专利名称：一种克服靶细菌限制修饰障碍导入外源dna的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种克服靶细菌限制修饰障碍导入外源DNA的方法。
背景技术：
细菌限制修饰系统由限制性内切酶(限制酶)与DNA甲基转移酶组成，前者能够特异性识别并切割DNA，后者能够向DNA的碱基添加一个甲基修饰，从而防止限制酶对DNA的切割。限制修饰系统能够选择性的降解侵入细菌内部的外源DNA，实现细菌自我保护的目的。根据限制修饰系统的亚基组成、切割位点、序列特异性与辅因子特征，将其划分为四大类型。I型、II型和III型限制修饰系统的限制酶亚基能够识别并切割未甲基化的DNA，但如果DNA首先被甲基转移酶亚基识别并修饰后，限制酶即不能完成切割。IV型限制修饰 系统只有限制酶组成，不含甲基转移酶，它识别并切割具有外源甲基化模式的DNA，因此，是一种甲基化依赖的限制酶。另外，最近研究表明DNA骨架的磷硫酰修饰酶及其对应的限制酶是一类新型的限制修饰系统(Nucleic Acids Research, 38, 7133-7141)。这种复杂的修饰-切割模式，极大的保护了细菌自身DNA的安全性，是细菌作为有效防止噬菌体、环境中死细菌释放的DNA等外源DNA入侵的主要手段。同时，这也成为现今利用分子生物学手段将外源DNA导入细菌、实现遗传操作的主要障碍。含有多套限制修饰系统细菌的遗传操作尤为困难。迄今为止研究人员发明了两类技术克服限制修饰障碍。第一类策略即修饰外源DNA的策略，包括体外修饰和大肠杆菌体内修饰。如利用靶细菌粗蛋白抽提物(含有DNA甲基转移酶)体外修饰外源DNA，能够实现对幽门螺杆菌、蜡样芽胞杆菌和韦氏芽胞杆菌的转化(MolecularMicrobiology,37,1066-1074,Applied and Environmental Microbiology,74,7817-7820);或在大肠杆菌中克隆表达靶细菌DNA甲基转移酶，体内修饰外源质粒DNA，如在大肠杆菌TOPlO中克隆表达青春棒杆菌的两个DNA甲基转移酶，进行穿梭质粒的体内修饰，实现了青春棒杆菌的遗传转化(Nucleic Acids Research, 37, e3)。第二类方法即灭活限制修饰系统的方法，包括利用物理手段灭活和基因敲除。利用转化后加热的方法暂时性灭活靶细菌限制酶，外源质粒对谷氨酸棒杆菌转化率提高至IO8CFUz^g DNA (MicrobialBiotechnology, 52, 541-545);敲除丙酮丁醇梭菌CAC1502基因后可以使其接受非甲基化质粒DNA(PLoS 0NE,5,e9038);但也有报道表明敲除SauI限制性内切酶不足以使金黄色葡萄球菌接受外源 DNA (Applied and Environmental Microbiology, 75, 3034-3038)。虽然上述技术可以在一定程度上提高外源DNA对靶细菌的转化率，但是还存在以下问题和不足之处部分方案虽然能够利用靶细菌DNA甲基转移酶在体外修饰外源DNA分子，但利用粗蛋白抽提物的体外修饰效率较低，且在修饰的同时限制酶也会降解部分质粒；体内修饰方案未解除大肠杆菌自身DNA甲基转移酶对外源DNA分子的甲基化，这种带有大肠杆菌甲基化模式的DNA易激活靶细菌的III型限制系统；许多细菌的限制酶为非热敏感性，不能利用加热手段暂时灭活；如果细菌含有多套限制修饰系统时，逐个敲除限制酶基因费时费力，同时敲除限制酶还造成靶细菌易受噬菌体感染，对工业微生物发酵菌种的构建极为不利；技术的通用性不强，可能仅适用于一种或少数几种细菌
发明内容
本发明的一个目的是提供一种将外源DNA分子导入靶细菌的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤I)将靶细菌基因组中所有DNA甲基转移酶编码基因在自身限制修饰系统缺失的大肠杆菌中共表达，得到重组菌A ；2)将外源DNA分子导入所述重组菌A进行体内修饰，得到甲基化修饰的外源DNA分子;
