专利名称：猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程标记弱毒疫苗株及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程标记弱毒疫苗株及应用。
背景技术：
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是目前严重危害养猪业的传染病之一，该病是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome Virus,PRRSV)白勺，临怀孕母猪发生流产、早产和死胎等严重的繁殖障碍以及仔猪和育肥猪表现明显的呼吸障碍等症状。至今为止，PRRS仍在全球大部分地区流行，是猪主要的传染病之一。2006年5月以来，我国暴发了由美洲型变异株引起的高致病性猪繁殖与呼吸综合征，给我国的养猪业造成很大经济损失。同以前流行的毒株相比较，这次流行的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的致病力明显增强，在其非结构蛋白Nsp2中的482位和534 562 位分别存在一个特征性1+ 个氨基酸缺失。PRRSV的Nsp2蛋白是一种特殊的非结构蛋白， 具有半胱氨酸蛋白酶活性，众多研究证明Nsp2蛋白中间区及PL2区附近在各毒株之间存在明显的突变、插入或者删除现象。通过反向遗传操作发现Nsp2在病毒的复制过程中起到重要作用。虽然有研究证实其毒力增强与该毒株的Nsp2特征性缺失30个氨基酸无关，但是目前对该病毒毒力增强的原因仍然尚不清楚。疫苗免疫仍然是预防和控制该病的重要手段，目前在市场上商品化的灭活疫苗与弱毒疫苗均有使用，相比较而言，针对高致病性猪繁殖与呼吸综合征的预防和控制来说弱毒活疫苗的效果更为明显，我国现有的几个针对高致病性猪繁殖与呼吸综合征的弱毒疫苗，都是将强毒株在细胞上经过体外连续传代至弱获得的，如高致病性猪繁殖与呼吸综合征HuN4-F112弱毒疫苗，目前这些疫苗已经在高致病性PRRSV的防控中发挥了重要作用。尽管如此，现有弱毒疫苗在使用过程中仍存在不能有效区分自然感染和疫苗免疫动物这一重要问题，这对于将来更加有效控制和净化高致病PRRSV带来严重阻碍，因此有必要研制能够达到鉴别诊断目的的新型基因工程标记弱毒疫苗。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程标记弱毒疫苗株，该疫苗株能有效区分自然感染野毒株与疫苗免疫毒株的动物。此外，还需要提供一种上述基因工程标记弱毒疫苗株的应用。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现在本发明的一个方面，提供了一种重组猪繁殖与呼吸综合征病毒，包含猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuM-Fl 12的基因组核酸，所述HuM-Fl 12基因组在编码猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2蛋白的基因区域内包含一个缺失或突变，所述缺失选自
(1)编码Nsp2蛋白第480-532位氨基酸的核苷酸序列的缺失；(2)编码Nsp2蛋白第508-532位氨基酸的核苷酸序列的缺失；所述突变选自(a)在(1)所述的缺失区域插入编码新城疫病毒NP蛋白的核苷酸序列；(b)在( 所述的缺失区域插入编码新城疫病毒NP蛋白的核苷酸序列。优选的，所述缺失区域插入的核苷酸序列是编码新城疫病毒NP蛋白C末端49个氨基酸的核苷酸序列(SEQ ID NO. 19)。优选的，所述HUN4-F112基因组还包含标记性的MluI限制性内切酶位点。更优选的，Nsp2基因在缺失编码第480-532位氨基酸(Δ 52氨基酸)的核苷酸序列之后，其基因序列如SEQ ID NO. 1所示；Nsp2基因在缺失编码第508-532位氨基酸(Δ 25 氨基酸)的核苷酸序列之后，其基因序列如SEQ ID NO. 2所示。更优选的，Nsp2基因在其Δ 52氨基酸缺失区域插入编码新城疫病毒NP蛋白C末端49个氨基酸的核苷酸序列之后，其基因序列如SEQ ID NO. 3所示；Nsp2基因在其Δ 25氨基酸缺失区域插入编码新城疫病毒NP蛋白C末端49个氨基酸的核苷酸序列之后，其基因序列如SEQ ID NO. 4所示。在本发明的另一方面，提供了一种核酸分子，包含猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HUN4-F112的基因组多核苷酸序列，该多核苷酸序列在编码猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2蛋白的基因区域内包含一个缺失或突变，所述缺失选自(1)编码Nsp2蛋白第480-532位氨基酸的核苷酸序列的缺失；(2)编码Nsp2蛋白第508-532位氨基酸的核苷酸序列的缺失；所述突变选自
