Vkorc1基因的第-1639位碱基的多态性检测方法、以及用于该方法的核酸探针和试剂盒的制作方法

专利名称：Vkorc1基因的第-1639位碱基的多态性检测方法、以及用于该方法的核酸探针和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及VKORCl基因的第-1639位碱基的多态性检测方法、以及用于该方法的核酸探针和试剂盒。
背景技术：
对于心肌梗塞、脑梗塞患者，广泛使用华法林(warfarin)作为防止血液凝固的药物。华法林的适用量根据人种而有大的差异，进而，即便是相同人种，个体间也显示出差异。 若过量投与华法林，则有可能发生例如鼻出血、皮肤内出血，或者有时还会发生颅内出血等副作用。因此，在治疗中对各个患者分别确定华法林的适当用量变得极为重要。在确定这样的华法林的适用量值之际，近年来，有报道称CYP2C9基因和VKORCl 基因的多态性关系到华法林的药效(非专利文献1、幻。CYP2C9基因是编码用于制备华法林代谢酶的细胞色素P450的基因。VKORCl基因是编码作用于维生素K的蛋白质的基因， 该维生素K参与血液的凝固。因此，检测出这两种基因的多态性对于相应于患者来确定华法林的适用量、并减少副作用而言也是非常重要的。另外，作为VKORCl基因的多态性，已知 1173C > T(rs9934438)、-1639G > A(rs9923231)等。这些 VKORCl 基因的多态性记载于非专利文献3 5中。作为检测碱基的多态性的方法，有PCR-RFLP法(聚合酶链_限制性长度多态性分析)(非专利文献幻或利用焦磷酸测序(pyrosequencing)技术来检测突变的方法(非专利文献4)。然而，非专利文献3的PCR-RFLP法需要花费功夫和成本，例如在进行DNA的提取纯化和PCR后，需要对扩增产物进行限制酶处理、进行电泳等。另外，由于在进行PCR后需要进行扩增产物的处理，因此有扩增产物混入下一反应体系之虞，存在难以自动化、无法同时检测多个核酸序列的问题。非专利文献4的焦磷酸测序是基于如下原理的，即，通过将核苷酸被引入DNA时所释放的焦磷酸转变成ATP来用于发光反应，从而能够定量有多少核苷酸被引入DNA中。实际上，是通过每次加入一种脱氧核糖核苷酸测定发光量后将之除去并重复进行这种操作， 从而确定序列的。作为除去过剩核苷酸的方法，有固相化法，其将模板DNA结合到某些固相基质上，通过用反应液冲洗来除去过剩核苷酸；和液相法，其通过加入腺苷三磷酸双磷酶 (apyrase)来分解核苷酸。虽然有自动进行这些繁杂作业的系统在售，但价格非常昂贵，需要成本。另外，存在必须进行DNA的提取纯化、前处理等，需要花费功夫和成本的问题。另一方面，已知有通过PCR(聚合酶链反应)对包含突变的区域进行扩增后，使用荧光染料标记的核酸探针进行融解曲线分析，并基于融解曲线分析的结果来解析突变的方法(专利文献1、幻。然而，在这些文献中，关于探针的设计仅有如下教导，即，应将探针设计成当使末端部被荧光染料记的淬灭探针与目标核酸杂交时，在末端部，探针-核酸杂交体的多个碱基对至少形成一个G-C对(pair)。
专利文献3中记载有，使用5’末端荧光标记的探针，通过融解曲线分析来同时检测VKORCl 1173C > T (rs9934438)和CYP2C9*3的方法。但是，并没有记载检测 VK0RC1-1639G > A (rs9923231)的多态性的方法。另外，也没有记载同时检测VK0RC1-1639G > A(rs9923231)的多态性和CYP2C9*3突变位点的多态性的方法。现有技术文献专利文献专利文献1 日本特开2001-286300号公报专利文献2 日本特开2002-11拟91号公报专利文献3 国际公开公报W0/2008/117782非专利文献 1 :Simone Rost et al. , Nature Vol. 427 20041etters to nature2 :Mark J. Rieder et al. ， The New England Journal of Medicine 352 ；22，2005非专利文献3 :TDM 研究 Vol. 25 No. 4(2008) 141-144非专利文献4 :BL00D，1 SEPTEMBER 2007 VOLUME 110，NUMBER 5非专利文献5 =Genet Med. 2008 Feb ； 10 (2) :89-98发明内容。