础研究及临床应用奠定了基础。含F/2A序列的抗pl85ertB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体，该载体是pWPI/H-F2A-L，其中H和L分别是抗pl85ertB2人鼠嵌合抗体重链基因(SEQ. ID. No. 2)和抗pl85ertB2人鼠嵌合抗体轻链基因(SEQ. ID. No. I), F2A是弗林蛋白酶和口蹄疫病毒2A自剪切多肽(SEQ. ID. No. 15)。抗P 185eAB2人鼠嵌合抗体重链基因由鼠抗人P 185ertB2单抗重链可变区基因vH(SEQ. ID. No. 13)和人 IgGl 的重链恒定区基因 Y I (SEQ. ID. No. 14)连接而成 ^pl85ertB2人鼠嵌合抗体轻链基因由鼠抗人pl85ertB2单抗轻链可变区基因vL(SEQ. ID. No. 16)和人IgGl的轻链恒定区基因K (SEQ. ID. No. 17)连接而成。上述含F/2A序列的抗pl85ertB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体的构建方法用具有自我剪切能力的弗林蛋白酶Furin/ 口蹄疫病毒2A多肽F/2A连接人鼠嵌合抗体的重链和轻链，形成一个开放阅读框0RF，插入慢病毒表达载体pWPI，即得。
上述含F/2A序列的抗pl85ertB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体的构建方法包括以下步骤<1>抗P185ertB2人鼠嵌合抗体重、轻链基因的扩增 用小量质粒抽提试剂盒抽提含有抗pl85OTbB2人鼠嵌合抗体轻、重链基因的质粒pWPI/H-IRES-L，并以此为模板，在DNA Taq酶作用下分别用H-A和gammal-B、L-A和Kappa-B扩增出嵌合重链基因H和嵌合轻链基因L ;扩增条件为94°C预变性5min，94°C变性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸2min，35个循环，最后72°C延伸IOmin ;PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收目的基因； <2>全长嵌合抗体H-F2A-L的构建①接头片段F2A的合成该片段由3部分构成含NsiI酶切位点的嵌合重链H的3’端序列、弗林蛋白酶和口蹄疫病毒2A自剪切多肽序列及含PvuII酶切位点的嵌合轻链L的5’端序列；②中间质粒pUC57/F2A的构建将接头片段F2A插入到pUC57质粒的BamH I和Xba I之间，获得中间质粒pUC57/F2A ；③含有嵌合轻链的质粒PUC57/F2A-L的构建用BamH I和Xba I双酶切质粒PUC57/F2A，酶切产物经I %的琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒分别回收接头片段F2A和载体片段PUC57 ;进而用Pvu II酶切接头片段F2A，获得5’端为BamH I酶切位点和3’端为Pvu II酶切位点的接头片段F2A ;用Pvu II和Xba I双酶切嵌合轻链L，获得5’端为Pvu II酶切位点和3’端为Xba I位点的轻链片段L ;然后，将这两个片段用T4DNA连接酶连接后克隆入载体PUC57，获得含有嵌合轻链的质粒pUC57/F2A-L ；④片段H-F2A-L的拼接用BamH I酶和Xba I酶切pUC57/F2A_L，获得片段F2A-L ;进而用Nsi I酶切片段F2A-L，获得5’端为Nsi I酶切位点和3’端为Xba I酶切位点的片段F2A-L ;用BamH I和Nsi I双酶切嵌合重链H，获得5’端为BamH I酶切位点和3’端为Nsi I位点的重链片段H ;通过T4DNA连接酶与片段F2A-L相连，获得5’端为BamHI酶切位点和3’端为Xba I位点的嵌合抗体全长片段H-F2A-L(SEQ. ID. No. 3)；<3>慢病毒表达质粒pwpI/H-F2A_L的构建将纯化回收的片段H-F2A-L，用DNA末端补平试剂盒补平两端；同时用PmeI酶切慢病毒表达质粒PWPI，经SAP去磷酸化后，用T4DNA连接酶与H-F2A-L连接，连接产物转化DH-5a感受态细菌，抽提质粒后用载体测序引物EFl a和重链下游引物gammal-B作PCR，筛选正向插入阳性克隆PWPI/H-F2A-L，并进行测序验证，即得；上述各引物为H-A(SEQ. ID. No. 4) :5，-CGC GGA