3)将所述甲基化修饰的外源DNA分子导入所述靶细菌中。上述方法中，步骤I)中，所述将靶细菌基因组中所有的DNA甲基转移酶编码基因在自身限制修饰系统缺失的大肠杆菌中共表达为将所述靶细菌基因组中所有的DNA甲基转移酶编码基因通过重组载体导入所述自身限制修饰系统缺失的大肠杆菌内；步骤2)包括如下步骤A)将所述外源DNA分子导入所述重组菌A中，得到重组菌B ;B)诱导培养所述重组菌B，得到诱导后重组菌B ；C)提取所述诱导后重组菌B的DNA，即得到甲基化修饰的外源DNA分子。上述方法中，步骤I)中，所述重组载体为将所述所有DNA甲基转移酶编码基因均插入pWYE724质粒中，得到共表达所有DNA甲基转移酶的重组载体；上述重组载体中的每个DNA甲基转移酶编码基因可以使用各自的启动子或共用一个启动子(构成操纵子的结构)。步骤2)的B)中，所述诱导培养采用的诱导剂为阿拉伯糖。上述方法中，步骤2)的B)中，所述诱导培养为将所述重组菌B在含有终浓度为0.2% (质量百分含量)的阿拉伯糖的液体培养基中诱导培养；所述诱导培养的温度为25°C _37°C，所述诱导培养的时间为3-24小时；所述诱导培养的温度具体为30°C，所述诱导培养的时间具体为12小时。上述方法中，所述靶细菌为含有限制修饰系统的真细菌或古生菌，所述含有限制修饰系统的真细菌或古生菌具体为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TA208、腊样芽胞杆菌(Bacillus cereus)ATCC 10987 或汉氏硝化细菌(Nitrobacterhamburgensis)X14 ；所述自身限制修饰系统缺失的大肠杆菌具体为大肠杆菌(Escherichiacoli)EC135CGMCCN0. 5925 ;其限制修饰系统基因型为 mcrAA (mrr-hsdRMS-mcrBC)Δdcm::FRTΔdam::FRT。上述方法中，所述外源DNA 分子为 pAD123、pAD43_25、pMK3、pMK4、pHCMC02、PHCMC04、pDG148StuI、pWYE748 或 pBBRl-MCSS-P^^ 345Q-GFP。上述方法中，所述解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TA208中所有 DNA 甲基转移酶编码基因为 BAMTA208_06525、BAMTA208_6715、BAMTA208_19835和 BAMTA208_16660 ；所述 BAMTA208_06525、BAMTA208_6715、BAMTA208_19835 和BAMTA208_16660的核苷酸序列依次为序列表中的序列2、序列3、序列4和序列5 ；所述蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)ATCC 10987中所有DNA甲基转移酶编码基因为 BCE_0393、BCE_4605、BCE_5606、BCE_5607、BCE_0365 和 BCE_0392 ;所述 BCE_0393、BCE_4605、BCE_5606、BCE_5607、BCE_0365和BCE_0392的核苷酸序列依次为序列表中的序列6、序列7、序列8、序列9、序列10和序列11 ；所述汉氏硝化细菌(Nitrobacter hamburgensis)X14中所有DNA甲基转移酶编码基因为 Nham_0569、Nham_0582、Nham_0803 和 Nham_3225 ;所述 Nham_0569、Nham_0582、Nham_0803和Nham_3225的核苷酸序列依次为序列表中的序列12、序列13、序列14和序列15。