发明要解决的问题本发明的课题在于确立一种能有效地检测VK0RC1基因的第-1639位碱基的多态性的淬灭探针，并提供一种检测VK0RC1基因的第-1639位碱基的多态性的方法，以及用于该方法的试剂盒。用于解决问题的方案本发明人发现通过基于VK0RC1基因的包含第-1639位碱基的多态性的特定区域设计淬灭探针，并进行使用该淬灭探针的融解曲线分析，从而能够检测出该突变，至此完成了本发明。S卩，本发明如下所述。(1) 一种多态性检测用探针，其特征在于，其为用于检测VK0RC1基因的第-1639位碱基的多态性的探针，所述探针由寡核苷酸构成，该寡核苷酸为序列号1或序列号2所示的碱基序列中包含碱基序号80 89的10 50个碱基长度的碱基序列，该寡核苷酸除了对应于序列号1或序列号2中第80号碱基的碱基为胞嘧啶以外与序列号1或序列号2具有同源性，且对应于碱基序号80的碱基被荧光染料标记。(2)根据(1)所述的多态性检测用探针，所述寡核苷酸中，在从5’末端数起第1 3号位置具有被荧光染料标记的对应于碱基序号80的碱基。(3)根据(1)所述的多态性检测用探针，所述寡核苷酸在5’末端具有被荧光染料标记的对应于碱基序号80的碱基。(4)根据(1) C3)任一项所述的多态性检测用探针，所述寡核苷酸当未与目标序列杂交时发出荧光，且当与目标序列杂交时荧光强度减少或增加。(5)根据(4)所述的多态性检测用探针，所述寡核苷酸当未与目标序列杂交时发出荧光，且当与目标序列杂交时荧光强度减少。(6)根据⑴ (5)任一项所述的多态性检测用探针，所述寡核苷酸的碱基长度为10 40。 (7)根据⑴ (6)任一项臓的多态性检测用探针，臓寡核苷酸的藤长度为15 30。(8)根据⑴ (7)任一项腿的多态性检测用探针，腿寡核苷酸的 藤长度为15 25。(9)根据⑴ (8)任一项臓的多态性检测用探针，戶脑探针是融解曲线分析用的探针。(10)根据⑴ (9)任一项所述的多态性检测用探针，所述寡核苷酸以序列号6表示。(11) 一种多态性检测方法，其为使用(1) (10)任一项所述的多态性检测用探针来检测VKORCl基因附近区域的多态性的方法。(12)根据(11)所述的多态性检测方法，该方法包括(I)使(1) (10)任一项所述的多态性检测用探针和试样中的单链核酸接触，从而使所述荧光标记寡核苷酸和所述单链核酸进行杂交来获得杂交产物的步骤；(II)通过改变包含所述杂交产物的试样的温度，从而使所述杂交产物解离，并测定基于所述杂交产物的解离的、荧光信号的变动的步骤；(III)基于所述信号的变动来确定杂交产物的解离温度、即Tm值的步骤；以及(IV)基于所述Tm值，确定VKORCl基因中的多态性的存在或者具有多态性的核酸的存在比的步骤。(13)根据(12)所述的多态性检测方法，该方法还包括在所述步骤⑴之前或与所述步骤(I)同时进行核酸的扩增的步骤。(14) 一种判断华法林的适用量的方法，该方法包括通过(11) (13)任一项所述的多态性检测方法来检测VKORCl基因附近区域的多态性的步骤；以及，基于所检测出的多态性的有无来判断华法林的适用量的步骤。(15) 一种多态性检测用试剂盒，其包含(1) (10)任一项所述的多态性检测用探针。(16)根据(15)所述的多态性检测用试剂盒，还包含能够以序列号1所示碱基序列中包含所述寡核苷酸所杂交的序列的区域为模板进行扩增的引物。(17)根据(16)所述的多态性检测用试剂盒，所述引物是序列号3和4所记载的引物。(18)根据(16)或(17)所述的多态性检测用试剂盒，还包含序列号8、9所记载的引物和序列号10所记载的探针。另外，上述说明中，所谓VKORCl基因的多态性还包括该基因的附近区域的多态性。发明的效果通过在基因扩增体系中添加本发明的探针，在PCR反应结束后仅进行融解曲线分析(Tm解析)就能进行多个基因突变型的分型。进而，由于能够直接检查全血、口腔粘膜悬浮液，因此能够减少所花费的功夫、成本。本发明的探针特异性高，检测灵敏度高。通过使用本发明的方法，在进行PCR的情况下，也无需取出扩增产物，因此几乎不存在污染(contamination)的危险。另外，本发明的方法由于装置简单，因此容易自动化。通过本发明的方法，还能够同时检测VKORCl基因的第-1639位碱基的多态性和 CYP2C9*3突变位点的多态性。