TCC GCC ACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATCCTC T-3，，gammal-B (SEQ. ID. No. 5) :5，_ATC GAT CGT CAT TTA CCC GGA GAC AGG GAG AG_3，L-A(SEQ. ID. No. 6) :5，-TGC ATG CAT GCC ACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATCCTC T-3，，Kappa-B (SEQ. ID. No. 7) :5，_GGG TCT AGT CTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT-3，:EFl a (SEQ. ID. No. 8) :5，-TCA AGC CTC AGA CAG TGG TTC-3，。口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)的多妝 2A 基因编码一种自剪切蛋白。两个外源基因之间以2A序列连接形成一个完整的ORF，翻译时融合蛋白可在编码2A区域的C端被2A切开，将融合蛋白切割分离为两个独立的蛋白，FMDV 2A短基因序列和2A高效的自剪切效率使之成为构建多顺反子载体的有效工具。Jianmin F.等人在腺相关病毒表达载体中利用有自我剪切能力的弗林蛋白酶(Furin)/ 口蹄疫病毒2A多肽(F/2A)同时表达单克隆抗体DClOl的重链和轻链，从而实现了全长抗体在体内持续高效的表达，并取得了显著的抗肿瘤效果。本发明在嵌合抗体轻、重链之间弓I入F/2A序列和慢病毒表达系统对轻、重链进行共表达，并与含IRES的嵌合抗体慢病毒表达载体进行比较，结果表明由F/2A介导的嵌合抗体的表达水平要高于由IRES介导的嵌合抗体。本发明为获得高表达水平的完整抗体展示了新的构建策略，也为抗pl85OTbB2基因工程抗体的研究开辟了新的途径。


图I是本发明重组慢病毒表达载体PWPI/H-F2A-L的构建策略图。图2是抗人pl85ertB2单抗嵌合轻、重链基因的PCR产物电泳图，图中M DNA markerDL2000,1 5嵌合轻链基因(L)，6 10嵌合重链基因(H)。图3 是片段 H-F2A-L 电泳图，图中M DNA marker DL10000,1 片段 H-F2A-L。图4是慢病毒表达质粒pWPI/H-F2A-L的PCR鉴定电泳图，图中M DNA markerDL10000,1 3pffPI/H-F2A-L质粒，4pWPI质粒，5和7载体引物EFla与重链下游引物gamma I -B对正向连接质粒的PCR扩增条带,6和8载体引物EFI a与重链下游弓丨物gamma I -B对反向连接质粒的PCR扩增条带。图5是慢病毒三质粒共转染293T细胞绿色荧光蛋白表达的显微镜观察图，图中A、C、E分别为荧光下pWPI/H-F2A-L组、pWPI/H-IRES-L组、pWPI组，B、D、F分别为可见光下 pWPI/H-F2A-L 组、pWPI/H-IRES-L 组、pWPI 组。图6是3种慢病毒的转染效率流式细胞仪检测图，图中A、B、C分别是转染pWPI/H-F2A-L、pWPI/H-IRES-L、pWPI 的 293T 细胞，D 是未转染的 293T 细胞。图7是RT-PCR鉴定嵌合抗体的轻、重链的表达电泳图，图中1嵌合抗体H_F2A_L的轻链基因，2嵌合抗体H-IRES-L的轻链基因，3嵌合抗体H-F2A-L的重链Fd片段，4嵌合抗体H-IRES-L的重链Fd片段。
具体实施例方式含F/2A序列的抗pl85ertB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体及其构建方法研究I材料与方法I. I质粒、菌株和细胞三质粒慢病毒系统由表达质粒pWPI、结构质粒pCMV-dR 8. 74和封套质粒pMD2G组成，为加拿大渥太华大学临床肿瘤中心实验室惠赠。含F/2A序列的质粒pUC57/F2A由上海生工公司构建。转化用大肠杆菌DH-5a、含有抗pl85OTbB2人鼠嵌合轻、重链基因的质粒pWPI/H-IRES-L、293T细胞均由为广西壮族自治区肿瘤防治研究所保存。 I. 2工具酶和主要试剂限制酶BamH I, Pvu II, Nsi I, Xba I, Pme I、T4DNA连接酶等均购自纽英伦生物技术公司。Taq DNA聚合酶、小量质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒、DNA末端补平试剂盒均购自Genstar公司。