(a)在(1)所述的缺失区域插入编码新城疫病毒NP蛋白的核苷酸序列；(b)在( 所述的缺失区域插入编码新城疫病毒NP蛋白的核苷酸序列。在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述核酸分子的重组载体。在本发明的另一方面，还提供了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株，包含猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuM-Fl 12的基因组核酸，所述HuM-Fl 12基因组在编码猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2蛋白的基因区域内包含一个突变，该突变是在编码 Nsp2蛋白第480-532位氨基酸的核苷酸序列的缺失区域，插入编码新城疫病毒NP蛋白的核苷酸序列；或在编码Nsp2蛋白第508-532位氨基酸的核苷酸序列的缺失区域，插入编码新城疫病毒NP蛋白的核苷酸序列。优选的，所述缺失区域插入的核苷酸序列是编码新城疫病毒NP蛋白C末端49个氨基酸的核苷酸序列(SEQ ID N0. 19)。在本发明的另一方面，还提供了一种上述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒在制备预防或治疗高致病性猪繁殖与呼吸综合征的疫苗中的应用。在本发明的另一方面，还提供了一种上述猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株在制备预防或治疗高致病性猪繁殖与呼吸综合征的疫苗中的应用。在本发明的另一方面，还提供了一种区分上述猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株与自然感染毒株的检测方法，包括以下步骤
5
利用表达的新城疫病毒NP蛋白作为检测抗原，建立ELISA抗体检测方法，用该方法检测免疫动物针对NP49蛋白产生的抗体，以区分出具有基因工程标记的弱毒疫苗株与自然感染毒株。本发明猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程标记弱毒疫苗株，在免疫猪体后可有效诱导机体产生免疫应答，对免疫猪抵抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的致死性攻击提供100%的免疫保护率，安全可靠，而且本发明的基因工程标记弱毒疫苗株，能有效区分猪繁殖与呼吸综合征自然感染猪和猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫猪，满足临床上对高致病性 PRRSV疫苗免疫毒株与自然感染毒株的鉴别诊断，非常有利于高致病性PRRSV的预防和控制。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。图1是本发明拯救不同基因缺失和插入标记的感染性克隆毒株的RT-PCR检测结果图；图2是本发明基因缺失与基因标记感染性克隆毒感染Macr-145细胞后的细胞病变图；图3是本发明救获的不同基因缺失和插入标记的感染性克隆毒株遗传稳定性序列分析图；图4是本发明利用抗PRRSV N蛋白单抗对基因缺失与插入标记的感染性克隆毒株进行间接免疫荧光鉴定结果图；图5是本发明不同感染性克隆毒株与亲本毒HUN4-F112株生长曲线比较图；图6是本发明实施例3基因工程标记弱毒疫苗株免疫猪ELISA检测PRRSV抗体水平变化图；图7是本发明实施例3利用间接ELISA方法检测免疫猪抗NP49蛋白抗体鉴别免疫猪与自然强毒感染猪的柱状图；图8是本发明实施例3利用RT-PCR结合MluI酶切鉴别免疫猪与自然强毒感染猪的电泳图；图9是本发明实施例3基因工程标记弱毒疫苗株攻毒后死亡保护率统计结果图。
具体实施例方式下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙的译.北京 科学出版社，2004)中所述的方法进行。由于目前的猪繁殖与呼吸综合征病毒的弱毒疫苗存在不能有效区分自然感染和疫苗免疫动物的问题，有必要利用新的技术研制PRRS新型疫苗。本实验室几年前分离到一株高致病性PRRSV毒株HuN4，与经典的美洲型毒株VR-2332序列相比在Nsp2基因的第 483位和535 563位氨基酸发生缺失，是一株典型的PRRSV强毒变异株。通过将高致病性PRRSV强毒HuM株体外传代致弱获得的减毒活疫苗株HuM-Fl 12，由大量临床实验证实所获得的HuN4-F112弱毒疫苗株具有很好的免疫保护力，实验组动物可以抵抗致死性强毒攻击而不出现高致病PRRS的临床症状(专利号为200810097546. 8的中国发明专利)。正是在此基础上，本发明利用猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4-F112疫苗株基因组全长cDNA克隆pSK-HuN4-F112，通过突变PCR等技术构建了两个Nsp2基因的稳定缺失区域的突变体感染性克隆，即(1ΗΝ4-Δ52和(1ΗΜ-Δ25，同时在上述两个缺失区域内分别插入抗原性比较强的新城疫病毒NP蛋白的表位(C末端49个氨基酸)作为标记基因，并成功获得了能够稳定遗传的基因工程标记弱毒疫苗毒株，即rHN4- Δ 52+ΝΡ49和rHN4_ Δ 25+ΝΡ49，通过实验证实所获得的上述具有遗传标记的感染性克隆毒株可以作为基因工程标记弱毒疫苗应用于对高致病性猪繁殖与呼吸综合征的防治。实施例1猪繁殖与呼吸综合征病毒基因缺失毒株的构建及鉴定1.材料与方法1. 1病毒、载体与试剂PRRSV疫苗株HuM-Fl 12由本实验室传代致弱并保存、感染性克隆载体 pSK-Hun4-F112 由本实验室构建并保存(童光志等 2007 ；Tong GZ et al.，2007 ；Zhou YJ et al.，2008 ；TianZJ et al.，2009)，RNeasy Plus Mini Kit 试剂盒购自 QIAGEN ；胶回收试剂盒购自上海华舜生物科技有限公司；SupersciptIII reverse transcriptase和platinum pfx DNA polymerase 购自 Invitrogen ;RNase H, T4DNA 连接酶、限制性内切酶购自 NEB 公司；DL-15000，DL-2000DNA Marker购自TakaRa ；其它化学试剂均是进口或国产分析纯。1.2引物设计根据PRRSV HuM 株(GenBank 登录号EF635006)Nsp2 基因序列，用 Olio 6. 0 软件设计了 2对引物F Δ 52/R Δ 52与R Δ 25/F Δ 25 (见表1)，其中引物涵盖了进行缺失突变的