图1示出了 实施例1的人基因组1和人基因组2 (纯化基因组)的Tm分析中，每单位时间的TAMRA(VK0RC1探针1)的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)的变化。纵轴为每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)，横轴为温度(°C )。图2示出了 实施例2的人基因组1和人基因组2 (全血)的Tm分析中，每单位时间的TAMRA(VK0RC1探针1)的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)的变化。纵轴为每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)，横轴为温度(°C )。图3示出了 比较例的人基因组1和人基因组2(纯化基因组)的Tm分析中，每单位时间的TAMRA(VK0RC1探针幻的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)的变化。纵轴为每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)，横轴为温度(°C )。图4示出了 实施例3的人基因组1和人基因组2 (纯化基因组)的Tm分析中，每单位时间的TAMRA(VK0RC1探针1)的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)的变化。纵轴为每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)，横轴为温度(°C )。图5示出了 实施例3的人基因组1和人基因组2 (纯化基因组)的Tm分析中，每单位时间的BODIPY FL(CYP2C9*3探针1)的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)的变化。纵轴为每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)，横轴为温度(V)。图6示出了 实施例4的人基因组1和人基因组2 (全血)的Tm分析中，每单位时间的TAMRA(VK0RC1探针1)的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)的变化。纵轴为每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)，横轴为温度(°C )。图7示出了 实施例4的人基因组1和人基因组2(全血)的Tm分析中，每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)的变化。纵轴为每单位时间的BODIPY FL(CYP2C9*3探针1)的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)，横轴为温度(°C )。
