专利名称：一株新型广谱抗临床和植物致病真菌的芽孢杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种新型广谱抑制临床和植物致病真菌的细菌菌株Bacillus sp.AH-E-1及其应用。更具体地说,是涉及一种具有广谱抗真菌功能的新型生防细菌和益生菌。
背景技术：
人类真菌感染一般分为两大类:浅部真菌感染和深部真菌感染。浅部真菌感染通常是由各种皮肤癣菌引起，主要侵犯皮肤、毛发、指甲等；而深部感染通常由白色念珠菌、新生隐球菌、粗球孢子菌等引起，主要侵犯内脏器官和深部组织，危害性很大，常可危及生命。近年来，随着广谱抗菌药物和免疫抑制药的大量使用，以及肿瘤化疗、器官移植和艾滋病的出现，产生免疫抑制的个体不断增多，使真菌感染的发病率呈上升趋势，耐药现象增多，真菌感染日益引起人们关注。据世界卫生组织(WHO) 2004年统计估计，全球每年的系统性真菌感染人数为33.5万。其中最常见的是系统性念珠菌病，约占所有此类感染的70%左右，而其引起的死亡率又高达40%左右。同样，真菌病害也一直是危害植物生长、影响作物产量的主要病害，如何有效地防治真菌病害一直是育种学家们努力攻克的难题。据统计，抗真菌药物在全球抗感染药市场中排列第三位，总销售额约为40亿-42亿美元，来自辉瑞公司的一份资料显示，近20年来，深部真菌感染呈持续增多趋势。面对临床的迫切需要，抗真菌药的进步似乎差强人意。目前，临床上应用的抗真菌药仍然以化学药物为主，如氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、卡泊芬净、特比萘芬等，而我国真菌感染的广谱治疗依赖于两性霉素及其脂质体、5-氟胞嘧啶、氟康唑和伊曲康哇。但严重的毒性作用如肾脏损害限制了两性霉素的使用，5-氟胞嘧啶亦存在毒副作用及耐药问题，氟康唑和伊曲康唑尽管相对安全些，但在应用中亦出现耐药现象及天然耐药菌株，另外，氟康唑虽为WHO推荐的深度真菌感染首选用药，对白色念珠菌和新生隐球菌效果最好，但对克柔念珠菌和光滑念珠菌效果差，对曲菌无效。新研发的卡泊芬净、米卡芬净等作用于细胞壁的新型抗生素具有高选择性、安全性高、耐药少见等明显优势，是念珠菌感染和曲霉感染的首选治疗方案，但由于其价格昂贵，专利保护期很长，因此也限制了其在我国临床中的应用，另外，该药对隐球菌无效。因此，我国迫切需要研制一种具有自主知识产权的、高效、广谱、低毒安全的新型抗真菌药物。芽胞杆菌是一类好氧、能产芽胞的革兰氏阳性杆状细菌，在自然界中分布非常广泛，生理特性丰富多样，是土壤和植物微生态的优势种群。由于它能产生脂肽抗生素、细胞壁降解酶类、细菌素和其它抗菌蛋白及挥发性抗菌物质，对某些植物病原真菌或细菌、甚至某些动物病原菌、病毒、支原体、肿瘤细胞均表现出一定的抑制作用，再加上这类细菌通过发酵可以大规模获得，产生的芽孢对高热、极酸、紫外线具有很强的耐受力，因此，近几年来成为国内外的研究热点，已报道的能抑制真菌生长的芽孢杆菌主要包括枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、苏云金芽孢 杆菌(B.thuriniensis)、腊状芽孢杆菌(B.cereus)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloloquefaci)等。然而，这些芽孢杆菌主要针对植物丝状致病真菌具有明显的效果，对于人类浅部真菌和深部真菌病原体，却未见抗真菌效果研究和报道。
发明内容
本发明的目的是提供一株可以广谱抑制临床和植物致病真菌的新型细菌菌株Bacillus sp.AH-E-1,其分类属于芽孢杆菌。本发明的目的是提供制备Bacillus sp.AH-E-1抗真菌物质的方法，其特征在于:发酵培养基为土豆液体培养基，培养基组成为(g/U:鲜土豆，500g ;葡萄糖,20g ;pH自然。本发明公开了 Bacillus sp.AH-E-1抑制的临床致病真菌种类，它至少包括以下20种丝状真菌和酵母菌:黄曲霉、烟曲霉、须癣毛癣菌、裴氏着色真菌、构巢曲霉、黑曲霉、卡氏分枝孢子菌、申克孢子丝菌、紧密着色真菌、红色毛癣菌、犬小孢子菌、总状毛霉、杂色曲霉、疣状着色真菌、热 带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑假丝酵母、克柔念珠菌、近平念珠菌、新生隐珠菌。本发明公开了 Bacillus sp.AH_E_1抑制的植物致病真菌的种类，它至少包括以下13种丝状真菌:葡萄球座菌、花生茎点霉、马尔可夫叶点霉、稻瘟病菌、葡枝根霉、苹果黑腐皮壳菌、弯孢菌、棉花炭疽、禾谷镰孢、葡萄座腔菌、辣椒疫霉、茄链格孢、禾谷丝核菌。本发明所述的细菌菌株Bacillus 8口.么11-￡-1,其特征在于:1^(3；[11118 sp.AH-E-1产生的抗真菌物质具有较好的热稳定性，在100°c下作用5分钟后仍保持明显的抑真菌活性。本发明所述的细菌菌株Bacillus sp.AH_E_1,其特征在于:pH值(2_11)不影响Bacillus sp.AH-E-1产生的抗真菌物质活性。本发明具有以下优点:抑真菌谱广；抑菌效果明显；发酵培养基简单。
