专利名称：表达gp64基因的新型基因工程重组病毒的构建方法
技术领域：
本发明属于生物杀虫剂的遗传改良领域，具体涉及一种在杆状病毒组II核多角体病毒(group II NPV)中表达组I核多角体病毒(group I NPV)的囊膜糖蛋白基因的构建方法。该表达组I核多角体病毒(group I NPV)毒株由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中科院微生物研究所，100101)。保藏日期是2011年6月24日，保藏号为CGMCC No :4976。
背景技术：
杆状病毒的天然宿主大部分是农林业的害虫。1973年，杆状病毒被联合国粮农组织和世界卫生组织推荐为化学农药的理想替代品。目前，我国已有6种杆状病毒杀虫剂正式登记注册。杆状病毒对宿主昆虫具有专一而强烈的致病性，能够在环境中长期存活，对人、畜及其他脊椎动物安全无害，不污染环境，是理想的“生物农药”。然而，杆状病毒杀虫速度较慢、杀虫谱窄，严重阻碍其大规模应用。在杆状病毒出牙型病毒粒子(BV)囊膜的表面，存在许多由糖蛋白组成的刺突状结构，它们在介导病毒与受体结合，膜融合及出芽等过程发挥关键作用。group I NPV BV的主要囊膜糖蛋白为GP64，group II NPV BV的主要囊膜糖蛋白是F蛋白。GP64和F蛋白均是低PH诱导的膜融合蛋白。研究表明，GP64比F蛋白具有更强大的膜融合能力，而含有GP64的group I代表株AcMNPV与含F蛋白的group 11代表株HearNPV相比，具有更广的宿主域和更高的杀虫活性。上述杆状病毒组II核多角体病毒(group II NPV)中表达组I核多角体病毒(group I NPV)囊膜糖蛋白甜似基因的序列表在文章末尾。该序列表摘自NCBI数据库(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/gene/1403961, Gene ID 为1403961)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种表达甜似基因的新型基因工程重组病毒的构建方法，该方法操作简单，所构建的重组病毒具有生物安全性，其在农业的害虫防治方面具有广泛的应用前景。本发明解决其技术问题采用以下的技术方案
本发明提供的表达甜似基因的新型基因工程重组病毒是在组II核多角体病毒的基因组中表达AcMNPV GP64，其中AcMNPV是苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒Auto耵aphacalifornica multiplenucleopolyhedrovirus 的英文缩写，GP64 是 AcMNPV 的囊膜糖蛋白。本发明通过对野生型棉铃虫核多角体病毒Wico^rpa armigera singlenucleopolyhedrovirus,简称为HearNPV进行基因工程遗传改良后得到。具体改良方法是在HearNPV bacmid HaBacHz8的多角体蛋白基因、polh )位点，插入由AcMNPV
基因启动子pPIO及冷杉毒蛾核多角体病毒Orgyia pseudotsugata multiplenucleopolyhedrovirus,简称为OpMNPV的囊膜糖蛋白基因启动子p0pl66共同启动的AcMNPV的gp64基因，以及由AcMNPV多角体蛋白基因启动子pAcPoIh和HearNPV多角体蛋白基因启动子pHaPolh共同启动的HearNPV多角体蛋白基因，由此得到重组病毒。重组病毒所表达的外源基因为AcMNPV的囊膜糖蛋白基因甜似以及与AcMNPVGP64氨基酸一致性达到75%以上的同源基因，或者基因突变修饰的衍生基因。本发明提供的上述AcMNPV GP64，其在改良基因组不含有^764的杆状病毒的杀虫活性方面的用途。本发明提供的表达甜似基因的新型基因工程重组病毒的构建方法，其包括以下步骤
