专利名称：一株含有Lg-ATF1基因的酿酒酵母工程菌的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，尤其是一株含有Lg-ATFl 基因的酿酒酵母工程菌。
背景技术：
如何提高酒中酯香物质的含量，一直是我国普通白酒、黄酒企业和相关科研单位研究的重要课题。目前提高普通白酒酯含量的主要方法有如下三种一是固液结合法，用液态法生产酒基，用固态法的酒糟、酒尾或成品酒来提高质量；二是调香法，用天然香料调制或用纯化学药品按某一名酒的香味成分组成来进行调香；三是全液法，在发酵醪中加入产香微生物，己酸菌发酵液或将己酸发酵液经化学、生物法酯化后，再加到发酵醪中。这些提高酒中酯香物质含量的方法大多是从工艺水平上进行的，虽然酯含量有一定提高，但酒质与高档名酒相差仍很大，特别是化学药品的加入存在安全隐患。因此，要从根本上解决酿酒酵母的产酯能力还是需要利用分子生物学育种技术构建高产酯的酿酒酵母工业菌株。研究表明，乙酸酯类，如乙酸乙酯(溶剂类香气)和乙酸异戊酯(香蕉风味)，是酒中主要的风味活性酯。这些酯类的形成是在酵母代谢时在酵母内合成的，形成的酯一部分通过细胞扩散到发酵液中，一部分被酵母吸附，留在细胞体内。提高这些乙酸酯的含量不仅可以增进酒的酯香，同时能有效地扩张、松驰神经，可减少喝酒引起的副作用。参与乙酸酯合成的酶主要是醇乙酰基转移酶(AATase)，它可以催化醇和乙酰辅酶 A形成乙酸酯。该酶是一种巯基酶，有三种不同的类型AATase I、Lg-AATase I和AATase II，分别由ATFl、Lg-ATFl和ATF2编码。酿酒酵母只含有一个ATFl基因，而啤酒酵母除了含有ATFl基因外，还含有一个同源基因Lg-ATFl基因。而国内还没有醇乙酰基转移酶及其编码基因对白酒和黄酒风味和品质影响的相关研究。
发明内容
本发明的目的是解决酿酒酵母自身产酯能力较低的问题，提供一株含有Lg-ATFl 基因的酿酒酵母工程菌。本发明提供的含有Lg-ATFl基因的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工程菌，具体为EY-15，已于2011年12月22日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址中国北京市朝阳区大屯路甲3号，保藏号为CGMCC No 5636。所述的酿酒酵母工程菌，在其它发酵性能不受影响的情况下，模拟半固态发酵后， 转化子菌株与亲本菌株(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No 2. 1525)相比，乙酸乙酯含量提高I. 6倍，乙酸异戊酯的含量提高到26. 6mg/L。本发明所述含有Lg-ATFl基因的酿酒酵母工程菌的构建方法是I)将PGKl启动子和终止子与PUC19质粒连接得到pUC-PGKl ；2)将来源于酿酒酵母的同源片段IAH连接到第I)步得到的pUC-PGKl上，得到 pUC-PGKl-IAH ；
3)将啤酒酵母中编码醇乙酰基转移酶Lg-ATFl基因插入到第2)步得到的 pUC-PGKl-IAH 中 PGKl 启动子和终止子之间，得到 pUC-PGKl-IAH-Lg-ATFl ；4)将kan基因连接到第3)步得到的pUC-PGKl-IAH-Lg-ATFl上，得到质粒 pUC-PGKl-IAH-Lg-ATFl-kan (以下简称 pUC-PILgK)；5)将第4)步构建的过表达质粒pUC-PILgK用Bpull02I酶切，用醋酸锂转化法分别将其插入酿酒酵母a型和α型单倍体，得到同源重组后的酿酒酵母基因工程单倍体菌株;6)将纯化后的酿酒酵母a型和α型重组单倍体进行融合，通过抗性平板和生孢实验筛选得到含有Lg-ATFl基因的酿酒酵母工程菌(双倍体)。本发明同时提供了一种专门用于鉴定含有Lg-ATFl基因的酿酒酵母工程菌的基因序列，该基因序列是以Lg-U和Lg-D为引物，以所述含有Lg-ATFl基因的酿酒酵母工程菌菌株基因组为模板，扩增片段测序为一特异性序列，如序列表I所示。模拟半固态发酵将酵母菌接入5mL麦芽汁培养液中，30°C过夜培养12h ;将菌液全部转至20mL新鲜麦芽汁培养液中，30°C培养24h。取IOOg粳米置于25 30°C的水中， 浸溃72h ;取出后洗净，常压蒸煮30min。将米摊凉，投入500mL三角瓶中，加入IOg熟麦曲和105mL水。最后，接入25mL酵母麦芽汁培养液，28°C发酵5天。对发酵液进行分析，包括失重、酒度、残糖和GC测定香气成分含量。GC分析发酵液经蒸馏萃取后采用气相色谱法测定。