专利名称：不含基因组dna的总rna制备方法
技术领域：
本发明涉及一种基于酚抽提的、纯化不含基因组DNA的总RNA的方法。
背景技术：
随着生命科学发展进入到后基因组时代，RNA表达模式的研究受到越来越多的重视。许多有关RNA的检测方法，如逆转录PCR(RT-PCR)，Northern印迹法，基因芯片以及高通量RNA测序技术也日趋广泛应用。获得高质量、完整且不含其它杂质的总RNA，是应用 RNA研究技术的前提。当前，提取RNA有很多种方法，主要归为两类。一类是以酚抽提为基础的方法。这类方法采用变性剂来裂解细胞以及抑制核酸酶，并使用酚抽提来分离核酸。 常用的变性剂包括硫氰酸胍(GuSCN)以及十二烷基硫酸钠(SDS)。硫氰酸胍被认为是最强的变性剂之一，可有效裂解细胞以及抑制核酸酶。P. Chomczynski和N. Sacchi提出的酸 ftiiltlSIII - - MilJ (Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiοcyanate-phenol-chloroform extraction, P. Chomczynski and N. Sacchi, Anal Biochem 1987,162 :156-159)法是目前常用的RNA抽提方法，其采用含有胍盐的裂解试剂裂解细胞，然后采用酚抽提去除蛋白质等杂质，再使用异丙醇或乙醇沉淀即可得到纯化的 RNA样品。此法以及由其发展而来的Trizol试剂，对提取RNA酶丰富的材料中的RNA取得了很大的成功。然而对于一些材料如大肠杆菌和脂肪组织，有报道称胍盐裂解的方法不能得到很好的结果。十二烷基硫酸钠是另一种常用的变性剂，其对于某些材料尤其是细菌，可以迅速裂解细胞并同时抑制RNA酶，结合酚抽提可获得较好的RNA样品。另一类方法采用固相吸附。现在很多基于硅胶柱的RNA纯化方法都属于这一类。这类纯化方法利用了在胍盐(硫氰酸胍、盐酸胍等)存在时，核酸可与硅胶膜材料结合的性质，使RNA结合在硅胶膜上；再使用含乙醇的洗涤液去除杂质；最后使用低盐溶液(如TE缓冲液)或蒸馏水洗脱纯化的RNA。但由于小分子量的RNA的在胍盐存在时与硅胶膜结合能力较差，这类方法对小分子量的RNA的回收效率较差。对于现有的方法还存在一个让研究者困扰的问题，即这些方法本身对于基因组 DNA的污染的去除能力较差。由于基因组DNA和RNA的理化性质非常类似，通常的RNA提取方法很难将它们彻底分离。例如，实验测得直接通过SDS-酚法提取得到的大肠杆菌总RNA 每微克样品约含IO7到IO8拷贝(40纳克到400纳克)的基因组DNA;酸性硫氰酸胍-酚-氯仿法提取得到的大肠杆菌总RNA每微克样品约含IO5拷贝GOO皮克)的基因组DNA。一般的硅胶柱法所得到的RNA每微克约含600皮克到200纳克的基因组DNA (Agilent公司技术文档)。然而，诸如RT-PCR以及基因芯片技术需要完全不含基因组DNA的RNA样品，以避免由于基因组DNA的可扩增性造成对结果的干扰。基因组DNA的去除可以通过DNA酶I (DNase I)的消化完成。然而用于去除RNA中的DNA所需的DNA酶要求非常高，需要完全不含RNA 酶的DNA酶(RNase-free DNase)，否则将导致RNA样品的降解，因此价格非常昂贵。DNA酶消化还大大增加了 RNA提取的时间。并且在消化过程中，很难实时监测并控制DNA消化的程度。对于不同批次的样品，酶消化程度的不同可能会造成结果的不确定性。因此，如能开发出一种能在纯化步骤中直接去除基因组DNA，而无需DNA酶消化的RNA纯化方法，对于提高RNA的研究的效率将是十分有益的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能在纯化步骤中直接去除基因组DNA，而无需DNA酶消化的总RNA制备方法。本发明解决技术问题的技术方案为不含基因组DNA的总RNA制备方法，包括以下步骤a)使用重悬液重悬需要提取的生物材料；b)加入与重悬液体积相同的十二烷基硫酸钠溶液，室温裂解3-5分钟，或65度裂解0. 