多能扩增间充质前体细胞子代(memp)及其应用的制作方法

专利名称：多能扩增间充质前体细胞子代(memp)及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及多能扩增的间充质前体细胞子代(MEMP)。本发明还涉及用于产生 MEMP的方法以及MEMP在治疗性应用中的用途。
背景技术：
存在于体内且分离时可产生多能细胞的非造血祖细胞被称为间充质前体细胞 (MPCs)。更具体地，纯化的MPCs能够形成大量多能细胞集落。Simmons 等人(Advances in Bone Marrow Purging and Processing :Fourth International Symposium, pages 271-280,1994)阐述了通过选择表达 STR0-1 细胞表面标记物的细胞，从新鲜收集的骨髓细胞富集MPCs。如作者在第272-273页所解释的，已知骨髓细胞包含一定比例能够产生CFU-F的MPCs。这些CFU-F在合适的条件下又能够产生多种 (a broad spectrum of)完全分化的结缔组织，包括软骨、骨、脂肪组织、纤维组织和骨髓支持基质(myelosupportive stroma)。MPCs和CFU-F通常以非常低的发生率存在于骨髓细胞中(通常在 0. 05% -0. 001%之间)，并且这种稀缺性一直是其过去研究中的主要限制。在Simmons et al，1994(见前)引文中所论述的重要发现证实可以通过选择STR0-1阳性细胞，从新鲜分离的骨髓细胞中一定程度的富集MPCs。特别地，STR0-1阳性细胞的选择使得分离MPCs (以及得到的CFU-F)而不污染造血祖细胞成为可能。WO 01/04268 (Simmons et al.)通过鉴定STR0-1阳性细胞部分内包含MPCs的亚群，提供了另一个在MPCs富集方面非常重要的进展。特别地，WO 01/04268描述了将STR0-1 阳性细胞群分选为三个亚类STR0-1 、STR0-1 和STR0-1气在不同的分选亚群中进行 CFU-F集落形成(clonogenic)测定，表明绝大多数MPC包含于STR0-1胃部分中。WO 2004/085630 (Gronthos et al)首次披露了 MPCs存在于血管周围组织中。这个发现的一个益处在于它极大地扩展了 MPC可以从其分离或富集的源组织的范围，并且不再存在对MPCs的骨髓来源的有效限制。根据W02004/085630中描述的方法，MPCs可以从其分离的组织包括人类骨髓、牙髓、脂肪组织、皮肤、脾、胰腺、脑、肾、肝脏和心脏。从血管周围组织分离的MPCs对于细胞表面标记物3G5是阳性的。因此，它们可以通过富集携带3G5标记物的细胞、或者通过富集存在于血管周围细胞上的早期发育表面标记物(如 ⑶146 (MUC18)、VCAM-1)、或通过富集高水平表达的细胞表面标记物STR0-1来分离。用于体外繁殖分离的MPC的方法已有描述(Gronthos et al. Journal of Cell Science 116 :1827-1835，2003)。然而，普遍接受的观点是MPC的体外扩增通过分化使其祖细胞本质丢失。

发明内容
现在，本申请的发明人得到了令人惊奇的发现，S卩，体外扩增的MPCs能产生一种保留多能性的子代亚群。这种MPC子代亚群为Mro-Itoi细胞并在本文中被称为多能扩增 MPC 子代(MEMPs)。本申请的发明人还得到了令人惊奇的发现，即MEMPs在体外和体内均能够刺激组织特异性定型细胞(TSCCs)的增殖。因此，MEMI^s在多种需要产生或修复组织的治疗性应用中具有潜在用途。因此，本发明提供了富集细胞群体，其中总细胞群体的至少10%为具有STR0-ltoi、 ALP—表型的多能扩增间充质前体细胞子代(MEMPs)。本发明还提供了包括培养的和/或扩增的细胞群体的组合物，其中总细胞群体的至少为具有Mro-ltoi、ALP_表型的MEMPs，并且其中组合物进一步包括主要为一种组织类型的TSCCs。本发明还提供了通过将TSCCs与具有Stro-Itoi、ALP_表型的MEMPs共培养或通过将TSCCs与从具有Stro-ltoi、ALP—表型的MEMPs获得的培养上清液、细胞裂解物或部分 (fraction)接触来刺激TSCCs增殖的方法。本发明还提供了一种富集具有STR0-ltoi、ALP_表型的MEMf^s的方法，所述方法包括在一种或多种刺激因子存在的情况下培养或扩增MPC或其子代，所述刺激因子选自由Ia， 25-二羟基维生素D3 (1，25D)、血小板源性生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子α (TNF-α )、白介素-1 β (IL-1 β )和基质衍生因子1 α (SDF-1 α )组成的组。本发明还提供了一种产生组织特异性定型细胞群体的方法，所述方法包括在一种或多种刺激因子存在的情况下培养包括MPC或其子代和TSCC的细胞群体， 所述刺激因子选自由Ia，25_ 二羟基维生素D3(1，25D)、血小板源性生长因子(platelet derived growth factor) (PDGF)、肿瘤坏死因子 α (TNF- α )、白介素-1 β (IL-1 β )和基质衍生因子1 α (SDF-1 α )组成的组；以及使所述培养的群体处于使MPC或TSCC分化偏向于特异性组织类型的条件。本发明还提供了一种包括MPC或其子代和刺激因子的组合物，所述刺激因子选自由1 α，25_ 二羟基维生素D3(l，25D)、血小板源性生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子 α (TNF- α )、白介素-1 β (IL-1 β )和基质衍生因子1 α (SDF-1 α )组成的组。本发明还提供了一种用于产生或修复患者组织的方法，所述方法包括将本发明的富集群体给予患者。本发明还提供了一种用于产生或修复患者组织的方法，所述方法包括将本发明的组合物给予患者。本发明还提供了一种具有STR0-ltoi、ALP_表型的分离的遗传修饰的MEMP。