DNA marker、奸碱性磷酸酶(SAP)购自大连宝生物工程有限公司。Ε. Z. N. A.⑧无内毒素质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；RIzol试剂购自Invitrogen公司。羊抗人K抗体、羊抗人IgG Fc-HRP、兔抗羊IgG-HRP购自Sigma公司。逆转录试剂盒购自MBI Fermentas公司。100mL/L胎牛血清购自四季青生物公司。PCR引物合成及产物测序由Invitrogen公司合成。I. 3 引物扩增嵌合抗体重链基因的引物为H-A(SEQ. ID. No. 4) :5，-CGC GGA TCC GCC ACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATCCTCT-3’ (含 BamH I 酶切位点 GGA TCC)，gammal-B (SEQ. ID. No. 5) :5，_ATC GAT CGT CAT TTA CCC GGA GAC AGG GAG AG_3， ；扩增嵌合抗体轻链基因的引物为L-A(SEQ. ID. No. 6) :5，-TGC ATG CAT GCC ACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATCCTCT-3，，Kappa-B (SEQ. ID. No. 7) :5，-GGG TCT AGT CTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT-3’(含Xba I 酶切位点 TCT AGT)；pWPI质粒克隆位点如的测序引物为EFl a (SEQ. ID. No. 8) :5，-TCA AGC CTC AGA CAG TGG TTC-3，；用于检测抗人pl85ertB2嵌合抗体重链mRNA表达的引物为H-F(SEQ. ID. No. 9) :5’ -AAG TCC AAC TGC AGC AGT CTG G-3’H-R(SEQ. ID. No. 10) :5，-CTC GGG GCT GCC CTT TGG-3’ ；用于检测抗人pl85ertB2嵌合抗体轻链mRNA表达的引物为L-F(SEQ. ID. No. 11) :5，-GAC ATT CAG CTG ACC CAG TCT CCA-3，，L-R(SEQ. ID. No. 12) :5，-CTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT-3，。I. 4抗pl85OTbB2人鼠嵌合抗体重、轻链基因的扩增用小量质粒抽提试剂盒抽提含有抗pl85OTbB2人鼠嵌合抗体轻、重链基因的质粒pWPI/H-IRES-L，并以此为模板，在DNA Taq酶作用下分别用H-A和gammal-B、L-A和Kappa-B扩增出嵌合重链基因H和嵌合轻链基因L ;扩增条件为94°C预变性5min，94°C变性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸2min，35个循环，最后72°C延伸IOmin ;PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收目的基因。I. 5全长嵌合抗体H-F2A-L的构建I. 5. I接头片段F2A的合成由上海生工公司合成接头片段F2A，该片段由3部分构成嵌合重链H的3’端序列(含Nsi I酶切位点)、弗林蛋白酶和口蹄疫病毒2A自剪切多肽序列及嵌合轻链L的5’端序列(含PvuII酶切位点的)；I. 5. 2中间质粒pUC57/F2A的构建将接头片段F2A插入到pUC57质粒的BamH I和Xba I之间，构建中间质粒pUC57/F2A ；I. 5. 3含有嵌合轻链的质粒PUC57/F2A-L的构建
用BamH I和Xba I双酶切质粒pUC57/F2A，酶切产物经I %的琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒分别回收接头片段F2A和载体片段pUC57 ;进而用Pvu II酶切接头片段F2A，获得5’端为BamH I酶切位点和3’端为Pvu II酶切位点的接头片段F2A ;用Pvu II和Xba I双酶切嵌合轻链L，获得5’端为Pvu II酶切位点和3’端为Xba I位点的轻链片段L ;然后，将这两个片段用T4DNA连接酶连接后克隆入载体pUC57，获得含有嵌合轻链的质粒 pUC57/F2A-L ；