图1为Bacillus sp.AH-E-1在光学显微镜下得形态图。(A)菌体；⑶芽孢。图2 为 Bacillus sp.AH-E-1 的 16S rDNA 的系统发育树。图3为Bacillus sp.AH-E-1与不同真菌28 °C下共培养5_7天后的菌丝形态(X400)。(A)对照组:构巢曲霉(A1)，犬小孢子菌(A2)，烟曲霉(A3)，紧密着色真菌(A4)，红色毛癣菌(A5)；(B)实验组:构巢曲霉(B1)，犬小孢子菌(B2)，烟曲雾(B3)，紧密着色真菌(B4)，红色毛癣菌(B5)。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明所涉及的广谱抑真菌新型细菌菌株Bacillussp.AH-E-1做进一步描述。实施例1:细菌的鉴定分别采用形态学方法、传统生理生化方法和16s rRNA基因测序方法对Bacillussp.AH-E-1进行鉴定。
(I)形态学观察将Bacillus sp.AH-E-1在营养琼脂平板上划线，37°C培养24小时后观察菌落形态，可以看到:菌落圆形，白色，表面干燥，边缘不光滑。挑取单菌落染色后，镜检观察菌体形态，可以看到(图1):菌株为革兰氏阳性，具芽孢，芽孢为椭圆或柱型，不明显膨大，芽孢近中生，菌体两端圆。(2)生理生化鉴定以蜡样芽孢杆菌(CGMCC1.229)、枯草芽孢杆菌(CGMCC1.892)、短小芽孢杆菌(CGMCC1.894)、解淀粉芽孢杆菌(CGMCC 1.1099)、苏云金芽孢杆菌(CGMCC 1.785)、地衣芽孢杆菌(CGMCC 1.813)为对照，参考《伯杰氏细菌系统分类手册》和《一般细菌常用鉴定方法》进一步做生理生化鉴定。结果表明，Bacillus sp.AH-E-1的生理生化反应不同于其它标准株(表I)。利用Biolog仪器对其进一步鉴定，结果表明，该菌为未知菌。表I芽孢杆菌属生理生化鉴定结果
权利要求
1.株可以广谱抑制临床和植物致病真菌的新型细菌菌株Bacillus sp.AH-E-1，其分类属于芽孢杆菌。
2.一种采用权利要求1所述菌株制备抗真菌物质的方法，其特征在于:发酵培养基为土豆液体培养基，培养基组成为(g/L):鲜土豆,500g ;葡萄糖,20g ;pH自然。
3.根据权利要求1所述的细菌菌株，其特征在于:抑制的临床致病真菌至少包括以下20种丝状真菌和酵母菌:黄曲霉、烟曲霉、须癣毛癣菌、裴氏着色真菌、构巢曲霉、黑曲霉、卡氏分枝孢子菌、申克孢子丝菌、紧密着色真菌、红色毛癣菌、犬小孢子菌、总状毛霉、杂色曲霉、疣状着色真菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑假丝酵母、克柔念珠菌、近平念珠菌、新生隐珠菌。
4.根据权利要求1所述的细菌菌株，其特征在于:抑制的植物致病真菌至少包括以下13种丝状真菌:葡萄球座菌、花生茎点霉、马尔可夫叶点霉、稻瘟病菌、葡枝根霉、苹果黑腐皮壳菌、弯孢菌、棉花炭疽、禾谷镰孢、葡萄座腔菌、辣椒疫霉、茄链格孢、禾谷丝核菌。
5.根据权利要求1所述的细菌菌株Bacillus8卩.六11-￡-1,其特征在于:1^(3；[11118sp.AH-E-1产生的抗真菌物质具有较好的热稳定性，在100°C下作用5分钟后仍保持明显的抑真菌活性。
6.根据权利要求1所述的细菌菌株BaciIIussp.AH-E-1，其特征在于:pH值(2_11)不影响其产生的抗真菌物质 活性。
全文摘要
本发明涉及一种广谱抑制临床和植物致病真菌的新型细菌菌株Bacillus sp.AH-E-1及其应用。其主要内容包括(1)Bacillus sp.AH-E-1为一新发现的芽孢杆菌菌株或亚种；(2)Bacillus sp.AH-E-1在适宜条件下进行发酵生产抗真菌物质；(3)Bacillus sp.AH-E-1可以明显抑制黄曲霉、烟曲霉、红色毛癣菌、须癣毛癣菌、光滑念珠菌、新生隐珠菌等20种临床致病真菌；(4)Bacillus sp.AH-E-1可以明显抑制葡萄球座菌、稻瘟病菌、葡枝根霉等13种植物致病真菌。本发明提供了一种优良的新型抗真菌物质生产菌株，具有抑真菌谱广、作用效果明显等优点。
文档编号C12N1/20GK103087939SQ20111034926
公开日2013年5月8日 申请日期2011年11月8日 优先权日2011年11月8日
发明者金敏, 李君文, 陈娜, 邱志刚, 谌志强, 陈照立, 王新为 申请人:中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所