在上述方法前还包括确定靶细菌基因组中所有DNA甲基转移酶编码基因的步骤(a)通过同源序列比对等方法，预测靶细菌中编码DNA甲基转移酶的基因；(b)将预测的所有编码DNA甲基转移酶的基因分别连入可诱导的表达载体，再转入自身限制修饰系统缺失的大肠杆菌中，然后分别诱导培养。(C)分别制备上述转入表达载体的大肠杆菌的基因组DNA (包括染色体DNA与表达载体)，检测DNA是否含已被甲基化修饰，如果确定DNA已被甲基化修饰，即证明预测的DNA甲基转移酶确实具有DNA甲基化修饰功能，并且其蛋白在大肠杆菌中具有活性。检测方法包括高效液相色谱法和DNA点杂交方法。上述DNA甲基转移酶，包括I型、II型与III型甲基转移酶，I型DNA甲基转移酶应包括甲基转移亚基与DNA识别亚基。其中所述可诱导的表达载体，可以是低拷贝，也可以是高拷贝载体，但应与转化靶细菌的穿梭/整合质粒能够相容。甲基转移酶的启动子可以是其自身的启动子，也可以是在大肠杆菌中可诱导型的启动子，包括但不局限于阿拉伯糖诱导启动子、IPTG诱导型启动子和鼠李糖诱导启动子。甲基转移酶诱导温度为8°C -43°C。其中所述自身限制修饰系统缺失的大肠杆菌为已知的限制酶、DNA甲基转移酶完全缺失的大肠杆菌，这些酶包括但不局限于Dam、Dcm、EcoKI> Mrr> McrA和Mrr。本发明的另一个目的是提供一株大肠杆菌(Escherichia coli)EC135。本发明提供的大肠杆菌，其保藏编号为CGMCC NO. 5925。菌株EC135于2012年3月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 5925，其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。其中所述转化靶细菌的方法，因选择的靶细菌不同而异，包括但不局限于化学转化法、接合转移、电转化法及原生质体转化法。本发明的实验证明，本发明与现有的克服细菌限制修饰障碍，实现遗传操作的方法相比，优点在于I.使用一株自身限制修饰系统完全缺失的大肠杆菌作为宿主，一方面克服了大肠杆菌修饰模式(Dam、Dcm和EcoKI)对靶细菌IV型限制修饰系统的激活作用，另一方面，大肠杆菌Mrr、McrA和McrBC的缺失有利于靶细菌DNA甲基转移酶的克隆表达；2.对靶细菌所有的DNA甲基转移酶进行共表达，真正实现靶细菌DNA甲基化模式的精确模拟；
3.使用的是在大肠杆菌体内DNA甲基化修饰的方式，在培养细菌的过程中同时完成，无需额外的体外反应，无需添加甲基化反应底物，方便快捷；4.在本发明中可使用酿酒酵母组装多个甲基转移酶基因，共表达质粒的构建可在一周内完成，加速了靶细菌限制修饰障碍克服的过程；5.利用本方法得到的靶细菌转化子，其限制修饰系统与出发菌株一致。本方法不会对靶细菌原有的限制修饰系统造成损伤；6.本发明具有很强的通用性，已成功应用于两株芽胞杆菌，一株革兰氏阴性、化能自养细菌的遗传操作，并有望扩展至更多的细菌种属。本发明对于含有多套限制修饰系统的顽固型细菌遗传操作系统构建具有重要意义。
图I为TOPlOdcm基因敲除PCR检测结果图2为EC135dam基因敲除PCR检测结果图3为解淀粉芽胞杆菌TA208DNA甲基转移酶基因PCR扩增结果图4为点杂交检测解淀粉芽胞杆菌TA208DNA甲基转移酶活性图5为pWYE724质粒图谱图6为EcoRV单切检测pM. Bam电泳7为pM. Bam质粒图谱图8为不同宿主制备的穿梭质粒对解淀粉芽胞杆菌ΤΑ208的转化效率(*未检测到)图9为解淀粉芽胞杆菌TA208upp基因敲除PCR验证结果图10为解淀粉芽胞杆菌ΤΑ208和BS043在MM、MM+5-FU培养基生长情况图11为点杂交检测蜡样芽胞杆菌ATCC 10987DNA甲基转移酶活性图12为HindIII单切检测pM. Bce电泳图
图13为pM. Bce质粒图谱图14为不同宿主制备的穿梭质粒对蜡样芽胞杆菌ATCC 10987的转化效率(*未检测到)图15为点杂交检测汉氏硝化细菌X14DNA甲基转移酶活性图16为BamHI单切检测pM. Nham电泳17为pM. Nham质粒图谱图18为绿色荧光蛋白在汉氏硝化细菌Χ14中的表达
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例I、限制修饰系统完全缺失的大肠杆菌EC135的构建