I. 5. 4 片段 H-F2A-L 的拼接用BamH I酶和Xba I酶切pUC57/F2A_L，获得片段F2A-L ;进而用Nsi I酶切片段F2A-L，获得5’端为Nsi I酶切位点和3’端为Xba I酶切位点的片段F2A-L ;用BamH I和Nsi I双酶切嵌合重链H，获得5’端为BamH I酶切位点和3’端为Nsi I位点的重链片段H ;通过T4DNA连接酶与片段F2A-L相连，获得5’端为BamH I酶切位点和3’端为Xba I位点的嵌合抗体全长片段H-F2A-L ；I. 6慢病毒表达质粒pWPI/H-F2A-L的构建将纯化回收的片段H-F2A-L，用DNA末端补平试剂盒补平两端。同时用PmeI酶切慢病毒表达质粒PWPI，经SAP去磷酸化后，用T4DNA连接酶与H-F2A-L连接，连接产物转化DH-5a感受态细菌，抽提质粒后用载体测序引物EFl a和重链下游引物gammal-B作PCR，筛选正向插入阳性克隆PWPI/H-F2A-L，并进行测序验证。慢病毒表达质粒pWPI/H-F2A_L的构建策略见图I。I. 7慢病毒的包装及病毒滴度测定用磷酸钙沉淀法将慢病毒pWPI/H-F2A-L载体、pCMV_dR8. 74、pMD2. G共转染293T细胞。48h后在荧光显微镜下观察荧光表达情况。72h收集转染后的病毒上清，以O. 45 μ m滤器过滤，获得的培养液上清则含有携带H-F2A-L的重组病毒。同时分别转染pWPI/H-IRES-L+pCMVdR8. 74+pMD2. G 和 pWPI+pCMVdR8. 74+pMD2. G (空载载体对照)进入 293T 细胞作比较。在6孔板中分别接种2 X IO5的293T细胞，将所收集的上清按10'10'10'10'10_5、10_6倍稀释，将Iml稀释后的上清分别加入到相应的孔中。48h后在荧光显微镜下观察各浓度孔中GFP的表达情况并计数表达GFP的细胞个数，乘以相应的稀释倍数即可得到病
毒滴度。I. 8重组慢病毒感染293T细胞的转导效率检测用重组慢病毒按Hanawa H的方法(Comparison of various envelope proteinsfor their ability to pseudotype lentiviral vectors and transduce primitivehematopoietic cells from human blood[J]. Mol Ther, 2002, 5 :242-251)分别感染 293T细胞，分为实验一组(PWPI/H-F2A-L)、实验二组(pWPI/H-IRES-L)和对照组(pWPI)，重组病毒感染48h后，用流式细胞仪检测GFP阳性细胞百分数将I X IO6细胞离心沉淀，用PBS洗二次将细胞重新悬浮于Iml PBS中，尽可能吹打成单个细胞，在流式细胞仪上统计GFP阳性细胞数，检测慢病毒感染效率(转基因效率)，以未感染重组慢病毒的293T细胞为阴性对照。I. 9嵌合抗体在293T细胞中的表达I. 9. IRT-PCR检测嵌合抗体的表达
再次用3种慢病毒分别感染3组293T细胞，收集重复感染后的293T细胞，提取总RNA，反转录成cDNA，用RT-PCR分别鉴定嵌合抗体H-F2A-L和H-IRES-L的稳定表达。以H-F为5'端引物，以H-R为3'端引物扩增人-鼠嵌合抗体重链Fd片段；以L-F为5'端引物，以L-R为3'端引物扩增人-鼠嵌合抗体轻链。I. 9. 2ELISA法检测嵌合抗体的表达以lmg/L羊抗人κ链抗体包被酶标板，4°C过夜，50g/L BSA封闭液37°C封闭2h后，分别加入重组慢病毒(pWPI/H-F2A-L、pWPI/H-IRES -L和pWPI)感染后的293T细胞培养上清液，同时以未感染的293T细胞上清为阴性对照。37°C孵育2h，经常规洗涤，加入羊抗人IgG Fe片段-HRP酶标抗体孵育，OPD显色，室温避光反应5min，酶联免疫仪测定A490值，检测细胞是否分泌人-鼠嵌合抗体。计量数据采用平均数土标准差表示，采用DPS 7. 05统计软件进行方差分析。2 结果2. I抗人pl85OTbB2单抗嵌合重链基因⑶和嵌合轻链基因(L)的扩增用引物H-A和gammal-B、L-A和Kappa-B，分别从质粒pWPI/H-IRES-L中扩增出pl85OTbB2单抗的嵌合重链基因(H)和嵌合轻链基因(L)。经I %琼脂糖凝胶电泳鉴定，H和L这两条特异性条带与理论值一致，大小分别为2100bp和810bp左右(如图2)。