(1)重组bacmid^a&ac-gp64~polh的构建将含有由AcMNPV 基因启动子pPIO及OpMNPV Op 166基因启动子p0pl66共同控制的AcMNPV gp64基因，以及由AcMNPV polh基因启动子PAcPolh和HearNPV卯炀基因启动子pHaPolh共同控制的HearNPV 炀基因的供体质粒pFB-0p 166-^764-/70从，通过电转化至大肠杆菌DHlOB感受态细胞(该DH10B感受态细胞中含有野生型棉铃虫核多角体病毒HearNPV bacmid HaBacHz8以及编码转座酶的helper质粒的)中，然后通过转座的方法获得重组bacmid ^s&^-gp64-polh ；
(2)转染-感染实验将脑ac-gp64-polhDNA 以及 Lipofectin (Invitrogen 公司)分别用无血清Grace培养基稀释，充分混勻后转染5 X IO5个HzAMl细胞；转染6天后收集培养物上清，用其感染一批健康的HzAMl细胞以扩增BV，感染6天后收集含感染性BV的上清，置于4 ° C避光保存，感染的细胞样品存放于-20 ° C保存；
(3)病毒多角体的扩增将重组病毒的BV注射至棉铃虫四龄幼虫的血淋巴中，置于观C培养，直至虫体液化，收集虫尸；用Vortex将液化的虫尸震碎，通过差速离心的方法获
取较纯的多角体，对多角体进行计数后保存于4 C备用；
经过上述步骤，得到表达gp64基因的新型基因工程重组病毒^\aRac-gP64-Polh。该病毒的分类命名为棉铃虫核多角体病%Qklicoverpa armigera singlenuclearpolyhedrosis virus)。在步骤(2)中，是通过将5 μ g 脑ac-gp64-polh DNA 以及 12 μ 1 Lipofectinanvitrogen公司)分别用无血清Grace培养基稀释至100 μ 1，充分混勻后转染5 X IO5个HzAMl细胞。在步骤(3)中，是将10 μ 1的重组病毒的BV注射至棉铃虫四龄幼虫的血淋巴中，置于观 C培养，直至虫体液化，收集虫尸。所表达的外源基因为AcMNPV gp64以及与AcMNPV GP64氨基酸一致性达到75%以上的同源基因，或者基因突变修饰的甜似衍生基因。本发明提供的上述构建方法所制备的重组病毒，其在改良基因组不含有的杆状病毒的杀虫活性方面的用途。本发明和现有技术相比具有以下主要的优点其一.不需要对病毒基因组进行复杂的基因操作。本方法采用Bac-to-Bac重组系统，与传统的同源重组手段相比，可以快速简便的插入外源活性基因。其二.杀虫活性提高。经生物测定显示，重组病毒的杀虫活性明显提高。重组病毒的LC5tl平均值为1. 6 X IO4 PIBs/ml，仅为野生型病毒的20%当用3 X IO6 PIBs/ml感染时，重组病毒的ST5tl为90小时，比对照病毒缩短8个小时广8%);而用更低浓度3 X IO5 PIBs/ml感染时，重组病毒的ST50为98小时，比对照病毒缩短16个小时广14%)。其三.生物安全性高。构建重组病毒过程中，采用的是杆状病毒内源性杀虫活性基因AcMNPV甜似基因，避免外源毒素基因的引入，故具有生物安全性。
图1是重组病毒N\ia&ac-gp64-polh的结构示意图。图2是重组病毒嚇aC-gP64-Polh的转染实验图。白色箭头表示核内有多角体聚集的HzAMl细胞。图3是重组病毒偏aC-gP64-Polh的感染实验图。白色箭头表示核内有多角体聚集的HzAMl细胞。图4是重组病毒BV的Wfestern blot检测图。M表示蛋白分子量标准；1表示Y^3&ac-egfp~polh 的 BV ;2 表示 N\\a&ac-gp64~polh 的 BV。图5是重组病毒vHaBac-a^^-po炀和对照病毒^aMc-egfP-Polh感染3龄棉铃虫的浓度-死亡率曲线。图6是浓度为3 X IO6 PIBs/ml重组病毒^\a&ac-gP64-Polh和对照病毒NWa&ac-egfp-polh感染3龄棉铃虫的时间-死亡率曲线。图7是浓度为3 X IO5 PIBs/ml重组病毒^\a&ac-gP64-Polh和对照病毒NWa&ac-egfp-polh感染3龄棉铃虫的时间-死亡率曲线。