以大肠杆菌T0P10 (北京全式金生物技术有限公司，货号为⑶101)为出发菌株，依次敲除dcm基因(Dcm甲基化酶编码基因)，将染色体recA基因突变为野生型，敲除dam基因(Dam甲基化酶编码基因)得到大肠杆菌EC135，具体如下制备T0P10菌株的感受态细胞，将质粒pKD46(购自美国Coli Genetic StockCenter,以下简写为CGSC，编号7739)转化入T0P10菌株，30°C筛选氨苄青霉素抗性转化子，得到 T0P10/pKD46o利用引物WB089与WB090，以pKD3质粒(购自美国CGSC，编号7631)为模板扩增氯霉素抗性基因，切胶回收1166bp，得到氯霉素抗性基因PCR产物。将T0P10/pKD46菌株在LB培养基中30°C培养，在OD6tltl为O. 2时加入终浓度IOOmM的阿拉伯糖诱导I小时，制备感受态后利用5μ L回收的氯霉素抗性基因PCR产物转化 40 μ L感受态细胞，30°C复苏I小时后将复苏产物涂布于含有34 μ g/mL氯霉素的LB平板，37 °C培养过夜。挑选重组子，利用引物WB064和WB065进行菌落PCR鉴定。阳性重组子PCR产物大小应为1816bp，而原始基因大小为1980bp。挑取阳性重组子，在LB液体培养基中42°C连续培养三代，以消除pKD46质粒，得到TOPlOdcm: :CmR菌株。稀释涂布平板后挑取单菌落TOPlOdcm: : CmR菌株制备电转感受态，将pCP20 (购自美国CGSC，编号7629)质粒转化入TOPlOdcm: : CmR菌株，筛选氨苄青霉素抗性重组子后挑单菌落在不含抗生素的LB培养基中30°C培养至0D_为O. 2，然后提高温度至42°C培养过夜。稀释菌液后涂布无抗性的LB平板，挑取单菌落利用引物WB064和WB065进行菌落PCR鉴定。氯霉素抗性基因消除的阳性重组子扩增产物应为大小应为886bp (图I)，将阳性重组子命名为 TOPlOAdcm: :FRT。由于dam与recA双突变是致死基因型，因此在敲除dam基因之前要先回复突变recAl基因。利用引物WB253和WB254，以大肠杆菌W3110 (购自美国CGSC，编号4474)染色体DNA为模板扩增野生型recA基因(1236bp),连接至载体pKOV (购自美国Addgene,货号#25769)的 NotI 与 BamHI 位点，得到 pKOV-recA。将 pKOV-recA 转化入 T0P10 Δ dcm: :FRT菌株，30°C筛选氯霉素抗性转化子，挑取转化子后在42°C液体LB培养基中培养过夜，并涂布含有氯霉素的LB平板，使pKOV-recA整合至染色体recAl位点。得到单菌落后利用引物WB255和WB256进行菌落PCR，如果有大于7Kb的PCR条带，即说明pKOV-recA已整合至染色体。挑取正确的重组子，42°C培养后涂布于含有10%蔗糖的LB平板，将单菌落在含有氯霉素和不含氯霉素的LB平板上划线同时传代，挑选氯霉素敏感的菌落。利用引物WB255和WB256扩增recA基因后测序，recA+重组子recA基因第482位碱基应为G，而T0P10菌株为A。dam基因的敲除与dcm敲除步骤相同，所用的氯霉素抗性基因扩增引物为WB087和WB088，外侧检测引物为WB062和WB063。基因敲除后扩增产物大小为740bp，原始基因大小为 1356bp(图 2)。经过上述三步遗传操作，所得到的dcm dam缺失、recA回复突变的菌株即为EC135。上述提到的菌株EC135于2012年3月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCjia :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 5925，其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)。
所用到的PCR弓丨物序列见表I。表I、本发明所使用的PCR弓丨物
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引物名称引物序列(5’ -3’ )
WB089CTAAATGGCTGTAATTATGTTAACCTGTCGGCCATCTCAGATGGCCGGTGAAATCTTTGAGCGATTGTGTAGGCTGGAG