图1.来源于培养的MPC且表达STRO-Itoi或STRO-Idim的细胞的基因表达谱。体外扩增的骨髓MPC单细胞悬浮液通过胰蛋白酶/EDTA处理而制备。细胞利用STR0-1抗体染色，随后通过用羊抗鼠IgM-荧光素异硫氰酸盐(酯)孵育显示。在荧光激活的细胞分选(A)之后，从纯化的表达STRO-Idim或STRO-Itoi的细胞群体制备细胞总RNA。利用RNAzolB 提取方法以及标准步骤，将总RNA从每个亚群分离并且用作cDNA合成的模版。利用前面阐述的标准流程，通过PCR扩增评估各种转录体的表达(Gronthos et al. Journal of Cell Science 116 :1827-1835,2003) 用于本研究中的引物对示于表2。扩增后，通过1.5%琼脂糖凝胶电泳分析每个反应混合物，并且通过溴化乙锭染色使其可视化(B)。每个细胞标记物参照于管家基因(GAPDH)表达的相对基因表达，利用ImageQant软件加以评估(C)。图2.来源于骨髓MPCs的体外扩增细胞的免疫表型表达模式。来源于骨髓MPC 的体外扩增细胞的单细胞悬浮液通过胰岛素/EDTA解离来制备，随后与STR0-1抗体以及鉴定多种细胞系相关标记物的抗体一起孵育。利用羊抗鼠IgM-荧光素异硫氰酸酯(盐) 鉴定STR0-1，同时利用羊抗鼠或羊抗兔IgG-藻红蛋白鉴定所有其他标记物。对那些鉴定细胞内抗原的抗体，细胞制备物首先用STR0-1抗体标记、用冷70%乙醇固定以透化 (permeabilize)细胞膜并随后用细胞内抗原特异性抗体孵育。在同样的条件下使用匹配的同型对照抗体。利用COULTER EPICS流式细胞仪进行双色流式细胞分析，并收集列表模式数据(list mode data)。点状图表示5000个列表模式的事件(listmode events)，表明每个种系细胞标记物(y轴)和STR0-1U轴)的荧光强度水平。垂直和水平象限参照匹配的同型阴性对照抗体而建立。图3.体外成脂发育。单细胞悬浮液通过从体外扩增细胞(来源于STRO-Itoi/ VCAM-I+分选的骨髓细胞)的继代培养物进行胰蛋白酶/EDTA消化而生成，然后利用单色荧光素激活的细胞分选将扩增的细胞根据其STR0-1表达加以分离，如图IA所示。然后， STRO-Ibri和STRO-Idim分选的MPC衍生细胞在常规生长培养基中，以IxlO5个细胞/孔的密度铺于6孔板中过夜。第二天，将培养基用如在方法中所述的成脂诱导培养基替换。此后， 培养基每周补充两次，共计三周，此时固定该细胞并用油红0进行染色。本图示出了低Gx) 和高(20x)倍放大，以描述含有遍布粘附性基质层中含脂质的脂肪细胞的油红0染色。与 STRO-Itum培养物中7士2脂肪细胞QOx的每单位面积，η = 9个视野)相比，在STRO-Itoi培养物中平均鉴定出22士5个油红0阳性脂肪细胞OOx的每单位面积，η = 9个视野)。图4:体外成骨发育。单细胞悬浮液通过从体外扩增细胞(来源于STRO-Itoi/ VCAM-Γ分选的骨髓细胞)的继代培养物进行胰蛋白酶/EDTA消化而生成。然后利用单色荧光素激活的细胞分选(FAC)将扩增的细胞根据其STR0-1表达加以分离，如图IA所示。然后将STRO-Itoi和STRO-IdimFACS分离的细胞在常规生长培养基中、以0. 3Χ105个细胞/孔的密度铺于48孔板中过夜(每个条件重复4次)。第二天，将培养基用如在方法中所述的成骨诱导培养基替换。此后，将培养物每周补充两次，共计三周，此时洗涤该细胞，然后用0. 6Ν HCL处理以提取矿化沉积物中的钙。将样品与ο-甲酚-酞-配位酮反应，比色反应在570nm 处读数。绝对钙浓度根据钙的标准曲线来确定。㈧钙测量值表明，相比于STRO-Itum培养物，STRO-Itoi培养物合成显著Γ ;p< 0.05 ;t-检验)较多的矿物质。将重复的培养物加以固定，并用茜素红染色法加以染色以描述STRO-Itoi(B)和STRO-Idim(C)培养物的粘附层中矿化沉积物的典型水平。图5:体外软骨发育。单细胞悬浮液通过从体外扩增细胞(来源于STRO-Itoi/ VCAM-I+分选的骨髓细胞)的继代培养物进行胰蛋白酶/EDTA消化而生成，然后利用单色荧光激活的细胞分选(FACS)，将扩增的细胞根据其STR0-1表达加以分离，如图IA所示。然后将STRO-Itoi和STRO-IdimFACS分离的细胞以2. 5x10s个细胞/管的密度成团于聚丙烯管中并在软骨形成诱导培养基中培养。此后，将该培养物每周补充两次，共计三周。回收细胞团并用于组织学检查或如方法中所述制备总RNA。STRO-Ibri(A)和STRO-Idim(B)细胞群体均能够形成含软骨细胞样细胞的细胞团。RT-PCR分析表明，相比于STRO-Idim(SD)细胞群体， STRO-Ibri(SB)群体显示出较高水平的软骨相关基因X型胶原和聚集蛋白聚糖(C)。图6 STRO-Ieri细胞诱导STRO-Idim细胞增殖。体外扩增的骨髓MPC的单细胞悬浮液通过胰蛋白酶/EDTA处理而制备。细胞用STR0-1抗体进行染色并分选为表达STRO-Idim 或STRO-Itoi的培养细胞群体，如图1中所述。细胞如方法中所述用CFSE加以标记。未标记的细胞用来建立阴性对照(自体荧光)。利用Cokemid (100ng/ml)来抑制细胞分裂并提供一个总标记指数(0代)。随后将未标记的STRO-Ibri以(A)OSTRO-Ibri个细胞 IxlO5STRO-Idim 个细胞(0 % ) ； (B)O. 05xl05STR0-lbri 个细胞0. 95xl05STR0-ldim 个细胞 (5%) ； (C) 0. IxlO5STRO-Ibri 个细胞0. 9xl05STR0_ldim个细胞(10% ) ； (D) 0. 2xl05STR0_lbri 个细胞0. 8xl05STR0-ldim 个细胞(20%) ； (E) 0. 5xl05STR0-lbri 个细胞0. 5xl05STR0-ldim 个细胞(50%)的比率加回到CFSE标记的STRO-Idim细胞中。将该补加的混合物培养7天，收集，并如方法中所述通过流式细胞仪进行分析。利用用于Win32的ModFit LTO.O版)分析细胞增殖，发现STRO-Itoi细胞(Rl)以剂量依赖性方式刺激STRO-Itwm细胞的增殖。图7 细胞因子和成骨性试剂增加培养物中的STRO-Itoi细胞的数量。将已建立的MPC培养物在补充了 10% FCS(A)，或一系列因子(包括1x10_8M 1 α , 25- 二羟基维生素 D3(1，25D) (B) ； 10ng/ml 血小板源性生长因子(PDGF) (C) ； 10ng/ml 瘤坏死因子-α (TNF- α ) (D) ； 10ng/ml 白介素 _1 β (IL-1 β ) (E)以及 30ng/ml 基质衍生因子 1_ α (SDF-1 α) (F)) 的基础培养基中培养5天，用STRO-ImAb染色并如上所述进行分析，发现这些因子增加 STRO-IbriMPC的数量。示出的结果是3次独立实验的代表性示例。图8 将无胸腺裸大鼠进行冠状动脉左前降支(LAD)结扎并于48小时后注射盐水、IxlO6个人STRO-Idim细胞、IxlO6个人STRO-Itoi细胞或IxlO6个人Mro-I-缺失的骨髓单核细胞。两周后，处死动物，固定心脏组织，同时用两种单克隆抗体加以染色第一种抗体与大鼠(而不是人类)Ki67抗原选择性反应，第二种抗体与心肌细胞标记物肌钙蛋白I反应。