具体实施例方式本发明涉及一种利用Bac-to-Bac系统对基因组不含有的杆状病毒进行基因工程遗传改良的方法。该方法包括重组病毒的构建，重组病毒多角体的扩增和重组病毒的生物测定。构建策略为在棉铃虫核多角体病毒HearNPV bacmid (HaBacHz8)的多角体蛋白基因bo从)位点，插入由苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcMNPV)/77i 基因启动子及冷杉毒蛾核多角体病毒(OpMNPV)的囊膜糖蛋白W66)基因启动子共同控制的(AcMNPV)的囊膜糖蛋白基因即甜似基因，以及在AcMNPV多角体蛋白基因启动子和HearNPV多角体蛋白基因启动子共同控制下的HearNPV多角体蛋白基因，构建了一株共表达GP64和F蛋白两种囊膜糖蛋白的重组棉铃虫核多角体病毒。通过对3龄初的棉铃虫幼虫进行生物测定发现重组病毒的LC5tl平均值为1. 6 X IO4 PIBs/ml，仅为野生型病毒的20%，重组病毒的ST5tl比对照病毒缩短8% 14%。本发明比野生型病毒具有更好的杀虫活性，且具有很高的生物安全性。下面结合实施例及附图对本发明作进一步说明。实施例1.共表达两种囊膜糖蛋白的基因工程重组病毒的构建1.重组bacmid的构建
将pFB-0pl66-a^4-/7o炀质粒电转化至大肠杆菌DHlOB (HaBacHz8 + helper)感受态细胞中，涂布至LB固体培养基平板，于37 ° C倒置培养M 48小时。挑取白色单菌落，接入5ml LB培养基，37 ° C过夜培养。培养物于12，000 rpm离心1 min收集菌体，按照Bac-to-Bac mannual (Invitrogen)il^d^abacmid 白勺_@^&DNA。^( 100 ng bacmidDNA为模板，分别以载体上的M13F、M13R和片段上的gp64_For引物进行PCR鉴定，鉴定正确的重组bacmid命名为HaBac-a^^-po炀(图1)。2.转染-感染实验
将5 X IO5个HzAMl细胞接种至35 mm的小皿中，于观 C培养过夜。将5 μ gWa&ac-gp64-polh DNA 以及 12 μ 1 Lipofectin Gnvitrogen 公司)分别用无血清 Grace，s培养基稀释至100 μ 1，充分混勻后转染HzAMl细胞，具体方法参考Bac-to-Bac说明书anvitrogen公司)。在转染后96小时，可以观察到HzAMl细胞出现因杆状病毒感染所导致的核膨大特征，在核内有多角体聚集(图2)。在转染6天后收集转染的细胞上清，感染一批健康的约1 X IO7个HzAMl细胞以扩增BV，在96小时后发现大部分细胞被感染，并伴有多角体的形成(图3)。感染6天后收集含感染性BV的上清，置于4 ° C避光保存，感染的细胞样品存放于-20 ° C保存。3.重组病毒多角体的扩增
分别将10 μ 1的重组病毒的BV注射至棉铃虫四龄虫的血淋巴中，置于观 C培养，直至虫体液化，收集虫尸。用Vortex将液化的虫尸震碎，通过差速离心的方法获取较纯的多角体。具体操作步骤为虫尸于500 rpm离心5 min收集上清，再用5，000 rpm离心10min，弃去上清收集含多角体的沉淀。在经过2轮的差速离心后，将含有多角体的沉淀悬于PBS中，加入0.01% SDS于37 ° C孵育半个小时，然后再用差速离心法进行纯化，直至获得较纯的多角体。最后，用PBS洗涤三遍去除SDS，对多角体进行计数后保存于4 C备用。实施例2.共表达GP64和F蛋白两种囊膜糖蛋白的重组病毒在降低对棉铃虫幼虫施用剂量中的应用
采用液滴饲喂法测定重组病毒的半数致死浓度LC5tlt5选取大小均一的、二龄末棉铃虫幼虫，置于无菌的96孔板中于观 C饥饿过夜，以获取龄期均一的、三龄初的幼虫。用PBS (含10%的蔗糖，1 mg/ml的食品染料)分别将重组病毒vWa&ac-卯64-polh和对照病毒vHaBac-￡^//7-/7o从的多角体稀释成 3 X IO6 PIBs/mlU X 106PIBs/ml、3 X IO5 PIBs/ml U X IO5 PIBs/ml、3 X IO4 PIBs/mlU X IO4 PIBs/ml、3 X IO3 PIBs/mlU X IO3PIBs/ml的一系列浓度梯度的悬液。