内标物为乙酸正戊酯。气相色谱仪为 Agilent 7890C ;色谱柱 HPINNOWAX Polyethylene Glyco 260 °C 30mX320ymX0. 5μπι，配FID检测器。载气为高纯氮，流速2. OmL/min。起始柱温为52°C， 以2°C /min的升温速度升至70°C，再以4°C /min的升温速度升至90°C，最后以10°C /min 的升温速度升至200°C。检测器温度为250°C，进样口温度为230°C，进样量为l.OyL。分流方式为分流，分流比为25 I。本发明的优点和积极效果本发明选用强启动子PGKl将啤酒酵母中特有的编码醇乙酰基转移酶的Lg-ATFl 基因在酿酒酵母中过表达，得到含有Lg-ATFl基因的酿酒酵母工程菌Saccharomyces cerevisiae EY-15，保藏号为 CGMCC No 5636。本发明所获得的含有Lg-ATFI基因的酿酒酵母工程菌Saccjaromyces cerevisiae EY-15 (保藏号CGMCC No 5636)与初始的酿酒酵母菌(受:体菌Saccharomyces cerevisiae CGMCCNo 2. 1525)相比模拟半固态发酵后，乙酸乙酯含量提高I. 6倍，乙酸异戊酯的含量提高到26. 6mg/L，为酿酒工业生产提供了优良菌株。
图LpUC-PILgK质粒的验证电泳图。图2.阳性重组酿酒酵母单倍体的验证，其中(a)为a型阳性重组单倍体验证结果；(b)为α型阳性重组单倍体验证结果。图3.含有Lg-ATFl基因的酿酒酵母工程菌的构建路线图。本发明所述的一株含有Lg-ATFl基因的酿酒酵母工程菌(Saccharomyces cerevisiae)具体为EY-15，已于2011年12月22日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址为中国北京市朝阳区大屯路甲3号，保藏号为CGMCC No 5636。
具体实施例方式本发明所使用的酿酒酵母双倍体菌体是可以采用任何来源的酿酒酵母双倍体菌株。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例I :含有Lg-ATFl基因的酿酒酵母工程菌的构建(I)基因工程菌株的构建I)将PGKl启动子和终止子与PUC19质粒连接得到pUC-PGKl ；2)将来源于酿酒酵母的同源片段IAH连接到第I)步得到的pUC-PGKl上，得到 pUC-PGKl-IAH ；3)将啤酒酵母中编码醇乙酰基转移酶Lg-ATFl基因插入到第2)步得到的 pUC-PGKl-IAH 中 PGKl 启动子和终止子之间，得到 pUC-PGKl-IAH-Lg-ATFl ；4)将kan基因连接到第3)步得到的pUC-PGKl-IAH-Lg-ATFl上，得到质粒 pUC-PGKl-IAH-Lg-ATFl-kan (以下简称 pUC-PILgK)；图I为pUC-PILgK质粒的验证电泳图其中泳道I为5000 bp DNA Ladder Marker ； 泳道2为受体菌基因组PCR扩增同源片断IAH ;泳道3为pUC-PILgK质粒PCR扩增同源片断IAH ;泳道4为啤酒酵母基因组PCR扩增Lg-ATFl ;泳道5为pUC-PILgK质粒PCR扩增 Lg-ATFl ;泳道6为pUG6质粒PCR扩增Kan ;泳道7为pUC-PILgK质粒PCR扩增Kan ;泳道 8为pUC-PILgK质粒，PGKl上游引物+下游引物PCR扩增结果；泳道9为IKb DNALadder Marker ;泳道10为载体pUC19单酶切线性结果；泳道11为pUC-PILgK质粒单酶切线性结果O5) Bpu 11021 (Blp I)酶切质粒pUC-PILgK ;用醋酸锂转化法分别将其插入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No 2. 1525) a型和α型单倍体,得到同源重组后的酿酒酵母基因工程单倍体菌株。图2中(a)为a型阳性重组单倍体PCR验证结果；(b)为 α型阳性重组单倍体PCR验证结果。其中泳道I为5000bp DNALadder Marker，泳道2为受体菌a/ α型单倍体上游PCR阴性对照；泳道3为a/ α型重组单倍体上游PCR产物；泳道 4为受体菌a/ α型单倍体下游PCR阴性对照；泳道5为a/ α型重组单倍体下游PCR产物。6)将纯化后的酿酒酵母a型和α型重组单倍体进行融合，通过抗性平板和生孢实验筛选得到含有Lg-ATFl基因的酿酒酵母工程菌ΕΥ-15 (双倍体)。图3为含有Lg-ATFl 基因的酿酒酵母工程菌的构建过程。(2)基因工程菌株的特异性序列以上获得的基因工程菌株ΕΥ-15染色体中含有一段特异性序列，可通过PCR扩增测序后进行菌株鉴定。特异性片段扩增的引物序列为Lg-U :5’ -GGAGGAGACCGAACACAAGTATC-3，Lg-D :5，-TGGTTTGGAGGAGAAGATAACGACG-3’该特异性片段的基因序列见序列表I。