WB090ACCGGAATACGGAATTTCGCTTCTCCCGGCGCTTCAAAACCCATTAAGCGCGCGCATAACGGCTGACATGGGAATTAGC
WB064TGCTGAAGCTACCGCAAACCATG
WB065GCACTCCCAGACAATCAATACGC
WB253ATAAGAATGCGGCCGCCACTTGATACTGTATGAGCATACAG
WB254CGCGGATCCCGGGATGTTGATTCTGTCATGGCAT
WB255ATTACCCGGCGGGAATGCTTCAG
WB256TTTACGTCGCAGTTCTTGCTCAC
WB087CTGGATGCTGTCGGAGCTTTCTCCACAGCCGGAGAAGGTGTAATTAGTTAGTCAGCTTGAGCGATTGTGTAGGCTGGAG
WB088ACTTTGACGACATGCAATTTTGCGCGCTGATACCACTCACGCGTTAACATCGTATCTAACGGCTGACATGGGAATTAGC
WB062GGCCGATCTGAAGTAATCAAGGT
WB063TCCAGATAGCTCAGAGGTGTCGC
WB325ATGCCATAGCATTTTTATCC
WR475CGTAGTTTATTCATGAATTCCTCCTTCAACTATGTACTTGAGGTAATCGA
WB476TCGATTACCTCAAGTACATAGTTGAAGGAGGAATTCATGAATAAACTACG
WB477TTATTGCTGTTCATGAATTCCTCCTTTATTCAGATTCTTTATTATCGTAT
WB478ATACGATAATAAAGAATCTGAATAAAGGAGGAATTCATGAACAGCAATAA
WB479GAAAAAAAACGCATGAATTCCTCCTTTATTCTAAATCTAATAATTCATTT
WB480AAATGAATTATTAGATTTAGAATAAAGGAGGAATTCATGCGTTTTTTTTC
WB326GATTTAATCTGTATCAGGWB325
WB575ATACAGTTCATATGTCTTACCTCCTTTAATCGGCGGTATTTTGTGTAGAT
WB576ATCTACACAAAATACCGCCGATTAAAGGAGGTAAGACATATGAACTGTAT
WB577TTTAAACATATAACACTTTCCTCCTTTACGCTTCTAATGTCTCTCGAATG
WB578CATTCGAGAGACATTAGAAGCGTAAAGGAGGAAAGTGTTATATGTTTAAA
权利要求
1.一种将外源DNA分子导入靶细菌的方法，包括如下步骤 .1)将靶细菌基因组中所有DNA甲基转移酶编码基因在自身限制修饰系统缺失的大肠杆菌中共表达，得到重组菌A ; .2)将外源DNA分子导入所述重组菌A进行体内修饰，得到甲基化修饰的外源DNA分子； .3)将所述甲基化修饰的外源DNA分子导入所述靶细菌中。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于 步骤I)中，所述将靶细菌基因组中所有的DNA甲基转移酶编码基因在自身限制修饰系统缺失的大肠杆菌中共表达为将所述靶细菌基因组中所有的DNA甲基转移酶编码基因通过重组载体导入所述自身限制修饰系统缺失的大肠杆菌内； 步骤2)包括如下步骤 A)将所述外源DNA分子导入所述重组菌A中，得到重组菌B； B)诱导培养所述重组菌B，得到诱导后重组菌B; C)提取所述诱导后重组菌B的DNA，即得到甲基化修饰的外源DNA分子。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于 步骤I)中，所述重组载体为将所述所有DNA甲基转移酶编码基因均插入PWYE724质粒中，得到共表达所有DNA甲基转移酶的重组载体； 步骤2)的B)中，所述诱导培养采用的诱导剂为阿拉伯糖。