2. 2全长嵌合抗体H-F2A-L的构建利用构建的中间质粒PUC57/F2A和扩增出的嵌合重链基因H、嵌合轻链基因L，经过多步酶切、连接，最终获得嵌合抗体全长片段H-F2A-L，纯化回收、电泳后可见大约为3000bp的条带(图3)。2. 3慢病毒表达质粒pWPI/H-F2A-L的构建用PmeI酶切慢病毒表达质粒pWPI，将片段H_F2A_L末端补平后插入克隆位点。为了确保H-F2A-L基因连接方向的正确，以pWPI载体上的引物EFla和重链下游引物gammal-B作PCR，若插入的基因是正向的，PCR应扩增出大小为2400bp的片段，若基因插入方向是反向的，则PCR扩增不出条带(图4)。测序结果显示成功构建了含F/2A序列的抗pl85erbB2人鼠嵌合抗体全长基因的慢病毒表达载体pWPI/H-F2A-L。2. 4慢病毒的包装及病毒滴度测定用慢病毒系统三质粒共转染293T包装细胞，48h后在荧光显微镜下观察，三个实验组均可见大量的绿色荧光蛋白GFP的表达(图5)，说明构建的包装细胞系能够有效地产生慢病毒。将转染72h后的包装细胞上清液再感染293T细胞(此时293T作为靶细胞)，48h后测定6孔板中慢病毒的滴度，结果对照空载体pWPI组的病毒滴度最高，为2. I X IO6TU/mL, pffPI/H-F2A-L组的病毒滴度次之，为4. 3X105TU/mL ;而pWPI/H-IRES-L组的病毒滴度最低，为 3. 5X105TU/mL。2. 5基因转导效率的检测结果用3种重组慢病毒分别感染293T细胞，48h后通过流式细胞仪检测GFP阳性细胞百分数。结果显示，PWPI/H-F2A-L组的阳性细胞率为87. 68%,pffPI/H-IRES-L组的阳性细胞率为79. 08%,而空载体pWPI组的阳性细胞率最高，为95. 51 %，未感染慢病毒的293T阴性细胞没有荧光表达(图6)。可见当空载体pWPI中插入嵌合抗体基因后，慢病毒的转染效率会下降，而转导嵌合抗体H-F2A-L基因的效率要高于转导嵌合抗体H-IRES-L基因的效率。2.6嵌合抗体轻、重链基因mRNA的表达经RT-PCR 检测，转染 pWPI/H-F2A-L 的 293T 细胞和转染 pWPI/H-IRES-L 的 293T细胞后均有嵌合轻链基因和嵌合重链基因的表达(图7)。2. 7嵌合抗体的表达采用夹心ELISA法测定4组细胞(转染pWPI/H-F2A_L的293T细胞、转染pWPI/H-IRES-L的293T细胞、转染pWPI的293T细胞和未转染的293T细胞)上清中嵌合抗体的表达。结果显示，转染PWPI/H-F2A-L的细胞上清和转染pWPI/H-IRES-L的细胞上清为阳性反应，而转染空载体pWPI的细胞上清为阴性反应(表I)。这表明无论是F/2A元件还是IRES元件连接的重、轻链都能够在293T细胞中表达，而且都能够正确地组装成有活性的抗体，很好地分泌到细胞外。其中，由F/2A介导的嵌合抗体的表达水平要高于由IRES介导的嵌合抗体。表I ELISA分析嵌合抗体的表达
GD490差异臟
_0.05 0.01
转染 pWPI/H-F2A-L 的细胞上清 2.485 ±0.030 a A 转染 pWPI/H-IRES-L 的细胞上清 2.007 ±0.096 b B 转染pWPI的细胞上清 0.334±0.248 c C 未转染的细胞上清_0.299±0.095_c_C3 讨论erbB2作为肿瘤发生的癌基因，在20% 30%的乳腺癌中过表达，在25% 32%的卵巢癌中过表达，是与乳腺癌、卵巢癌的侵袭转移及预后密切相关的基因之一。针对pl85OTbB2胞外区抗原的抗pl85OTbB2抗体，显示了良好的抗肿瘤疗效。为了克服鼠单克隆抗体在人体治疗中出现的问题，经典的基因工程抗体技术将人源抗体恒定区替代鼠抗体的恒定区，即构建人鼠嵌合抗体。嵌合抗体不仅保留了亲本抗体的特异性和亲和力，大大降低了人抗鼠抗体(HAMA)反应，而且其人源Fe段可激发抗体介导的细胞毒(ADCC)作用和补体介导的细胞毒(CDC)效应，从而增加其对肿瘤细胞的杀伤效果。构建嵌合抗体表达盒的策略，既有将轻、重链分别构建于不同表达载体的，也有将轻、重链串联于同一表达载体的。据报道，双顺反子载体不仅可以将轻、重链的表达进行偶联，而且还能够提高抗体的表达水平。常用的表达双顺反子的元件为内部核糖体进入位点(IRES)或自剪切多肽2A，它们的作用机理分别为①IRES元件具有不依赖帽子结构而独立募集核糖体的功能，进而可启动下游基因的翻译2A元件则可在翻译过程中形成的高级结构对核糖体肽基转移酶中心造成空间位阻，导致无法形成正常的肽链连接，但同时核糖体却能继续翻译下游蛋白，从而形成一种类似蛋白水解酶的作用将前后两个蛋白顺式“切开”。