基因区域。表lNsp2基因突变引物名称及序列
权利要求
1.一种重组猪繁殖与呼吸综合征病毒，其特征在于，包含猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112的基因组核酸，所述HuM-Fl 12基因组在编码猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2蛋白的基因区域内包含一个缺失或突变，所述缺失选自(1)编码Nsp2蛋白第480-532位氨基酸的核苷酸序列的缺失；(2)编码Nsp2蛋白第508-532位氨基酸的核苷酸序列的缺失；所述突变选自(a)在(1)所述的缺失区域插入编码新城疫病毒NP蛋白的核苷酸序列；(b)在( 所述的缺失区域插入编码新城疫病毒NP蛋白的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒，其特征在于，所述缺失区域插入的核苷酸序列是编码新城疫病毒NP蛋白C末端49个氨基酸的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒，其特征在于，所述HuN4-F112 基因组还包含标记性的MluI限制性内切酶位点。
4.一种核酸分子，其特征在于，包含猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112 的基因组多核苷酸序列，该多核苷酸序列在编码猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2蛋白的基因区域内包含一个缺失或突变，所述缺失选自(1)编码Nsp2蛋白第480-532位氨基酸的核苷酸序列的缺失；(2)编码Nsp2蛋白第508-532位氨基酸的核苷酸序列的缺失；所述突变选自(a)在(1)所述的缺失区域插入编码新城疫病毒NP蛋白的核苷酸序列；(b)在( 所述的缺失区域插入编码新城疫病毒NP蛋白的核苷酸序列。
5.一种包含权利要求4所述核酸分子的重组载体。
6.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株，其特征在于，包含猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuM-Fl 12的基因组核酸，所述HuM-Fl 12基因组在编码猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2蛋白的基因区域内包含一个突变，该突变是在编码Nsp2蛋白第480-532 位氨基酸的核苷酸序列的缺失区域，插入编码新城疫病毒NP蛋白的核苷酸序列；或在编码 Nsp2蛋白第508-532位氨基酸的核苷酸序列的缺失区域，插入编码新城疫病毒NP蛋白的核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株，其特征在于，所述缺失区域插入的核苷酸序列是编码新城疫病毒NP蛋白C末端49个氨基酸的核苷酸序列。
8.权利要求1所述的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒在制备预防或治疗高致病性猪繁殖与呼吸综合征的疫苗中的应用。
9.权利要求6所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株在制备预防或治疗高致病性猪繁殖与呼吸综合征的疫苗中的应用。
10.一种区分权利要求6所述猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株与自然感染毒株的检测方法，其特征在于，包括以下步骤利用表达的新城疫病毒NP蛋白作为检测抗原，建立ELISA抗体检测方法，用该方法检测免疫动物针对NP49蛋白产生的抗体，以区分出具有基因工程标记的弱毒疫苗株与自然感染毒株。
全文摘要
本发明公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程标记弱毒疫苗株，该疫苗株包含猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112的基因组核酸，所述HuN4-F112基因组在编码Nsp2蛋白的基因区域内包含一个突变，该突变是在编码Nsp2蛋白第480-532位氨基酸的核苷酸序列的缺失区域，插入编码新城疫病毒NP蛋白的核苷酸序列；或在编码Nsp2蛋白第508-532位氨基酸的核苷酸序列的缺失区域，插入编码新城疫病毒NP蛋白的核苷酸序列。本发明还公开了一种上述基因工程标记弱毒疫苗株的应用。本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程标记弱毒疫苗株，不仅在免疫猪体后能对猪抵抗高致病性PRRSV提供完全的安全免疫保护，而且能在血清学和病原学上有效区分猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫猪与野毒自然感染猪。
文档编号C12N15/63GK102250843SQ20111014682
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月1日 优先权日2011年6月1日
发明者周艳君, 张善瑞, 徐彦召, 童光志 申请人:中国农业科学院上海兽医研究所