双重染色的细胞(表示增殖的大鼠心肌细胞)通过免疫过氧化酶技术进行检测。相比于接受盐水或IxlO6个STRO-Idim人细胞的对照动物，接受IxlO6个STRO-Itoi人细胞的动物表现为增殖的大鼠心肌细胞呈2. 5-5倍较高的数量(ρ < 0. 05)。图9 无胸腺裸大鼠皮下注射大鼠成胶质细胞瘤细胞，其构成性地分泌VEGF。两周后，该大鼠接受瘤内注射盐水、0. 5xl06个人STRO-Idim细胞或0. 5xl06个人STRO-Itoi细胞。 一周后，处死动物，固定瘤组织，同时用两种单克隆抗体加以染色第一种抗体与α -平滑肌肌动蛋白抗原(由平滑肌细胞表达)反应，而第二种抗体与vWF抗原(由脉管内皮细胞表达)反应。双重染色的结构(表示含有内皮和平滑肌的小动脉和动脉)通过免疫过氧化酶技术进行检测。相比于接受盐水或IxlO6个STRO-Idim人细胞的对照动物，接受0. 5χ106 STRO-Ibri个人细胞的动物在瘤内细胞注射的部位表现为小动脉和动脉呈3. 5-8倍的较高数量(ρ < 0. 05)。在注射了人细胞的远端部位处未观察到差异。图10 =IL-I β增加从MPC扩增的细胞的增殖能力。如方法中所述，将细胞用CFSE 进行标记，随后在lOng/ml IL-I β存在的情况下将细胞培养5天，用STR0-1和ALK PHOSmAb加以染色并如上所述进行分析。(A)未处理的(NT)和(B)IL-Iii处理的培养物表现出 STR0-ltoi/ALP阳性细胞数量的增加。这种STR0-1表达的增加伴随着如(C)中所示的细胞增殖的增加，其中未处理的培养物经历了四次细胞分裂，同时(D)IL-Iii处理的培养物通过增加STRO-Itoi骨原细胞的数量而表现出细胞分裂次数增加。示出的结果是3次独立实验的代表性实例。当l，25D、PDGF-BB、TNF-a、IL-I β以及SDF-I用来刺激MPC时，也可得到类似结果。图11 在成骨诱导剂(地塞米松，desamethasone)存在的情况下，IL-I β刺激MPC 增殖并且增强其骨形成能力。将体外扩增的人(A)MPC后代以2，000个细胞/孔的细胞密度接种于96孔板中并在α -ΜΕΜ-10中培养。培养基补充了指定浓度的IL-I β，并且如在方法中所述，在第7天利用WST-I对细胞数和生存力进行定量。浓度为0. 01ng/ml的IL-I β 显著将细胞数增至未处理对照培养物的136. 6士 1.2% (D，P = 0.000003，学生t-检验)。 在大于0. lng/ml的浓度下获得平台效应。数值表示每个浓度的三次重复培养物的平均值士SEM。(B&C)将体外扩增的MPC后代以切104/孔的细胞密度三份平行接种于M孔板中， 并在成骨诱导性条件下进行培养，如方法中所述。该细胞用浓度为lOng/ml的IL-I β处理， 并且培养物每周“补充”一次含有IL-I β的新鲜培养基。从基质中释放的游离钙通过如方法中所述在酸性条件下处理粘附细胞而获得。将样品与邻甲酚-酞配位酮反应，比色反应在570nm处读数。绝对钙浓度根据钙的标准曲线来确定。结果表明，相比于未处理的细胞 (B)，在用IL-I β处理的细胞中矿物沉积增加(C)。在IL-I β处理的细胞中，钙水平在第4 周广ρ = 0. 00009，学生t-检验)和第6周广P = 0. 00004，学生t_检验)均显著高于未处理的细胞(D)。示出的结果是3次独立实验的代表性实例，其中利用来源于三个不同供体的基质细胞。图12 IL-I β刺激STRO-ItoiMPC增殖，而地塞米松诱导碱性磷酸酶(ALP)表达。将已建立的人MPC培养物以3χ104/孔的细胞密度接种到(A)无补充物(NT)、补充了(B)IOng/ ml IL-I β或(C)lxl0_%地塞米松以及(D) 10ng/ml IL-I β和1x10、地塞米松的完全培养基的M孔板中。将细胞如方法中所述培养21天。结果表明，IL-I β的促有丝分裂作用用于增加STRO-Itoi MPC的数量(B)，后者又刺激STRO-Idim细胞的增殖(见图6)。另外，MPC 响应存在于生长培养基中的FCS和抗坏血酸盐-2-磷酸盐而获得ALP表达，而ALP表达在响应于糖皮质激素(glucocorticosteroid)地塞米松(dex)时被增强(D)。IL-1 β和dex 的组合作用用来增强骨形成，如图11所示。实验进行了三次并且在来源于三个不同供体的 MPC中观察到相似的趋势。图13 :PDGF对体内骨形成的作用。将来源于STR0-lto7VCAM-l+分选的骨髓细胞的体外扩增细胞的半融合继代培养物在PDGF-BB (10ng/ml)存在或不存在的情况下培养5天。 单细胞悬浮液通过胰蛋白酶/EDTA消化形成，然后如方法中所述与用于植入的40mg羟磷灰石/磷酸三钙颗粒(HA/TCP) —起在免疫缺陷小鼠中进行孵育。8周后，将获得的移植物固定并加以处理用于组织学检查。新骨形成的分析利用Scion成像软件根据三个重复移植物的每个表面积(20x)来确定(A)。相比于未处理的对照培养物，用PDGF-BB预处理的培养物显示出显著Γ ;P< 0.05 ;t-检验)较多的异位骨形成。示出的典型图片以横截面描述苏木精/伊红染色的异位骨，代表未处理的(B)和PDGF处理的(C)移植物。图14 多能扩增间充质前体细胞子代(MEMPs)或STRO-Itoi/ALP11PC存在于STR0-1选择的BM MPC的体外培养物中。体外培养物四次传代后，利用双色荧光和流氏细胞仪分析STR0-1选择的BM MPC的STR0-1和ALP表达。点图直方图表示5xl04个以列表模式数据收集的事件。垂线和水平线设定为反应水平低于利用匹配的同型对照抗体1B5 (IgG)和 1A6. 12 (IgM)在相同条件下处理得到的平均荧光的1.0%。