具体实施例方式<1>本发明探针和本发明检测方法本发明探针的特征在于，其为用于检测VKORCl基因的第-1639位碱基的多态性的探针，所述探针由寡核苷酸构成，该寡核苷酸为序列号1或序列号2所示的碱基序列中包含碱基序号80 89的10 50个碱基长度的碱基序列，该寡核苷酸除了对应于序列号1或序列号2中第80号碱基的碱基为胞嘧啶以外与序列号1或序列号2具有同源性，且对应于碱基序号80的碱基被荧光染料标记。此处，VKORCl基因的第-1639位碱基是序列号1和2 中的第88位碱基。本发明的探针，除了具有序列号1所示的碱基序列(VK0RC1基因的、第-1639位碱基具有野生型碱基的序列)或序列号2所示的碱基序列(VK0RC1基因的、第-1639位碱基具有突变型(多态性)碱基的序列)中上述特定的序列之外，与专利文献1、2中记载的淬灭探针同样地制造。另外，本发明的序列号1所示的序列是基因银行(GeneBank)的登录号NG_011564的第3501号到3680号。本发明探针的长度为10 50个碱基长度，优选为 10 40个碱基长度，更优选为15 30个碱基长度，最优选15 25个碱基长度。作为本发明中使用的探针的碱基序列的实例，可以举出5' -cattggccrggtgcggt-3'(序列号5)。序列中，“r”表示a或g。更优选为5' -cattggccaggtgcggt-3 ‘(序列号 6)。作为荧光染料，可以使用专利文献1、2中记载的荧光染料，作为具体实例，可以举出Pacific Blue (商标)、FAM(商标)、TAMRA(商标)、B0DIPY(商标)FL等。荧光染料向寡核苷酸结合的方法可以是通常的方法，例如可以按照专利文献1、2中记载的方法来进行。本申请中的“同源性”是指在特定的碱基序列中具有与碱基序列有80%以上、更优选90%以上、最优选95%以上同源性的序列的碱基序列。即，本发明的探针，是与序列号 1或序列号2所示碱基序列中包含碱基序号80 89的10 50个碱基长度的碱基序列相同的序列，还可以是并不完全相同，而仅有5个碱基、4个碱基、3个碱基、2个碱基或1个碱基不同。本发明的探针优选当其与目标序列杂交时，荧光染料的荧光减少或增加。本发明的探针优选为当其与目标序列杂交时，荧光染料的荧光淬灭的淬灭探针。另外，本发明的探针优选5’末端或3’末端被荧光染料标记。另外，本说明书中，“从5’末端数起第1 3号”的情况下，是将5’末端数为第一位；“从3’末端数起第1 3号”的情况下，是将3’末端数为第一位。如本实施例的表2所示，通过使用序列号6的寡核苷酸，能够检测VKORC 1基因的第-1639位碱基的多态性。本发明的检测方法的特征在于，其为对于VKORCl基因的具有第-1639位碱基的多态性位点的核酸，通过使用被荧光染料标记的核酸探针测定荧光染料的荧光来进行融解曲线分析，并基于融解曲线分析结果来检测多态性的方法，所述核酸探针是本发明的探针。本发明的检测方法除了对VKORC 1基因的包含第-1639位碱基的多态性位点的区域进行扩增、以及使用本发明探针以外，其他可以按照通常的核酸扩增和融解曲线分析(Tm 分析)方法来进行。本发明的检测方法的特征在于，优选使用本发明的探针，并包含以下步骤(I)向包含DNA的试样中添加本发明的探针，使所述探针杂交到所述DNA上的步骤；(II)通过改变温度而使所述DNA与所述探针的杂交产物解离，并测定基于杂交产物的解离的、荧光信号的变动的步骤；(III)对所述信号的变动进行解析，从而确定Tm值的步骤；以及(IV)由所述Tm值，确定目标多态性的有无或者具有多态性的碱基序列的存在比的步骤。本发明的检测方法，除了使用本发明探针以外，其他可以按照通常的核酸扩增和融解曲线分析(Tm分析)方法来进行。另外，本发明的检测方法还可以包括在所述步骤 (I)之前或与所述步骤(I)同时进行核酸的扩增的步骤。作为核酸扩增的方法，优选为使用聚合酶的方法，作为其实例，可以列举PCR、 ICAN(等温的和嵌合引物起始的核酸扩增)、LAMP(环介导恒温扩增)等。在通过使用聚合酶的方法来进行扩增的情况下，优选在本发明探针的存在下进行扩增。对于本领域技术人员来说，相应于所使用的探针而调节扩增反应条件等是容易实现的。由此，在核酸扩增后仅进行探针的Tm值解析，因此无需在反应结束后对扩增产物进行处理。因此，无需担心扩增产物导致的污染。另外，由于能用与扩增所需的机器同一机器来进行检测，因此甚至无需移动容器。因此，自动化也容易实现。在本发明中，试样中的DNA可以是单链DNA，也可以是双链DNA。