将稀释后的多角体悬液饲喂饥饿后的棉铃虫幼虫，将中肠变为蓝色的幼虫转入含有新鲜人工饲料的M孔板中，于观 C培养。期间每隔M小时观察感染幼虫的死亡情况，直至所有的供试幼虫液化死亡或者化蛹。实验重复两次。根据病毒的浓度值和对应的死亡率绘制浓度-死亡率曲线。在较低剂量时，重组病毒^a&ac-gP64-Polh的致死率明显高于对照病毒(图4)。进一步用ftObit回归分析计算各病毒的LC5tl及其标准回归斜率。根据95% CL数值是否包括1来判定是否具有显著性差异，即若95% CL数值包括1则不具有显著性差异，反之则有显著性差异。统计分析表明，两次实验重复中LC5tl测定结果的95% CL均不包含1，说明vHaBac-e^f/ -/^从和、憾aC-gP64-Polh 两种病毒的LC5tl之间存在显著性差异(表1 )。通过计算得出，对照病毒的LC5tl平均值为7. 9 X IO4 PIBs/ml，而重组病毒的LC5tl平均值为1.6 X IO4 PIBs/ml,仅为野生型病毒的20%，LC50的测定结果表明重组病毒的杀虫施用剂量上显著降低。实施例3.共表达GP64和F蛋白两种囊膜糖蛋白的重组病毒在降低对棉铃虫幼虫杀虫时间中的应用根据实施例2中LC5tl的测定值，选取3 X 106PIBs/ml、3 X IO5 PIBs/ml两个浓度的病毒多角体悬液，用液滴饲喂法感染三龄初棉铃虫幼虫，分别进行半数存活时间ST5tl的测定。期间每隔4小时观察感染幼虫的死亡情况，直至所有供试幼虫死亡或者化蛹。实验重复两次。根据感染时间和幼虫死亡率绘制时间-死亡率曲线。当用3 X IO6 PIBs/ml感染棉铃虫幼虫时，重组病毒^\aRac-gP64-Polh比对照病毒更快达到100%的死亡率(图6)，而当用较低浓度3 X IO5 PIBs/ml感染棉铃虫幼虫时，重组病毒vHaBac-a^^-po从在感染后110小时即达到了 100%的死亡率，对照病毒直到1 小时后，仍未达到100%的死亡率(图7)。进一步用Ifeplan-Meier生存分析计算各病毒的ST5tl及其标准误，比较各病毒ST5tl之间的差异显著性。当用3 X IO6 PIBs/ml感染时，重组病毒vHaBac-甜似炀的ST5tl为90小时，比对照病毒缩短8个小时广8%)(表2)；而当用更低浓度3 X IO5 PIBs/ml感染时，N\\a&ac-gp64-polh的ST5tl为98小时，比对照病毒快16个小时( 14%)(表3)。统计学分析表明使用两种不同浓度进行感染时，两种病毒的ST5tl之间均存在显著性差异(P < 0.01)(表2，表3)，表明重组病毒的杀虫速度显著缩短，并且重组病毒在较低浓度即可达到100%的致死率。ST5tl的测定结果表明重组病毒的杀虫速度显著提高，且杀虫施用剂量也有显著降低。 附表
表1 ^\a&ac-gP64-Polh和vHaBac-￡^//7-/70炀感染3龄棉铃虫的浓度-死亡关系
权利要求
1.一种表达甜似基因的新型基因工程重组病毒，其特征是在组II核多角体病毒的基因组中表达AcMNPV GP64，其中AcMNPV是苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒Auto耵aphacalifornica multiplenucleopolyhedrovirus 的英文缩写，GP64 是 AcMNPV 的囊膜糖蛋白。
2.根据权利要求1所述的表达基因的新型基因工程重组病毒，其特征是通过对野生型棉铃虫核多角体病毒Zfe^ZicorerjDa armigera single nucleopolyhedrovirus，简禾尔为HearNPV进行基因工程遗传改良后得到，具体改良方法是在HearNPV bacmid HaBacHz8的多角体蛋白基因Po从位点，插入由AcMNPV plO基因启动子pPIO及冷杉毒蛾核多角体病: Orgyia pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus,简称为 OpMNPV 白勺囊膜糖蛋白基因启动子P0pl66共同启动的AcMNPV的甜似基因，以及由AcMNPV多角体蛋白基因启动子pAcPolh和HearNPV多角体蛋白基因启动子pHaPolh共同启动的HearNPV多角体蛋白基因，由此得到所述的重组病毒。