5-1分钟；c)加入酸性醋酸钾溶液，离心，去除出现的沉淀，取上清，醋酸钾和十二烷基硫酸钠溶液摩尔比值为1 0.9-1.1;d)将C)步骤所得上清加入酸性醋酸钾溶液，硫氰酸胍贮液，使醋酸钾终浓度为 750mmol/L，硫氰酸胍为1. 5mol/L ；加入与上清、酸性醋酸钾溶液，硫氰酸胍贮液的总体积相等的酚抽提液，振荡混勻。此时可使基因组DNA被酚吸附，而绝大部分RNA进入水相，从而分离RNA和基因组DNA。离心，吸取水相，在水相中加入无水乙醇，混勻后，-20度静置10 分钟，离心，弃上清；e)将所得RNA沉淀用洗涤液洗涤两次，空气中晾干，然后加入适量的超纯水溶解， 即可。所述的重悬液为50士 lOmmol/L葡萄糖和10士2mmol/L乙二酸四乙酸钠(EDTA)的混合溶液。所述的生物材料为细菌菌体，菌体与重悬液的质量/体积比为20-50mg/100 μ L ；所述的十二烷基硫酸钠溶液液的重量浓度为为2士0. 2%。所述的酸性醋酸钾溶液包含3士0. 2mol/L醋酸钾和6. 5士0. 4mol/L醋酸，pH为 5. 0 士 0. 05。所述的硫氰酸胍贮液浓度为4. 5士0. lmol/L。所述酚抽提液为水饱和酚氯仿异戊醇的混合物，水饱和酚氯仿异戊醇体积比为125 24 1。所述的洗涤液为70士5%乙醇，50士5mmol/L醋酸钠，pH 5. 2士0.05。本发明采用十二烷基硫酸钠作为裂解试剂，裂解细胞后使用醋酸钾和十二烷基硫酸钠反应生成十二烷基硫酸钾(PDQ沉淀，同时共沉淀蛋白质以及大部分基因组DNA。然后利用在硫氰酸胍存在时核酸可被酚抽提液吸附，并且吸附的核酸可按分子量大小利用一定浓度醋酸钾解离的性质，在核酸中加入一定浓度的硫氰酸胍和酸性醋酸钾，采用酚抽提分离总RNA和残留的基因组DNA。最后采用乙醇沉淀得到总RNA样品。本发明关键在于硫氰酸胍和酸性醋酸钾的浓度和比例，醋酸钾的浓度过低，会使一些大分子的RNA不能被抽提，过高则可能会使基因组DNA的残留增加。在优化的条件下， 本法利与现有技术相比，所得RNA样品残留基因组DNA最少，每微克IO3拷贝(约4皮克)。
图1为实施例1中所抽提大肠杆菌不同菌株的总RNA。M =DNA Marker D ；泳道1_5， 从左向右分别为大肠杆菌菌株AB1157，AB2463, AB2480, UNC1085和DH5 α。图2为实施例2中实时定量PCR检测本法提取RNA样品以及其他方法所得RNA样品中残留基因组DNA的含量。图3为实施例3中半定量RT-PCR结果。模板从左向右分别为大肠杆菌菌株 ABl 157，ΑΒ2463, ΑΒ2480, UNC1085和DH5 α的总RNA。反应采用大肠杆菌phr和pgi基因的特异性引物。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作详细的说明。本实施例中酸性醋酸钾溶液为3mol/L醋酸钾和6. 5mol/L醋酸的混合溶液，pH为 5. 0。洗涤液为体积浓度70%乙醇，50mmol/L醋酸钠的混合溶液，pH 5. 2。实施例1a)挑取平板划线培养大肠杆菌菌株AB1157，AB2463，AB2480，UNC1085 *DH5a单菌落，至LB液体培养基，37度过夜振荡培养。离心收获菌液。1. 5mL菌液离心所得菌体用 100 μ L浓度为50mmol/L葡萄糖和lOmmol/L乙二酸四乙酸钠(EDTA)的混合溶液进行重悬。b)加入100 μ L重量浓度为2%十二烷基硫酸钠溶液液，室温裂解3分钟。c)加入2. 5 μ L酸性醋酸钾溶液。颠倒混勻，12000rpm离心10分钟去除出现的沉淀，取上清200 μ L。d)将c)步骤所得上清加入120 μ L酸性醋酸钾溶液，160 μ L浓度为4. 5mol/L硫氰酸胍贮液。加入480 μ L酚抽提液，振荡混勻。离心IOOOOrpm 5分钟使水相和酚相分离， 小心吸取水相。其中加入2倍体积乙醇，混勻后，-20度静置10分钟，12000rpm离心10分钟，弃上清，得到RNA沉淀。e)将d)步骤所得RNA沉淀用洗涤液洗涤两次，空气中10分钟晾干。加入50 μ L 的超纯水溶解。此即所得总RNA样品。如图1 所示AB1157，AB2463，AB2480，UNC1085 *DH5a 的三条带分别为 23S，16S 和5S核蛋白体RNA，mRNA为中部弥散带。