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于 步骤2)的B)中，所述诱导培养为将所述重组菌B在含有终浓度为O. 2% (质量百分含量)的阿拉伯糖的液体培养基中诱导培养； 所述诱导培养的温度为25V _37°C，所述诱导培养的时间为3-24小时； 所述诱导培养的温度具体为30°C，所述诱导培养的时间具体为12小时。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法,其特征在于 所述靶细菌为含有限制修饰系统的真细菌或古生菌，所述含有限制修饰系统的真细菌或古生菌具体为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TA208、腊样芽胞杆菌(Bacillus cereus)ATCC 10987 或汉氏硝化细菌(Nitrobacter hamburgensis)X14 ； 所述自身限制修饰系统缺失的大肠杆菌具体为大肠杆菌(Escherichia coli)EC135CGMCCNo. 5925。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述外源DNA分子为pAD123、pMK3、pMK4、pHCMC02、pHCMC 04、pDG148StuI、pWYE748 或 pBBRl-MCS5_PNham 345Q-GFP。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法,其特征在于 所述解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TA208中所有DNA甲基转移酶编码基因为 BAMTA208_06525、BAMTA208_6715、BAMTA208_19835 和 BAMTA208_16660 ;所述BAMTA208_06525、BAMTA208_6715、BAMTA208_19835 和 BAMTA208_16660 的核苷酸序列依次为序列表中的序列2、序列3、序列4和序列5 ； 所述蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)ATCC 10987中所有DNA甲基转移酶编码基因为 BCE_0393、BCE_4605、BCE_5606、BCE_5607、BCE_0365 和 BCE_0392 ；所述 BCE_0393、BCE_4605、BCE_5606、BCE_5607、BCE_0365和BCE_0392的核苷酸序列依次为序列表中的序列6、序列7、序列8、序列9、序列10和序列11 ；所述汉氏硝化细菌(Nitrobacter hamburgensis)X14中所有DNA甲基转移酶编码基因为 Nham_0569、Nham_0582、Nham_0803 和 Nham_3225 ;所述 Nham_0569、Nham_0582、Nham_0803和Nham_3225的核苷酸序列依次为序列表中的序列12、序列13、序列14和序列15。
8.大肠杆菌(Escherichia coli)EC135，其保藏编号为 CGMCC No. 5925。
全文摘要
本发明公开了一种克服靶细菌限制修饰障碍导入外源DNA的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤1)将靶细菌基因组中所有DNA甲基转移酶编码基因在自身限制修饰系统缺失的大肠杆菌中共表达，得到重组菌A；2)将外源DNA分子导入所述重组菌A进行体内修饰，得到甲基化修饰的外源DNA分子；3)将所述甲基化修饰的外源DNA分子导入所述靶细菌中。本发明的实验证明，本发明与现有的克服细菌限制修饰障碍，实现遗传操作的方法相比转化率高。
文档编号C12R1/085GK102618476SQ20121008012
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月23日 优先权日2012年3月23日
发明者张国强, 温廷益 申请人:中国科学院微生物研究所