具体实施例方式现在，本申请的发明人得到了令人惊奇的发现，即体外扩增的MPCs包含可保留多能性的细胞亚群。更具体地，本申请的发明人发现根据由STR0-1抗体识别的抗原的表达水平，从收集的MPC细胞获得的扩增(expanded)群体可以分成至少两个群体STR0_lbri和 STRO-f。本文所示的功能性数据表明扩增的STRO-Itoi细胞是较低定型的而且更能够响应于支持脂肪发育、软骨发育和骨发育的诱导因子。相反，311 0-1<""1细胞代表更分化的群体并且包括组织特异性定型细胞(TSCC)类型。在扩增的子代内的Mro-Itoi细胞在本文中被称为多能扩增MPC子代(MEMPs)。本申请的发明人还得到了令人惊奇的发现，即MEMPs能够在体外和体内刺激组织特异性定型细胞(TSCCs)增殖。因此，MEMI^s在多种需要产生或修复组织的治疗性应用中具有潜在用途。如本文所使用的，“MPC”是能够形成大量多能细胞集落的非造血祖细胞。"MPC子代”指的是来源于MPC的细胞。优选地，MPC子代是集落形成单位-成纤维细胞(CFU-F)的子代，而CFU-F又来源于MPC。更优选地，所述细胞通过扩增或体外培养从MPC或CFU-F获得。优选地，该培养涉及两次以上、优选三次以上、较优选四次以上的传代。在培养或扩增后，优选富集群体包括至少5X IO6个细胞，较优选至少IO7个细胞，更优选至少IO9个细胞。W001/04268和W02004/085630中阐述了用于制备富集MPC群体(子代可以从其衍生)的方法。在体外环境下，MPC很少以绝对纯净的制备物存在，通常与其它为组织特异性定型细胞(TSCC)的细胞一起存在。W001/04268提到了从骨髓中以约0. 到90%的纯度水平收集这样的细胞。包括MPC (子代从其衍生)的群体可以直接从组织来源收集，或者可替代地，它可以是已经在体外扩增的群体。例如，该子代可以来源于收集的、未扩增的(unexpanded)、基本上纯化的MPC群体，包括它们存在于其中的群体的总细胞的至少约0. 1、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80或 95%。这个水平可以通过，例如，选择对于至少一种标记物为阳性的细胞来实现，所述标记物选自由 STRO-Itoi、VCAM-Itoi、THY-Itoi、CD146toi 和 STR0_2toi 组成的组。该MPC起始群体可以来源于W001/04268或W02004/085630中列出的任何一种或多种组织类型，即骨髓、牙髓细胞、脂肪组织和皮肤，或者可能更广泛的来源于脂肪组织、牙齿、牙髓、皮肤、肝、肾、心、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、脾、淋巴结、胸腺、胰腺、骨、韧带、骨髓、 腱和骨骼肌。这种细胞的优选来源为人类，然而，预期本发明也可以适用于动物，包括农业动物 (如牛、羊、猪等)、家畜(如狗和猫)、实验动物(如小鼠、大鼠、仓鼠和兔)或者用于运动的动物(如马)。
可以理解，在实施本发明的过程中，携带任何特定细胞表面标记物的细胞的分离可以利用多种不同的方法而实现，然而，优选的方法依赖于将结合剂结合到所涉及的标记物，随后分离那些表现出结合(高水平结合或低水平结合或者无结合)的。最方便的结合剂是抗体或基于抗体的分子，由于单克隆抗体的特异性而优选为单克隆抗体或基于单克隆抗体。抗体可以用于两个步骤，然而，其它试剂也可以使用，因此，也可以采用这些标记物的配体富集携带或缺乏它们的细胞。所述抗体或配体可以附着于固体支撑物以实现粗分离。分离技术优选最大化保留待收集部分的生存能力。可以采用各种不同效率的技术获得相对粗分离。所采用的特定技术依赖于分离效率、相关细胞毒性、操作的难易和速度以及先进装备和/或工艺技术的必要性。用于分离的方法可以包括但不限于利用抗体被覆的磁珠进行磁性分离、亲和层析以及用附着于固体基质的抗体进行“筛选(panning)”。提供精确分离的技术包括但不限于 FACS0用于分离MPC的方法优选包括，例如，第一步，为固相分选步骤，利用例如MACS识别STR0-1的高水平表达。如果需要，第二分选步骤可以随后进行，得到如专利说明书WO 01/14268中所述的较高水平的前体细胞表达。该第二分选步骤可能涉及到应用两种或多种标记物。获得MPC的方法还可以包括在第一富集步骤前利用已知技术收集细胞源。因此可以将该组织手术切除。包括该源组织的细胞随后将被分散入所谓的单细胞悬浮液。这种分散可以通过物理和/或酶法获得。一旦获得合适的MPC群体，它可以通过任何合适的方法进行培养或扩增以获得 MEMPs。MEMPS可以与新鲜收集的MPC区别开并且它们对标记物STRO-Itoi是阳性的，对标记物碱性磷酸酶(ALP)是阴性的。相反，新鲜分离的MPC对STRO-Itoi和ALP均是阳性的。当我们提到细胞对特定标记物为“阳性”时，根据细胞表面上该标记物存在的程度，其可以为标记物的低(Io或dim)或高(bright，bri)表达者，其中所述术语涉及到荧光或在细胞的颜色分选过程中所使用的其他颜色的强度。Lo和bri的区别在被分选的特定细胞群体上所用的标记物的上下文中将被理解。本文中我们提到细胞对特定标记物为“阴性”时，并不意味着该细胞一点也不表达所述标记物，而指该细胞以相对非常低的水平表达该标记物，且当可检测的标记时，产生非常低的信号。当在本文中使用时，术语“亮”指的是细胞表面上的标记物在可检测地标记时产生相对较高的信号。同时不希望受限于理论，我们提出了“亮”细胞比样品中的其它细胞表达较多的靶标记蛋白(例如，由STR0-1识别的抗原)。例如，当用FITC轭合的STR0-1抗体标记(如通过FACS分析所确定的)时，STRO-Is细胞相比非亮细胞(STR0-l Mm)产生较强的荧光信号。优选地，“亮”细胞构成起始样品中包含的最亮标记的骨髓单核细胞的至少约0. 1%。在其它具体实施方式
中，“亮”细胞构成起始样品中包含的最亮标记的骨髓单核细胞的至少约0. 1%、至少约0. 5%、至少约1%、至少约1.5%或至少约2%。因此，本发明提供了富集细胞群体，其中总细胞群体的至少10%是具有STRO-Itoi, ALP—表型的多能扩增间充质前体细胞子代(MEMPs)。在本发明的一个优选具体实施方式
中，总富集细胞群体的至少15^^20^^30%,40%、50%、60%、70%、80%、90%或 95%为具有 STRO-Ibri, ALP^ 表型的 MEMPs。在另一个优选的具体实施方式
中，所述富集细胞群体与具有STRO-Itoi, ALP—表型的 MEMPs 同源(homogenous)。在进一步优选的具体实施方式
中，所述MEMPs对标记物Ki67、CD44和/或⑶49c/ Q^9、VLA-3、α 3β 1中的一种或多种为阳性。在更进一步优选的具体实施方式
中，所述MEMPs不表现TERT活性，并且(或者) 对标记物⑶18为阴性。在进一步优选的具体实施方式
中，根据本发明的富集群体进一步包括组织特异性定型细胞(TSCCs)。TSCCs被认为定型于特定细胞或组织种系，特征在于其为Mro-Idim细胞。“定型” 指该细胞定型于特定细胞或组织类型，但不一定为终末分化的。来源于在例如FCS存在的情况下扩增的MPCs的细胞群体将包括定型于不同种系的TSCCs。因此，一部分TSCCs将定型于比方说骨，另一部分TSCCs则将定型于脂肪细胞(adipocyte)分化，而且还存在多种不同细胞或组织种系的代表性TSCCs。TSCCs倾向定型于一种细胞或组织种系类型，然而其可以为双潜能的，即能够进一步分化成两种不同细胞或组织类型中的一种。TSCCs可以被定型至其的种系的非限制性实例包括骨前体细胞；肝祖细胞，其对于胆管上皮细胞和肝细胞是多能的；神经元限制性细胞，其可产生发展为少突胶质细胞和星形胶质细胞的胶质细胞前体；神经元前体，其发展为神经元；用于心肌和心肌细胞的前体、分泌葡萄糖感应胰岛素的胰腺β细胞系。其它TSCCs包括但不限于软骨细胞、成牙本质细胞、产生牙本质和软骨细胞以及下列细胞的前体细胞视网膜色素上皮细胞，成纤维细胞、皮肤细胞如角化细胞，树突细胞，毛囊细胞，肾管上皮细胞，平滑肌和骨骼肌细胞，睾丸祖细胞，脉管内皮细胞，腱、韧带、软骨、脂肪细胞，成纤维细胞，骨髓基质、心肌、平滑肌、骨骼肌、周细胞、脉管、上皮、神经胶质、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。TSCCs还包括那些特异性产生结缔组织(包括脂肪、蜂窝、骨质、软骨、弹力和纤维结缔组织)的前体细胞。在本发明的一个具体实施方式