3.根据权利要求2所述的表达甜似基因的新型基因工程重组病毒，其特征是表达AcMNPV的囊膜糖蛋白基因以及与GP64氨基酸一致性达到75%以上的同源基因，或者基因突变修饰的gp64衍生基因。
4.一种权利要求1至3中任一权利要求所述的表达基因的新型基因工程重组病毒，其特征是所述AcMNPV GP64在改良基因组不含有的杆状病毒的杀虫活性方面的用途。
5.一种表达基因的新型基因工程重组病毒的构建方法，其特征是该方法包括以下步骤(1)重组bacmid^a&ac-gp64~polh的构建将含有由AcMNPV 基因启动子pPIO及OpMNPV Op 166基因启动子p0pl66共同控制的AcMNPV gp64基因，以及由AcMNPV polh基因启动子PAcPolh和HearNPV卯炀基因启动子pHaPolh共同控制的HearNPV 炀基因的供体质粒pFB-0p 166-^764-/70从，通过电转化至大肠杆菌DHlOB感受态细胞中，该DHlOB感受态细胞中含有野生型棉铃虫核多角体病毒HearNPV bacmid HaBacHz8以及编码转座酶的helper质粒，然后通过转座的方法获得重组kicmid ^a&ac-gp64-polh ；(2)转染-感染实验将^a&ac-gP64-P0lhDNA以及转染介质Lipofectin分别用无血清Grace培养基稀释，充分混勻后转染5 X IO5个HzAMl细胞；转染6天后收集培养物上清，用其感染一批健康的HzAMl细胞以扩增BV，感染6天后收集含感染性BV的上清，置于4° C避光保存，感染的细胞样品存放于-20 ° C保存；(3)病毒多角体的扩增将重组病毒的BV注射至棉铃虫四龄幼虫的血淋巴中，置于观C培养，直至虫体液化，收集虫尸；用Vortex将液化的虫尸震碎，通过差速离心的方法获取较纯的多角体，对多角体进行计数后保存于4 C备用；经过上述步骤，得到表达gp64基因的新型基因工程重组病毒^\aRac-gP64-Polh。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征是步骤(2)中，是通过将5yg脑ac-gp64-polh DNA以及12 μ 1 Lipofectin分别用无血清Grace培养基稀释至100μ 1，充分混勻后转染5 X IO5个HzAMl细胞。
7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征是步骤(3)中，是将10μ 1的重组病毒的BV注射至棉铃虫四龄幼虫的血淋巴中，置于观 C培养，直至虫体液化，收集虫尸。
8.根据权利要求5所述的构建方法，其特征是AcMNPVgp64以及与GP64氨基酸一致性达到75%以上的同源基因，或者基因突变修饰的甜似衍生基因。
9. 一种权利要求5至8中任一权利要求所述的构建方法，其特征是AcMNPV GP64在改良基因组不含有的杆状病毒的杀虫活性方面的用途。
全文摘要
本发明是利用Bac-to-Bac系统对基因组不含有gp64的杆状病毒进行基因工程遗传改良的方法，其包括重组病毒的构建，重组病毒多角体的扩增和重组病毒的生物测定；构建策略为在棉铃虫核多角体病毒HearNPVbacmid的多角体蛋白基因位点，插入由苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒基因启动子及冷杉毒蛾核多角体病毒的囊膜糖蛋白基因启动子共同控制的gp64基因，以及在AcMNPV多角体蛋白基因启动子和HearNPV多角体蛋白基因启动子共同控制下的HearNPV多角体蛋白基因，构建了一株共表达GP64和F蛋白两种囊膜糖蛋白的重组棉铃虫核多角体病毒。本发明比野生型病毒具有更好的杀虫活性，且有很高的生物安全性。
文档编号C12N7/01GK102382803SQ201110349720
公开日2012年3月21日 申请日期2011年11月8日 优先权日2011年11月8日
发明者干盈盈, 王华林, 王曼丽, 胡志红, 邓菲 申请人:中国科学院武汉病毒研究所