在所述DNA为双链DNA的情况下，优选例如在进行前述杂交步骤之前，包含通过加热而将所述试样中的双链DNA解离的步骤。通过将双链DNA解离成单链DNA，在接下来的杂交步骤中能够与检测用探针杂交。在本发明中，本发明的探针相对于所述试样中的DNA的添加比例(摩尔比)不受限制，但从充分确保检测信号的角度考虑，优选相对于试样中的DNA为1倍以下，更优选为 0. 3倍以下。此时，所谓试样中的DNA是指例如，可以是发生了检测目标多态性的检测对象DNA和未发生所述多态性的非检测对象DNA的总计量，也可以是包含发生了检测目标多态性的检测对象序列的扩增产物和包含未发生所述多态性的非检测对象序列的扩增产物的总计量。另外，试样中的DNA中的前述检测对象DNA的含量通常是不清楚的，但从结果来看，优选前述探针的添加比例(摩尔比)相对于检测对象DNA (包含检测对象序列的扩增产物)为100倍以下，更有选为50倍以下，进一步优选为30倍以下。另外，其下限没有特别限制，例如为0. 001倍以上，优选为0. 01倍以上，更优选为0. 2倍以上。本发明的探针相对于前述DNA的添加比例，例如可以是相对于双链DNA的摩尔比， 也可以是相对于单链DNA的摩尔比。接下来，对于Tm值进行说明。当持续加热包含双链DNA的溶液，^Onm下的吸光度上升。其原因在于，双链DNA中的双链间的氢键通过加热而解开，解离成单链DNA(DNA的融解)的缘故。另外，如果全部双链DNA解离而成为单链DNA的话，其吸光度显示为开始加热时的吸光度(仅有双链DNA时的吸光度)的约1.5倍左右，由此可以判断解离完成。基于该现象，所谓融解温度Tm被定义为通常是吸光度达到吸光度总上升量的50%时的温度。本发明中，为了确定Tm值而进行的、伴随温度变化的信号变动的测定，也可以根据前述的原理来通过测定260nm的吸光度来进行。但，优选测定基于附加在本发明探针上的标记的信号的、相应于DNA与探针的杂交形成状态而变动的信号。因此，作为本发明的探针，优选使用前述标记探针。作为前述标记探针，例如可以列举当未与目标序列杂交时发出荧光、且当与目标序列杂交时荧光强度减少(淬灭)的荧光标记寡核苷酸探针；或者，当未与目标序列杂交时发出荧光、且当与目标序列杂交时荧光强度增加的荧光标记寡核苷酸探针。如果是前一种探针，则在与检测对象序列形成杂交体(双链DNA)时，不显示信号或信号弱；通过加热而探针游离的话，显示信号或信号增加。另外，如果是后一种探针，则通过与检测对象序列形成杂交体(双链DNA)而显示信号；通过加热而探针游离的话，信号减少 (消失)。因此，通过用信号特有的条件(吸光度等)来检测基于该标记的信号变化，能够与前述测定260nm的吸光度相同地，确定融解的进行状况和确定Tm值。标记探针中的标记物例如如前所述，优选为荧光染料标记探针。作为进行核酸扩增时成为模板的核酸，只要包含核酸即可，并没有特殊限定，是来源于或能够来源于血液、口腔粘膜悬浮液、指甲或毛发等的体细胞、生殖细胞、乳、腹水、石蜡包埋组织、胃液、胃洗涤液、腹膜液、羊水、细胞培养等任意生物学起源的核酸。成为模板的核酸，可以从该起源获得后原样直接使用，或为了改变该样品的特性而进行前处理后使用。
下面，以使用PCR的情况为例进一步说明。作为用于PCR的引物对，除了设计成能够扩增出本发明探针能杂交的区域以外，其他可与通常的PCR中的引物对的设定方法同样地设定。引物的长度和Tm值通常为12mer 40mer、40 70°C，优选为16mer 30mer、 55 60°C。引物对的各引物的长度也可不同，但优选两个引物的Tm大致相同(通常，相差 2°C以内)。另外，Tm值是通过最近邻碱基对(Nearest Neighbor)法算出的值。作为引物对的实例，可以列举由具有序列号3、4所示碱基序列的引物构成的引物对。PCR优选在本发明中使用的本发明探针的存在下进行。由此，在扩增反应结束后无需进行处理扩增产物的操作就可进行Tm分析。相应于所使用的探针而调节引物的Tm值、 PCR的反应条件，对于本领域技术人员来说是容易实现的。如列举代表性的PCR反应液的组成的话，如下所述。表 权利要求