中，所述富集细胞群体包括主要为一种组织类型的 TSCCs0“主要为一种组织类型”指群体内所有TSCCs的至少20%、较优选至少30%、较优选至少40 %、较优选至少50 %、较优选至少60 %、较优选至少70 %、较优选至少80 %以及较优选至少90%为同一种组织类型。富集群体内的MEMPs和TSCCs可以来源于同一个体。可替代地，MPC子代和TSCCs 可以来源于不同个体(换句话说，MPC子代和TSCCs是同种异体的)。本发明还提供了包括培养的和/或扩增的细胞群体的组合物，其中所述总细胞群体的至少为具有Mro-Itoi、ALP_表型的MEMPs，且其中组合物进一步包括主要为一种组织类型的TSCCs。在一个优选的具体实施方式
中，该总细胞群体的至少5 %、较优选至少10%、较优选至少20%为具有STRO-Itoi jLP—表型的间充质前体细胞(MPC)子代。在进一步优选的具体实施方式
中，TSCCs定型于组织种系或细胞类型，其选自由骨、神经组织、脂肪、软骨、骨骼肌、心肌、上皮组织、成骨细胞、腱、韧带、成牙本质细胞、周细胞、平滑肌、神经胶质组织、脉管组织、内皮组织、造血组织、肝组织以及肾组织组成的组。在更进一步优选的具体实施方式
中，所述TSCCs是造血细胞。本申请的发明人的另一个发现是MPC子代的存在对于通过TSCC的增殖以及组织形成具有刺激效应。这一点在体外和体内均已发现。因此本发明构思了一种通过与MPC子代共培养或通过与MPC子代的培养上清液、细胞裂解物或培养片段接触来刺激TSCCs增殖的方法。本申请的发明人已经证实，在体外，当测定为STRO-Itoi细胞的MPCs比例保持在 5%或更高水平时，可促进STRO-Itwm细胞的增殖。刺激的程度可被渐进性的增强到这样的水平，其中Mro-Itoi细胞达到约20%。我们设想在不同于迄今为止进行的培养条件下进行较长时期的研究，可能会表明较高浓度具有更强的有利效应，或者较低水平也可能有益。因此提出存在1，2，3或4%的MPCs也可能有利。本发明还提供了通过将TSCCs与具有Mro_ltoi、ALP_表型的MEMPs共培养或通过将TSCCs与从具有Mro-ltoi、ALP—表型的MEMPs获得的培养上清液、细胞裂解物或片段接触来刺激TSCCs增殖的方法。在本方法的一个优选具体实施方式
中，MPC子代与TSCC —起存在于共培养条件下，其水平大于ι %，较优选大于5 %，较优选大于10 %，较优选大于20 %，较优选大于30 %， 较优选大于40 %，较优选大于50 %，较优选大于60 %、70 %、80 %或90 %。本发明的该方法同样适用于那些通常不存在MPC子代的TSCC群体。因此MPC子代可以加入TSCC群体中，并在合适的培养条件下保持预定的时间。预期细胞数量可利用不时加入更多MPC子代而维持在一个有效的水平，可能通过在分批培养中更换培养基或可替代地，在分批或连续培养系统中每天或每几天更换培养基而实现，或者如果最初存在足够数量，则细胞数量可自我维持一代、两代、三代或更多代。在一个具体实施方式
中，TSCCs是来源于纯化的MPCs群体的STRO-Idim细胞，可能根据STRO-Itoi选择或上面提到的其他选择而加以分选。我们提出通过MPC子代刺激TSCCs不仅适用于间充质细胞而且适用于其他细胞类型。迄今为止提供的关于RNA和细胞表面标记物表达的数据表明STRO-Itum群体中呈现的 TSCCs包括外胚层、内胚层和中胚层细胞或组织。由MPC子代刺激的细胞类型不一定来自于 MPC，还可以来自于其他来源。MPC子代还可以用来刺激某些造血细胞的增殖和/或分化。在一个具体实施方式
中，这种造血细胞是⑶34+细胞。一般预期本发明不仅适用于细胞的体外培养，即与体外扩增的培养物相关，然而， 当TSCCs位于机体组织部位的原位且含有MPC子代的群体递送至该部位时，本发明也具有适用性。因此，在本发明该方法的一个具体实施方式
中，TSCCs在体外培养。在本发明该方法的另一个具体实施方式
中，TSCCs位于患者体内的组织部位，MPC 子代、MPC子代的培养上清液、细胞裂解物或片段递送至该组织部位。在本发明该方法的另一个具体实施方式
中，TSCCs和MPC子代均是外源性的，二者均被递送至该组织部位。一次这样的递送可能是足够的，然而短暂而间隔的递送提供的益处可能会加速或更大。在另一个具体实施方式
中，该方法涉及到使所述培养的群体处于可使MPC或TSCC 的分化偏向于特定组织类型的条件下。在本发明该方法的另一个具体实施方式
中，所述TSCCs定型于组织类型，所述组织类型选自由骨、神经组织、脂肪、软骨、骨骼肌、心肌、上皮组织、成骨细胞、腱、韧带成牙本质细胞、周细胞、平滑肌、神经胶质组织、脉管组织、内皮组织、造血组织、肝组织和肾组织组成的组。本发明该方法的另一个具体实施方式
中，所述TSCCs是造血细胞。在另一个具体实施方式
中，该方法进一步包括使受刺激的TSCC群体处于可使 TSCC的分化偏向于特定组织类型的条件下。设想在恰当的培养条件下，可以根据该方法产生的细胞类型的范围包括但不限于以下细胞软骨组织细胞、软骨细胞、透明软骨细胞、纤维软骨细胞、弹性软骨细胞、韧带组织细胞、成纤维细胞、软骨祖细胞、透明软骨祖细胞、纤维软骨祖细胞、弹性软骨祖细胞、成纤维祖细胞、神经组织细胞、神经元、神经胶质细胞、神经元的祖细胞、神经胶质细胞的祖细胞、脂肪细胞、脂肪组织细胞、脂细胞、褐色脂细胞、白色脂细胞、白色脂细胞的祖细胞、褐色脂细胞的祖细胞、成骨细胞、成骨细胞的祖细胞、成牙本质细胞、成牙本质软骨细胞、骨细胞、骨细胞的祖细胞、骨衬细胞、骨衬细胞的祖细胞、脉管细胞、脉管细胞的祖细胞、腱细胞、 骨髓基质细胞、破骨-和造血支持基质细胞、心肌细胞、心肌细胞的祖细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、周细胞、内皮细胞、内皮细胞的祖细胞、上皮细胞、上皮细胞的祖细胞、星形胶质细胞或者少突胶质细胞。本申请的发明人还设计了用于增加MEMPs生成的培养条件。以前的培养条件不适于MEMPs的优先扩增。事实上，在以前的培养条件下，由于分化成Mro-Idim TSCCs，MEMPs 的比例通常随时间而降低。因此，本发明还提供了富集具有STR0-ltoi、ALP_表型的MEMPs的方法，所述方法包括在一种或多种刺激因子存在的情况下培养或扩增MPC或其子代，所述刺激因子选自由1 α，25_ 二羟基维生素D3(l，25D)、血小板源性生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子 α (TNF- α )、白介素-1 β (IL_1 β )和基质衍生因子1 α (SDF-1 α )组成的组。在该方法的一个具体实施方式
