一株广谱、高效拮抗植物病原真菌和卵菌的胶状溶杆菌oh17的分离鉴定的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物领域，具体涉及一株对植物病原真菌和卵菌具有拮抗活性的细 菌菌株的分离鉴定。 (二）
【背景技术】
[0002] 由病原真菌引起的病害，约占植物病害的70~80%，是影响我国农业产量、质量 和效益的主要障碍之一。生产上防治真菌病害一般多采用化学农药进行保护性防治，然而， 化学农药残留带来的食品质量安全问题和生态安全问题已成为社会各界关注的焦点。
[0003] 开发生态安全、环境友好型的生物农药是解决上述问题的有效途径之一。目前应 用的生物农药主要是微生物农药和农用抗生素两类，前者主要以微生物的活体为有效成 份，后者以微生物的次生代谢产物为有效成份。这两类生物农药的开发均取决于具有生防 潜力的微生物资源的鉴定和挖掘。
[0004] 溶杆菌（Lysobacterspp.)属于黄单胞科、溶杆菌属。截止2014年7月，国际上 已鉴定的溶杆菌属细菌有32个种，其中产酶溶杆菌（Lysobacterenzymogenes)、产抗生素 溶杆菌（Lysobacterantibioticus)、胶状溶杆菌（Lysobactergummosus)和变棕溶杆菌 (Lysobacterbrunescens)四个种具有高效抗菌活性和植物病害生防潜力，是一类新型植 物病害生防细菌。这类细菌对植物病原真菌、卵菌、革兰氏阴性细菌（G)、阳性细菌（G+)和 线虫都有显著的拮抗作用，其作用机理为：（1)产生小分子抗菌次生代谢物质；（2)分泌产 生大量胞外酶，包括几丁质酶、0-1，3_葡聚糖、蛋白酶和纤维素酶；（3)诱导植物产生抗病 性；(4)较好的定殖能力。
[0005] 综上所述，分离鉴定新型具有重要生防潜力的溶杆菌菌株，对于生防溶杆菌资源 库构建，以及新型、高效和广谱生物农药（农用抗生素）开发具有重要意义。 (三）
【发明内容】
[0006] 本发明利用稀释涂布的方法，以酿酒酵母作为靶标菌，从作物根际土壤筛选到一 株对真菌和卵菌具有拮抗活性的细菌菌株0H17,经形态学、16SrDNA等方法鉴定为胶状溶 杆菌（Lysobactergummosus)。该菌株对测试的多种植物病原真菌和卵菌具有较强的诘抗 活性。
[0007] 本发明提供的细菌菌株0H17,已于2013年12月27日保藏在位于北京市朝阳区 北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心（简称CGMCC)，保藏号为CGMCCNo. 8649,分类命名为胶状溶杆菌Lysobacter gummosus〇 (四）【附图说明】
[0008] 图1 0H17在不同培养基上的菌落形态
[0009] 图2 0H17的电镜观察图片
[0010] 图3 0H17对病原真菌和卵菌的拮抗效果图
[0011]图 4 0H17 的 16SrDNAPCR电泳图
[0012] 图5 0H17的系统发育树 (五）【具体实施方式】
[0013] 以下通过具体实施对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。
[0014] 1材料和方法
[0015] 1.1试验菌株、培养基
[0016] 试验菌株：酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)、水稻稻痕病菌（Magnaporthe grisea)、小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、棉花黄萎病菌（Verticilliumdahliae)、水稻纹枯病菌（Rhizoctorzia solani)、梨黑斑病菌（Alternariaalternata)、梨炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides)、梨轮纹病菌（Botryosphaeriaberengeriana)、番前早疫病菌 (Alternariasolani)、前病镜抱菌（Fusariumsolani)、水稻恶苗病菌（Fusarium moniliforme)、辣椒疫霉病菌（Phytophthoracapsici)、瓜果腐霉病菌（Pythium aphanidermatum)〇
[0017] 培养基：
[0018]NA培养基：牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，Yeastextractlg，鹿糖10g，蒸馏水1L， pH7. 2,固体培养基分装后另加琼脂1. 5g/100mL。
[0019] 10%TSA:胰蛋白胨大豆肉汤培养基（Tryptic-Soytone-Broth_Medium)3g，蒸馏 水1L，分装后另加琼脂1. 88g/100mL。
[0020] TSA:胰蛋白胨大豆肉汤培养基（Tryptic-Soytone-Broth-Medium) 30g，蒸馏水 1L，分装后另加琼脂1. 88g/100mL。
[0021] LB:Tryptone10g，NaCl10g，YeastExtract5g/L，加入水溶解，最后定容至 1L， 调节pH= 7. 0-7. 2,分装后，LB固体培养基另加琼脂粉1. 5g/100mL。
[0022] 1. 2根际土壤细菌的分离
[0023] 取作物根际土样10份，将采集的土样经2mm土壤筛过筛，称取10g于装有90mL无 菌水的三角瓶中，加适量抗生素，摇床振荡30min后10倍梯度稀释5次。吸取稀释液100y1 于LB平板上涂布，每个稀释度重复涂布于3块平板，28°C培养2天。稀释度以每个平板上 菌落数100-300个为宜，挑取不同类型的菌落于LB平板进行纯化，纯化3次后-70°C保存。
[0024] 1. 3拮抗细菌对病原真菌和卵菌的拮抗活性测定