由于两者作用机理的差异，导致它们在多顺反子表达中发挥的实际效果也存在明显的特点，因此在实际应用中通常需要构建两种或多种不同的表达载体来进行比较，才能找到最合适的表达方案。2005年，Jianmin F等人通过利用弗林蛋白酶(Furin)酶切位点和2A自剪切多肽(F/2A)连接抗体的轻链和重链，构建腺相关病毒表达载体。Furin是真核生物细胞中一种重要的内切蛋白酶。Furin能识别特定的氨基酸序列，对分泌途径中许多重要的多肽和蛋白的前体进行剪切加工，使之具有生物活性。通过2A片段自剪切和Furin酶切位点的酶切，实现了在一个表达载体和一个开放阅读框中同时均衡地表达一个全长抗体的轻、重链，经F/2A的自动剪切，去除了连接轻、重链的所有外源序列，抗体表达水平达到了治疗肿瘤的水平，克服了轻、重链构建在两个载体中所导致的抗体表达匹配不完全的缺点，为全长抗体的表达提供了一个新的方法和技术。2011年，李蒙等利用F/2A构建重组抗死亡受体5 (DR5)全长人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体PWPXL-HF2AL，结果表明用F/2A多肽技术表达的人鼠嵌合抗体可在F/2A处自我剪切，人鼠嵌合抗体的轻、重链表达对称并具有与其母本鼠源抗体相似的亲和力和杀伤多种肿瘤细胞的活性。 在此基础上，本发明利用F/2A构建重组抗pl85ertB2全长人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体pWPI/H-F2A-L，并且与已构建的另一双顺反子表达载体pWPI/H-IRES-L进行比较。结果表明，pffPI/H-F2A-L组的病毒滴度(4. 3X105TU/mL)高于pWPI/H-IRES-L组的病毒滴度(3. 5 X 105TU/mL)，而且前组病毒的感染效率(87. 68% )也高于后组的(79. 08% )。其原因可能是因为IRES的结构较大(约590bp)，而F/2A的结构小(84bp)，故F/2A可以缓解慢病毒载体PWPI装载量的压力，更有利于病毒的包装和感染；ELISA检测显示，由F2A介导的嵌合抗体表达水平要高于由IRES介导的。其原因可能是因为IRES对位于其后的基因翻译起始能力相对较弱，导致其下游基因的表达量仅是上游的20 % 50 %，而F/2A在维持上下游基因表达平衡性方面优于IRES元件，故由F/2A介导的嵌合抗体完整分子表达水平会较高。综上所述，含F/2A的嵌合抗体表达盒,与含IRES的表达盒相比,更有利于慢病毒介导的基因转移和嵌合抗体的表达。
权利要求
1.一种含F/2A序列的抗pl85MbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体，其特征在于该载体是PWPI/H-F2A-L,其中H和L分别是抗pl85ertB2人鼠嵌合抗体重链基因和抗pl85eAB2人鼠嵌合抗体轻链基因，F2A是弗林蛋白酶和口蹄疫病毒2A自剪切多肽。
2.根据权利要求I所述的含F/2A序列的抗pl85OTbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体，其特征在于所述抗pl85eAB2人鼠嵌合抗体重链基因由鼠抗人pl85eAB2单抗重链可变区基因vH和人IgGl的重链恒定区基因Y I连接而成；所述抗pl85ertB2人鼠嵌合抗体轻链基因由鼠抗人pl85eAB2单抗轻链可变区基因vL和人IgGl的轻链恒定区基因K连接而成。
3.根据权利要求I所述含F/2A序列的抗pl85 bB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于用具有自我剪切能力的弗林蛋白酶Furin/ 口蹄疫病毒2A多肽F/2A连接人鼠嵌合抗体的重链和轻链，形成一个开放阅读框ORF，插入慢病毒表达载体pWPI，即得。