中，所述一种或多种刺激因子包括PDGF和/或 IL-I β。在本发明该方法的另一个具体实施方式
中，所述MPC或其子代在两种或多种刺激因子存在的情况下进行培养。增殖的刺激可能适用于收集的未扩增的基本上纯化的MPC群体，包括其所存在的群体总细胞的至少约20，30，40，50，60，70，80或95%。刺激增殖的效应可能是限制体外培养时MPCs分化的程度。在本发明该方法的另一个具体实施方式
中，所述MPC或其子代在培养或扩增前已经在体外进行了扩增。在本发明该方法的另一个具体实施方式
中，相对于未受刺激的对照，刺激得到多于10%的具有STRO-Itoi, ALP-表型的MPC子代的增加，优选多于20%，优选多于40%，优选多于50%。
在本发明该方法的另一个具体实施方式
中，用于培养或扩增的MPC来源于任何一种或多种组织，所述组织组成包括骨髓、牙髓细胞、脂肪组织和皮肤的组，或者可以更广泛的来源于脂肪组织、牙齿、牙髓、皮肤、肝、肾、心、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、脾、淋巴结、胸腺、 胰腺、骨、韧带、骨髓、腱和骨骼肌。在本发明该方法的另一个具体实施方式
中，所述MPC或其子代在一种或多种刺激因子存在的情况下进行体内培养或扩增。从上述内容应该理解，本发明适用于MPC体外增殖，然而，其可能同样适用于体内原位增殖。因此，所述MPC刺激因子可以直接给予例如需要刺激固有MPC增殖的损伤处，因此，所述MPC刺激因子可以单独给予，或者可替代的与包括MPC的群体一起给予。后者可视为优选，因为组织中MPC的数量通常非常低，而另外认为通过存在较大量MPC可能会促进对恰当间充质组织生成的有益效应。在另一个具体实施方式
中，该方法进一步包括给予外源性TSCCs。本发明还提供了一种产生组织特异性定型细胞群体的方法，所述方法包括在一种或多种刺激因子存在的情况下培养包括MPC或其子代和TSCC的细胞群体， 所述刺激因子选自由ι α，25-二羟基维生素D3(l，25D)、血小板源性生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子α (TNF- α )、白介素-1 β (IL-1 β )和基质衍生因子1 α (SDF-1 α )组成的组；以及使所述培养的群体处于使MPC或TSCC的分化偏向于特异性组织类型的条件。在本发明该方法的一个具体实施方式
中，所述组织类型选自由心肌细胞、脉管组织、骨组织、神经组织、平滑肌和内皮组织组成的组。还应该理解本发明还涵盖包括MPC子代和刺激因子的组合物。这种组合物可能是治疗上有益的，因此将被制备成药用形式。所述组合物可以包括富集的或纯化的MPC子代群体以及一种或多种刺激因子。所述组合物中存在的刺激因子的水平可经验性确定，但大多数情况下，其可能为纳克(或几十纳克)/毫升的数量级。体内递送时，可能希望同时在所述组合物中递送TSCCs。例如，在骨或其局部、心肌或其局部、脉管组织或其局部或者包括一种或多种内皮细胞的局部损伤时，递送的TSCC优选至少部分定型于相关细胞类型(例如成骨细胞、心肌细胞或内皮细胞)。这些可以作为混合TSCC培养物的部分或以更加纯化的形式提供，例如，对已知存在于组织特异性定型细胞类型上的标记物进行分选。可替代的或另外的，被递送的组合物可能包括一种或多种分化刺激因子以使存在于组合物中或存在于靶部位的MPCs分化成一种或多种感兴趣的组织类型。因此，本发明还提供一种包括MPC或其子代和刺激因子的组合物，所述刺激因子选自由10，25-二羟基维生素1)3(1，250)、血小板源性生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子 α (TNF- α )、白介素-1 β (IL-1 β )和基质衍生因子1 α (SDF-1 α )组成的组。在一个具体实施方式
中，所述组合物进一步包括TSCC。在另一个具体实施方式
中，所述组合物进一步包括使TSCC或MPC或两者的分化偏向于一种特异性组织类型的因子。优选的，所述组织类型选自由心肌、脉管组织、骨组织、神经组织、平滑肌和内皮组织组成的组。
使TSCC或MPC的分化偏向于特异性组织类型的因子在本文提供的实施例中有阐述。使MPC或骨前体细胞或骨的分化发生偏向的条件可能涉及到例如在补充了 10%FCS、 100 μ M L-抗坏血酸盐(ascorbate)-2-磷酸盐(phosphate)、地塞米松和3mM无机磷酸盐的α MEM中培养。这些条件已证实可诱导人BM基质细胞在体外发育成一种矿化的骨基质(Gronthos et al.，Blood. 84 :4164-73,1994)。用于使TSCCs分化成成骨细胞的条件可能涉及到在I型胶原、纤维蛋白原、纤维蛋白、聚乙醇酸、聚乳酸、骨钙蛋白或骨粘连蛋白存在的情况下培养所述TSCCs。在一个具体实施例中，TSCCs在I型胶原、纤维蛋白原以及纤维蛋白存在的情况下进行培养。在一个可替代性实施例中，TSCCs在I型胶原、纤维蛋白原、纤维蛋白、骨钙蛋白以及骨粘连蛋白存在的情况下进行培养。在该方法的范围中，I型胶原、纤维蛋白原、纤维蛋白、聚乙醇酸、聚乳酸、 骨钙蛋白或骨粘连蛋白可以单独使用或在生长因子存在的情况下使用。应当理解，本段以上列出的化合物的任意组合也属于本发明的构思范围。本发明还提供了一种生成或修复患者组织的方法，该方法包括给予患者本发明的富集群体。本发明还提供了一种生成或修复患者组织的方法，该方法包括给予患者本发明的组合物。在这些方法的优选具体实施方式
中，所述组织选自由心肌、骨、脉管组织、神经组织和内皮组织组成的组。本发明还提供了确定化合物能否刺激MPC细胞增殖以生成MEMPs的方法，包括以下步骤使含有MPCs的群体接触一种或多种候选MPC刺激性化合物达规定的时间用于所述群体的繁殖，以及确定MEMP数量的增加并与对照比较结果。上述方法可使得生成或修复骨骼肌、心肌、骨、牙齿或脉管组织。更广泛的，该方法可使得生成或修复以下细胞或组织，其选自由心肌、心肌细胞、软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、成牙本质细胞、牙本质生成软骨细胞、骨细胞、骨衬细胞、骨骼肌细胞、脉管内皮细胞、骨髓基质、破骨细胞和造血细胞支持基质、心肌、骨骼肌、内皮细胞和脉管细胞组成的组。本发明还提供一种具有STR0_ltoi、ALP—表型的独立的遗传修饰的间充质前体细胞 (MPC)子代。在一个优选的具体实施方式