5
实施例2 :含Lg-ATFl基因的酿酒酵母工程菌与出发菌株发酵性能的研究将工程菌和受体菌分别接入5mL麦芽汁培养液中，30°C过夜培养12h ;将菌液全部转至20mL新鲜麦芽汁培养液中，30°C培养24h。取IOOg粳米置于25 30°C的水中，浸溃72h ;取出后洗净，常压蒸煮30min。将米摊凉，投入500mL三角瓶中，加入IOg熟麦曲和 105mL水。最后，接入25mL酵母麦芽汁培养液，28°C发酵5天。发酵期间每隔12h振荡并称重，记录失重；发酵结束后，停止培养并称重；测定发酵液的残糖浓度、酒精体积分数以及主要香气成分含量，以发酵能力、残糖浓度和产物生成量表征其综合性能，结果见表I。表I酿酒酵母受体菌和工程菌的发酵性能
项目CO2失重 (g)残糖含量 (g/100mL)酒精度 (v/v20°C)乙酸乙酯含量 (mg/L)乙酸异戊酯含量 (mg/L)受体菌28.50.8114.248.47—工程菌28.00.8414.177.2326.58注所示数据为三个平行试验结果的平均值。实施例3 :含有Lg-ATFl基因的工程单倍体与出发菌株单倍体发酵性能的研究将工程单倍体(a/ α型)和受体菌单倍体(a/ α型)分别接入5mL麦芽汁培养液中，30°C过夜培养12h ;将菌液全部转至20mL新鲜麦芽汁培养液中，30°C培养24h。取IOOg 粳米置于25 30°C的水中，浸溃72h ;取出后洗净，常压蒸煮30min。将米摊凉，投入500mL 三角瓶中，加入IOg熟麦曲和105mL水。最后，接入25mL酵母麦芽汁培养液，28°C发酵5天。 发酵期间每隔12h振荡并称重，记录失重；发酵结束后，停止培养并称重；测定发酵液的残糖浓度、酒精体积分数以及主要香气成分含量，以发酵能力、残糖浓度和产物生成量表征其综合性能，结果见表2。 表2酿酒酵母受体菌单倍体和工程单倍体的发酵性能
项目CO2失重 (g)残糖含量 (g/100mL)酒精度 (v/v20°C)乙酸乙酯含量 (mg/L)乙酸异戊酯含量 (mg/L)受体菌a型单倍体27.40.8513.842.05—工程菌a型单倍体27.80.8714.097.5432.49受体菌α型单倍体28.20.8214.248.60—工程菌(X型单倍体28.10.8614.271.3424.87 注所示数据为三个平行试验结果的平均值。
权利要求
1.一株含有Lg-ATFl基因的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工程菌，具体为 EY-15，保藏号为 CGMCC No 5636。
2.根据权利要求I所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，在其它发酵性能不受影响的情况下，模拟半固态发酵后，转化子菌株与亲本菌株(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No2. 1525)相比，乙酸乙酯含量提高I. 6倍，乙酸异戊酯的含量提高到26. 6mg/L0
全文摘要
一株含有Lg-ATF1基因的酿酒酵母工程菌。本发明提供的酿酒酵母工程菌，是选用强启动子PGK1将啤酒酵母中特有的编码醇乙酰基转移酶的Lg-ATF1基因在酿酒酵母中过表达，得到含有Lg-ATF1基因的酿酒酵母工程菌SaccharomycescerevisiaeEY-15，保藏号为CGMCC No.5636。该菌在其它发酵性能不受影响的情况下，转化子菌株与亲本菌株(SaccharomycescerevisiaeCGMCC No.1525)相比模拟半固态发酵后，乙酸乙酯含量提高1.6倍，乙酸异戊酯的含量提高到26.6mg/L；筛选得到的工程菌对发酵设备及条件没有特殊要求，一般酒厂的设备和条件均可使用，因而有广泛的应用前景，能为酒厂的工业化生产带来显著经济效益。
文档编号C12N15/04GK102604847SQ201210080040
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月23日 优先权日2012年3月23日
发明者张建炜, 张翠英, 戴隆海, 肖冬光, 郭学武 申请人:天津科技大学