4.根据权利要求3所述含F/2A序列的抗pl85 bB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤 〈1>抗pl85MbB2人鼠嵌合抗体重、轻链基因的扩增 用小量质粒抽提试剂盒抽提含有抗pl85OTbB2人鼠嵌合抗体轻、重链基因的质粒pWPI/H-IRES-L，并以此为模板，在DNA Taq酶作用下分别用H-A和gammal-B、L-A和Kappa-Β扩增出嵌合重链基因H和嵌合轻链基因L ;扩增条件为94°C预变性5min，94°C变性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸2min，35个循环，最后72°C延伸IOmin ;PGR产物经I %的琼脂糖凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收目的基因； <2>全长嵌合抗体H-F2A-L的构建 ①接头片段F2A的合成该片段由3部分构成含NsiI酶切位点的嵌合重链H的3’端序列、弗林蛋白酶和口蹄疫病毒2A自剪切多肽序列及含Pvu II酶切位点的嵌合轻链L的5’端序列； ②中间质粒PUC57/F2A的构建将接头片段F2A插入到pUC57质粒的BamHI和Xba I之间，获得中间质粒PUC57/F2A ； ③含有嵌合轻链的质粒pUC57/F2A-L的构建用BamHI和Xba I双酶切质粒pUC57/F2A，酶切产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒分别回收接头片段F2A和载体片段PUC57 ;进而用Pvu II酶切接头片段F2A，获得5I酶切位点和3’端为PvuII酶切位点的接头片段F2A;用Pvu II和Xba I双酶切嵌合轻链L，获得5’端为Pvu II酶切位点和3’端为Xba I位点的轻链片段L ;然后，将这两个片段用T4DNA连接酶连接后克隆入载体PUC57，获得含有嵌合轻链的质粒pUC57/F2A-L ； ④片段H-F2A-L的拼接用BamHI酶和Xba I酶切pUC57/F2A_L，获得片段F2A-L ;进而用Nsi I酶切片段F2A-L，获得5’端为Nsi I酶切位点和3’端为Xba I酶切位点的片段F2A-L ;用BamH I和Nsi I双酶切嵌合重链H，获得5’端为BamH I酶切位点和3’端为Nsi I位点的重链片段H ;通过T4DNA连接酶与片段F2A-L相连，获得5’端为BamH I酶切位点和3’端为Xba I位点的嵌合抗体全长片段H-F2A-L ； <3>慢病毒表达质粒pwpI/H-F2A-L的构建 将纯化回收的片段H-F2A-L，用DNA末端补平试剂盒补平两端；同时用PmeI酶切慢病毒表达质粒pWPI，经SAP去磷酸化后，用T4DNA连接酶与H-F2A-L连接，连接产物转化.DH-5a感受态细菌，抽提质粒后用载体测序引物EFl a和重链下游引物gammal-B作PCR，筛选正向插入阳性克隆PWPI/H-F2A-L，并进行测序验证，即得； 所述各引物为H-A :5’ -CGC GGA TCC GCC ACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC T-3’，gammal-B :5’ -ATC GAT CGT CAT TTA CCC GGA GAC AGG GAG AG-3’ ；L-A :5’ -TGC ATG CAT GCC ACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC T-3’，Kappa-B :5’ -GGG TCT AGT CTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT-3’ ；EFl α :5’ -TCA AGC CTC AGA CAG TGG TTC-3’。
全文摘要
本发明公开了一种含F/2A序列的抗p185erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体及其构建方法，用具有自我剪切能力的弗林蛋白酶(Furin)/口蹄疫病毒2A多肽(F/2A)连接人鼠嵌合抗体的重链和轻链，形成一个开放阅读框(ORF)，插入慢病毒表达载体pWPI，构建重组抗p185erbB2全长人鼠嵌合抗体表达载体pWPI/H-F2A-L。经测序鉴定，pWPI/H-F2A-L与预期设计一致。重组慢病毒的感染效率分别为87.68％，感染293T细胞后，有嵌合重链和嵌合轻链的表达。与含IRES的嵌合抗体慢病毒表达载体进行比较，由F/2A介导的嵌合抗体的表达水平要高于由IRES介导的嵌合抗体，为今后抗p185erbB2工程抗体的研究奠定了基础。
文档编号C12N15/867GK102618583SQ20121008091
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月24日 优先权日2012年3月24日
发明者刘芳, 张玮, 李力 申请人:广西壮族自治区肿瘤防治研究所