中，所述MPC子代经过遗传修饰以表达异种蛋白。该异种蛋白可以为任何感兴趣蛋白。例如，该异源性蛋白可以为促进MEMI^s生成的刺激性因子，如1 α，25- 二羟基维生素D3(l，25D)、血小板源性生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子 α (TNF- α )、白介素-1 β (IL-1 β )和基质衍生因子1 α (SDF-1 α )。在另一个实施例中，该异种蛋白是可加速MPC或TSCC分化成特异性组织类型的生物活性因子。该生物活性因子可以是例如合成的糖皮质激素如地塞米松，或骨形态发生蛋白如 BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-6 或 BMP-7。在整个说明书中，词语“包括”或变形如“包含”或“含有”应当理解为表示包括所述元件、整体或步骤，或元件、整体或步骤的组，但不排除任何其它元件、整体或步骤，或元件、整体或步骤的组。显而易见的，本发明一个方面优选的的特征和特点适用于本发明的许多其他方
遗传修饰细胞的制备在本发明的一种具体实施方式
中，本发明提供了一种具有STR0-ltoi、ALP—表型的分离的遗传修饰的间充质前体细胞(MPC)子代。优选的，所述MEMI^s经过遗传修饰以产生异种蛋白。典型的，所述细胞经过遗传修饰使得异种蛋白从该细胞分泌。遗传修饰的细胞可在至少一种其量足以支持该经修饰细胞生长的细胞因子存在的情况下进行培养。这样获得的遗传修饰细胞可以立即被利用(例如，在移植物中)、培养和体外扩增或保存以备用。该修饰的细胞可以通过本领域熟知的方法例如在液氮中冷冻而保存。如本文所使用的，遗传修饰涵盖任何遗传修饰方法，其涉及将外源性或外来多核苷酸引入MEMP或MEMP前体(例如MPC)中或在MEMP或MEMP前体内对内源性基因的修饰。 遗传修饰包括但不限于转导(病毒介导的宿主DNA从宿主或供体到受体的转移，体外或体内)、转染(用分离的病毒基因组DNA转化细胞)、脂质体介导的转移、电穿孔、磷酸钙转染或共沉淀及其他。转导的方法包括将细胞与生产细胞(producer cell)直接共培养(Bregni et al·，Blood 80 1418-1422，1992)，或在有或没有合适生长因子和聚阳离子的情况下单独利用病毒上清液进行培养(Xu et al.，Exp. Hemat. 22 :223-230,1994)。优选将编码异源性多肽的多核苷酸在载体内引入宿主细胞。该载体优选包括插入的编码序列转录和翻译所必需的元件。用来构建这种载体的方法在本领域是熟知的。例如，用于构建合适表达载体的技术在Sambrook et al. ,Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N. Y. (3rd Ed. ,2000)；禾口 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons，Inc.，NewYork(1999)中有详细描述。载体可以包括但不限于病毒载体如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒和单纯疱疹病毒、粘粒、质粒载体、合成型载体以及通常用于本领域中的其它重组载体。含有启动子和克隆位点(多核苷酸可操作地连接入其中)的载体在本领域中是熟知的。这样的载体能够在体外或体内转录RNA，并且可从诸如Mratagene(La Jolla，Calif. ) ^P Promega Biotech (Madison, Wis.)等来源购得。具体实例包括来自 Stratagene 的 pSG、pSV2CAT、pXtl 以及来自 Pharmacia 的 pMSG、pSVL、pBPV 和 pSVK3。优选的载体包括逆转录病毒载体(参见Coffin et al.，‘‘ Retroviruses", Chapter 9 pp ；437-473,Cold Springs Harbor Laboratory Press，1997)。本发明中有用的载体可通过本领域熟知的工艺经重组制备。例如，W094/29438.W097/21824和W097/21825 阐述了逆转录病毒包装质粒和包装细胞系的构建。示例性载体包括PCMV哺乳动物表达载体，例如 pCMV6b 和 pCMV6c (Chiron Corp.)、pSFFV_Neo 和 pBluescript-Sk+。有用的逆转录病毒载体的非限制性实例是那些来源于鼠类、鸟类或灵长类逆转录病毒的载体。通用的逆转录病毒载体包括那些基于莫洛尼氏鼠白血病毒(MoMLV-载体)的载体。其它源于MoMLV 的载体包括 LmiIy、LINGFER、MINGFR 和 MINT (Chang et al.，Blood 92 :1-11,1998) 另外的载体包括那些基于长臂猿白血病毒(GALV)和莫洛尼氏鼠肉瘤病毒(MOMSV)以及脾病灶形成病毒(SFFV)的载体。来源于鼠干细胞病毒(MESV)的载体包括MESV-MiLy (Agarwal et al.，J. of Virology, 72 =3720-3728,1998)。逆转录病毒载体还包括基于慢病毒的载体，非限制性实例包括基于人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)的载体。
制备逆转录病毒载体构建体时，病毒gag、pol和env序列可从该病毒去除，形成用于外来DNA序列插入的空间。由外来DNA编码的基因通常在长末端重复序列(LTR)中的强病毒启动子控制下表达。合适的控制调节序列的选择取决于所使用的宿主细胞，且选择属于本领域技术人员的能力范围。除LTR的启动子外，还有多种启动子为人所知。非限制性实例包括噬菌体λ PL启动子、人巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、莫洛尼氏鼠肉瘤病毒 (MMSV)、劳氏肉瘤病毒(Rous Sacroma Virus,RSV)或脾病灶形成病毒(SFFV)的U3区启动子、Granzyme A启动子以及Granzyme B启动子。另外，可使用可诱导或多重控制元件。选择合适的启动子对于本领域技术人员是显而易见的。如果gag、pol和env功能由包装(packing)细胞系反式提供，则这样的构建体可被有效地包装到病毒粒子中。