无可见基因组DNA条带。实施例2 基因组DNA残留检测将e)步中所得总RNA样品1微克，以及酸性硫氰酸胍-酚-氯仿(AGPC)法和 SDS-酚法所得RNA样品，采用RNA酶处理后，采用基因组特异性引物扩增。根据与标准样品的域循环数的对比，可见本法所得样品残留基因组DNA最少，约每微克IO3拷贝(约4皮克)。采用AGPC法和SDS-酚法所得样品残留基因组DNA分别约为每微克IO5拷贝和IO7拷贝(见图2)。实施例3 RNA扩增能力检测取e)步中所得总RNA样品1微克，作为模板，使用AMV逆转录酶进行逆转录。逆转录所得cDNA作为模板进行半定量PCR反应。所用引物为大肠杆菌phr和pgi基因的特异性引物。其中Pgi基因为大肠杆菌管家基因，编码磷酸葡萄糖异构酶；Phr基因编码大肠杆菌DNA光修复酶。结果可见各菌株中phr基因表达量均低于pgi基因，大约在40%-60% 左右(见图幻，两基因表达量可见明显差异，而在各菌株中的比值无明显差异。对照实验采用各菌株基因组DNA扩增，证明了不同基因的表达差异性，同时确认了本法所提总RNA的可扩增性。
权利要求
1.不含基因组DNA的总RNA制备方法，包括以下步骤a)使用重悬液重悬需要提取的生物材料；b)加入与重悬液体积相同的十二烷基硫酸钠溶液，室温裂解3-5分钟，或65度裂解 0. 5-1分钟；c)加入酸性醋酸钾溶液，离心，去除出现的沉淀，取上清，醋酸钾和十二烷基硫酸钠溶液摩尔比值为1 0.9-1. 1 ；d)将c)步骤所得上清加入酸性醋酸钾溶液，硫氰酸胍贮液，使醋酸钾终浓度为 750mmol/L，硫氰酸胍为1. 5mol/L ；加入与上清、酸性醋酸钾溶液，硫氰酸胍贮液的总体积相等的酚抽提液，振荡混勻，离心，吸取水相，在水相中加入无水乙醇，混勻后，"20度静置 10分钟，离心，弃上清；e)将所得RNA沉淀用洗涤液洗涤两次，空气中晾干，然后加入超纯水溶解，即可。
2.根据权利要求1所述的不含基因组DNA的总RNA制备方法，其特征在于所述的重悬液为50士 lOmmol/L葡萄糖和10士2mmol/L乙二酸四乙酸钠(EDTA)的混合溶液。
3.根据权利要求1所述的不含基因组DNA的总RNA制备方法，其特征在于所述的生物材料为细菌菌体，菌体与重悬液的质量/体积比为20-50mg/100 μ L。
4.根据权利要求1所述的不含基因组DNA的总RNA制备方法，其特征在于所述的十二烷基硫酸钠溶液液的重量浓度为为2士0. 2%。
5.根据权利要求1所述的不含基因组DNA的总RNA制备方法，其特征在于所述的酸性醋酸钾溶液包含3士0. 2mol/L醋酸钾和6. 5士0. 4mol/L醋酸，pH为5. 0士0. 05。
6.根据权利要求1所述的不含基因组DNA的总RNA制备方法，其特征在于所述的硫氰酸胍贮液浓度为4. 5士0. lmol/L。
7.根据权利要求1所述的不含基因组DNA的总RNA制备方法，其特征在于所述酚抽提液为水饱和酚氯仿异戊醇的混合物，水饱和酚氯仿异戊醇体积比为125 24 1。
8.根据权利要求1所述的不含基因组DNA的总RNA制备方法，其特征在于所述的洗涤液为 70士5% 乙醇，50士5mmol/L 醋酸钠，pH 5. 2士0.05。
全文摘要
本发明公开了不含基因组DNA的总RNA制备方法，采用十二烷基硫酸钠作为裂解试剂，裂解细胞后使用醋酸钾和十二烷基硫酸钠反应生成十二烷基硫酸钾(PDS)沉淀，同时共沉淀蛋白质以及大部分基因组DNA。然后利用在硫氰酸胍存在时核酸可被酚抽提液吸附，并且吸附的核酸可按分子量大小利用一定浓度醋酸钾解离的性质，在核酸中加入一定浓度的硫氰酸胍和酸性醋酸钾，采用酚抽提分离总RNA和残留的基因组DNA。最后采用乙醇沉淀得到总RNA样品。本法利与现有技术相比，所得RNA样品残留基因组DNA最少，每微克103拷贝(约4皮克)。
文档编号C12N15/10GK102286459SQ201110146840
公开日2011年12月21日 申请日期2011年6月2日 优先权日2011年6月2日
发明者凌烈锋, 吕俊, 宋平, 徐蕾, 徐雷雷, 曹正宇, 朱国萍, 王鹏, 裴云云, 靳明明 申请人:安徽师范大学