[0025] 挑取0H17单菌落在LB液体培养基中培养24_48h，获得0D_= 1. 0的细菌菌液。 采用平板对峙法，在PDA平板中央放置供试的真菌或卵菌菌丝块。吸取3y1拮抗细菌菌液 滴于平板四周，三次重复，28°C倒置培养至出现明显拮抗效果，观察并拍照。
[0026] 1. 4拮抗细菌菌株的鉴定
[0027] 1. 4. 1菌落形态观察与电镜观察
[0028]菌落形态：取0H17菌液3y1分别点于10%TSA、TSA、NA、LB培养基中央，28°C培 养2-4d，观察形态。在NA培养基上，菌落淡黄色，菌体表面圆润有光泽，表面突出；在LB上 生长缓慢，菌落始终为黄色；在10%TSA上，菌落白色，表面平坦；在TSA不生长。
[0029] 电镜观察：
[0030] (1)将0H17划线于LB培养基（菌龄不能过大），在菌落生长新鲜处，用少量灭菌 水，冲洗菌落，并轻轻晃动培养皿，使灭菌水在新鲜菌落周围反复冲洗，配制成菌悬液。
[0031] (2)在石蜡板上滴加1~2滴新鲜的PTA负染液。
[0032] (4)取新的铜网片吸附菌悬液，置于干净的滤纸上晾干。
[0033] (5)待铜网片上的菌悬液七八成干时，将铜网片吸附菌悬液的一面接触负染液，漂 浮染色15s(时间过长则染色颜色深）。
[0034] (6)从负染液中取出铜网片，用滤纸吸干多余的负染液，日光灯下烤45s，使其干 燥。
[0035] (7)将制作好的样品，放置于透射电镜日立H-650中，在80千伏下观察细胞形态。
[0036] 0H17呈现杆状，无鞭毛。
[0037] 1. 4. 2 16SrDNA鉴定
[0038] 利用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒提取0H17的DNA，作为16SrDNA扩增 的模板。应用Primer5. 0软件设计引物，上游引物16S-F:AGAGTTTGATCATGGCTCAG，下 游引物16S-R:ACGGTTACCTTGTTACGACTT，引物序列由英潍捷基（上海）贸易有限公司合 成，扩增条带约 1500bp。PCR反应体系（25yl) :10Xbuffer2.5yL;Mg2+(25mM)2yL; dNTP(1. 25mM) 2yL;正向引物（20pmol/yL) 0? 5yL;反向引物（20pmol/yL) 0? 5yL; !'抑118-丁&9聚合酶0.31^出0嫩（10即/1^)0.51^;(1(111 20 16.71^。？0?反应条件：95。预 变性5min，94°变性30s、55。退火30s、72。延伸lmin30s、30个循环，72°后延伸8min。 PCR反应产物经1 %琼脂糖凝聚电泳检测，与DL2000marker比较，片段大小正确，为目的片 段，见图4。
[0039] 含有目的片段的PCR产物利用AXYGENPCRcleanup试剂盒进行纯化回收，将纯 化产物送往英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，所得序列长度为1428bp。
[0040] 将所得序列与NCBI核酸数据库进行同源性比对分析，结果显示，菌株0H17与 LysobactergummosusKCTC12132的序列相似性高达99%。从中挑选部分相似性高 的菌株以及其它一些溶杆菌与黄单胞菌株进行系统发育分析，用MEGA软件中的邻接法 (Neighbor-Joining)构建系统发育树，见图5。由图可知0H17与Lysobactergummosus遗 传距离最近，与溶杆菌属其他种的遗传距离较远。根据同源性比对和系统发育分析结果， 0H17为胶状溶杆菌。
[0041] 0H17 16SrDNA序列，长度为 1428bp:
【主权项】
1. 一株对植物病原真菌和卵菌具有较强拮抗活性的生防细菌菌株，其特征在于该菌株 是胶状溶杆菌，保藏登记号为：CGMCC No. 8649,命名为Lysobacter gummosus 0H17。2. 权利要求1所述的细菌的应用，其特征在于对水稻稻痕病菌（Magnaporthe grisea)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae)、水稻纹枯病菌（Rhizoctorzia solani)、梨黑斑病菌（Alternaria alternata)、梨炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides)、梨轮纹病菌（Botryosphaeria berengeriana)、番前早疫病菌 (Alternaria solani)、前病镜抱菌（Fusarium solani)、水稻恶苗病菌（Fusarium moniliforme)等真菌和辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici)、瓜果腐霉病菌（Pythium aphanidermatum)等植物病原卵菌具有较强的措抗活性。
【专利摘要】本发明涉及一株对植物病原真菌和卵菌具有较强拮抗活性的生防细菌菌株OH17。该菌株的特征在于：所述菌株为胶状溶杆菌(Lysobacter？gummosus)，属于黄单胞科(Xanthomonadaceae)、溶杆菌属(Lysobacter)，CGMCC？No.8649。菌落形态：在不同培养基上呈现不同形态，在NA培养基上，菌落淡黄色，菌体表面圆润有光泽，表面突出；在LB上生长缓慢，菌落始终为黄色；在10％TSA上，菌落白色，表面平坦；在TSA不生长。生理特征：革兰氏阴性，杆状，无鞭毛；最适生长温度：28℃。该菌株对测试的植物病原真菌和卵菌具有广谱、高效的拮抗作用。CGMCC No.864920131227
【IPC分类】C12N1/20, C12R1/01, A01P3/00
【公开号】CN105112314
【申请号】CN201410814846
【发明人】刘凤权, 钱国良, 刘琳琳, 沈艳
【申请人】南京农业大学
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2014年12月22日