1.一种多态性检测用探针，其特征在于，其为用于检测VKORCl基因的第-1639位碱基的多态性的探针，所述探针由寡核苷酸构成，该寡核苷酸为序列号1或序列号2所示的碱基序列中包含碱基序号80 89的10 50个碱基长度的碱基序列，该寡核苷酸除了对应于序列号1或序列号2中第80号碱基的碱基为胞嘧啶以外与序列号1或序列号2具有同源性，且对应于碱基序号80的碱基被荧光染料标记。
2.根据权利要求1所述的多态性检测用探针，所述寡核苷酸中，在从5’末端数起第 1 3号位置具有被荧光染料标记的对应于碱基序号80的碱基。
3.根据权利要求1所述的多态性检测用探针，所述寡核苷酸在5’末端具有被荧光染料标记的对应于碱基序号80的碱基。
4.根据权利要求1 3任一项所述的多态性检测用探针，所述寡核苷酸当未与目标序列杂交时发出荧光，且当与目标序列杂交时荧光强度减少或增加。
5.根据权利要求4所述的多态性检测用探针，所述寡核苷酸当未与目标序列杂交时发出荧光，且当与目标序列杂交时荧光强度减少。
6.根据权利要求1 5任一项所述的多态性检测用探针，所述寡核苷酸的碱基长度为 10 40。
7.根据权利要求1 6任一项所述的多态性检测用探针，所述寡核苷酸的碱基长度为 15 30。
8.根据权利要求1 7任一项所述的多态性检测用探针，所述寡核苷酸的碱基长度为 15 邪。
9.根据权利要求1 8任一项所述的多态性检测用探针，所述探针是融解曲线分析用的探针。
10.根据权利要求1 9任一项所述的多态性检测用探针，所述寡核苷酸以序列号6表7J\ ο
11.一种多态性检测方法，其为使用权利要求1 10任一项所述的多态性检测用探针来检测VKORCl基因附近区域的多态性的方法。
12.根据权利要求11所述的多态性检测方法，该方法包括(I)使权利要求1 10任一项所述的多态性检测用探针和试样中的单链核酸接触，从而使所述荧光标记寡核苷酸和所述单链核酸进行杂交来获得杂交产物的步骤；(II)通过改变包含所述杂交产物的试样的温度，从而使所述杂交产物解离，并测定基于所述杂交产物的解离的、荧光信号的变动的步骤；(III)基于所述信号的变动来确定杂交产物的解离温度、即Tm值的步骤；以及(IV)基于所述Tm值，确定VKORCl基因中的多态性的存在或者具有多态性的核酸的存在比的步骤。
13.根据权利要求12所述的多态性检测方法，该方法还包括在所述步骤(I)之前或与所述步骤(I)同时进行核酸的扩增的步骤。
14.一种判断华法林的适用量的方法，该方法包括通过权利要求11 13任一项所述的多态性检测方法来检测VKORCl基因附近区域的多态性的步骤；以及，基于所检测出的多态性的有无来判断华法林的适用量的步骤。
15.一种多态性检测用试剂盒，其包含权利要求1 10任一项所述的多态性检测用探针。
16.根据权利要求15所述的多态性检测用试剂盒，还包含能够以序列号1所示碱基序列中包含所述寡核苷酸所杂交的序列的区域为模板进行扩增的引物。
17.根据权利要求16所述的多态性检测用试剂盒，所述引物是序列号3和4所记载的引物。
18.根据权利要求16或17所述的多态性检测用试剂盒，还包含序列号8、9所记载的引物和序列号10所记载的探针。
全文摘要
[课题]确立一种能有效地检测VKORC1基因的第-1639位碱基的多态性的淬灭探针，并提供一种检测VKORC1基因的第-1639位碱基的多态性的方法，以及用于该方法的试剂盒。[解决手段]一种多态性检测用探针，其特征在于，其为用于检测VKORC1基因的第-1639位的多态性的探针，所述探针由寡核苷酸构成，该寡核苷酸为序列号1或序列号2所示的碱基序列中包含碱基序号80～89的10～50个碱基长度的碱基序列，该寡核苷酸除了对应于序列号1或序列号2中第80号碱基的碱基为胞嘧啶以外与序列号1或序列号2具有同源性，且对应于碱基序号80的碱基被荧光染料标记。
文档编号C12Q1/68GK102268476SQ20111014710
公开日2011年12月7日 申请日期2011年6月1日 优先权日2010年6月1日
发明者小森真理子 申请人:爱科来株式会社