因此，当该载体构建体被引入所述包装细胞中时，由该细胞产生的gag-pol和env蛋白与载体RNA —起组装以产生感染性病毒颗粒(viron)，其分泌到培养基中。这样产生的病毒可感染并整合入靶细胞的DNA，但不产生感染性病毒粒子因为其缺少基本的包装序列。目前使用的大多数包装细胞系已用单独的质粒(每种质粒含有必需的编码序列中的一个)进行转染，因此在可复制病毒产生之前多重重组事件是必需的。可替代地，该包装细胞系带有前病毒。该前病毒已被破坏，因此尽管其可以产生组装感染性病毒所必需的全部蛋白质，但是其自身RNA不能包装入病毒，而是包装由重组病毒产生的RNA。 因此，从该包装细胞释放的病毒原种仅含有重组病毒。逆转录病毒包装株系的非限制性实例包括 PA12、PA317、PE501、PG13、PSI. CRIP, RDI 14、GP7C-tTA-G10、ProPak_A (PPA-6)以及 PT67。参见 Milleret al. , Mol. Cell Biol. 6 :2895,1986 ；Miller et al.，Biotechniques 7 :980,1989 ；Danos et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :6460,1988 ；Pear etal.，Proc. Natl.Acad. Sci. USA 90 :8392-8396,1993 ；and Finer et al. ，Blood 83 :43-50,1994。其它合适的载体包括腺病毒载体(参见Frey et al.，Blood91 :2781,1998 ；和 WO 95/27071)以及腺相关病毒载体。这些载体在本领域中都是熟知的，如Chatterjee et al., Current Topics in Microbiol. And Immunol. ,218 :61-73,1996 ；Stem cell Biology and Gene Therapy, eds. Quesenberry et al., John Wiley & Sons, 1998 ;and U. S. Pat. Nos. 5,693, 531 and 5，691，176中所描述的。腺病毒衍生载体的应用在某些情形下可能是有利的，因其不能够感染非分裂细胞。与逆转录病毒DNA不同，腺病毒DNA不整合入靶细胞的基因组中。而且，腺病毒载体携带外来DNA的能力比逆转录病毒载体大很多。腺相关病毒载体是另一种有用的递送系统。这种病毒的DNA可以被整合入非分裂细胞中，利用腺相关病毒载体已将多种多核苷酸成功引入不同细胞类型中。在一些具体实施方式
中，该构建体或载体包括两种或更多种异源性多核苷酸序列。优选地，所述其它核酸序列是编码选择性标记物、结构基因、治疗性基因或其它细胞因子/趋化因子基因的多核苷酸。一种选择性标记物可以包含于构建体或载体中，用于监测遗传修饰的成功以及用于选择DNA已整合入其中的细胞。非限制性实例包括耐药性标记物，如G148或潮霉素。另外也可采用阴性选择，例如，其中的标记物是HSV-tk基因。该基因使细胞对诸如阿昔洛韦 (acyclovir)和更昔洛韦(gancyclovir)等药物敏感。通常使用NeoR(新霉素/G418抗性) 基因，但任何便利的标记基因均可使用，只要其基因序列尚未存在于靶细胞中。进一步的非限制性实例包括低亲和力的神经生长因子(NGFR)、增强绿色荧光蛋白(EFGP)、二氢叶酸还原酶基因(DHFR)、细菌hisD基因、鼠⑶M (HSA)、鼠⑶8a (Iyt)、赋予嘌呤霉素或腐草霉素抗性的细菌基因以及半乳糖苷酶。其它多核苷酸序列可以在与编码异源性蛋白的多核苷酸相同的载体上被引入到宿主细胞中，或者所述其它多核苷酸序列可以在另一个载体上被引入宿主细胞。在一个优选的具体实施方式
中，选择性标记物将被包含在与编码异源性蛋白多核苷酸相同的载体上。本发明还涵盖对内源性基因的启动子区进行遗传修饰，以使该内源性基因的表达上调，导致相比于野生型MEMPs，编码蛋白的产生增加。刺激因子的给予本发明的方法可能涉及将一种或多种刺激因子给予患者，以原位富集MEMPs。这些方法可能涉及部分、系统或局部如在植入物或装置内部给予一种或多种刺激因子例如1 α，25- 二羟基维生素D3(l，25D)、血小板源性生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子 α (TNF- α )、白介素-1 β (IL-1 β )和基质衍生因子1 α (SDF-1 α )。在一个特定的具体实施方式
中，本发明提供一种通过将刺激因子系统性给予所述患者，而在需要其的患者中富集MEMPs的方法。例如，该刺激因子可通过皮下或肌内注射而给予。本发明的这个具体实施方式
可能对那些希望在特定组织中富集MEMPs的系统变性疾病的治疗很有用。可用这种方式治疗的系统变性疾病的实例包括骨质疏松症或骨折、 软骨变性疾病、动脉粥样硬化、外周动脉疾病或心血管疾病等。因此，根据本发明，治疗或预防有效量的刺激因子可用于治疗的疾病或失调选自由自身免疫性疾病、急性慢性炎症、癌症、心血管病、感染性疾病以及炎症性疾病(包括风湿性关节炎、慢性炎症性肠道疾病、慢性炎症性盆腔疾病、多发性硬化症、哮喘、骨关节炎、 动脉粥样硬化、银屑病、鼻炎、自身免疫性和器官移植排斥)组成的组。在一个实施例中，这种组合物包括一种或多种治疗或预防有效量的刺激因子，足以用来辅助刺激组织特异性细胞的产生。“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间期内可有效获得MEMI^s富集的量。“预防有效量”是指在必要的剂量和时间期内可有效获得希望的预防效果如防止或抑制MPC或其衍生后代死亡的量。在特定的具体实施方式
中，刺激因子的优选范围可以是0. InM-O. 1M、 0. InM-O. 05Μ、0. 05ηΜ_15 μ M或0. OlnM-IO μ Μ。应当注意，剂量值可以随着待缓解病症的严重程度而变化。对于任何特定的患者，根据个体需要以及给予或监控该组合物给予的人员的专业判断，特定的剂量方案可随时间进行调整。本文提出的剂量范围仅是示例性的，并不限制可由医疗人员选择的剂量范围。组合物中刺激因子的量可以根据诸如个体疾病状态、年龄、性别以及个体体重等因素而变化。可对剂量方案进行调整以提供最佳治疗应答。例如，可以给予单一推注，可以在一定时间内给予若干分次剂量，或者该剂量可以根据治疗情形紧急性的指示而成比例地减少或增加。将肠胃外组合物配制成剂量单位形式，可能对方便给予和统一剂量是有利的。 如本文所使用的，“剂量单位形式”是指物理性分开的单位，适合作为用于待治疗患者的单一剂型；每一个单元含有经计算的预定量活性化合物，联合必需的药用载体而产生希望的治疗作用。应当理解，刺激性因子可以以一种包含药用载体或赋形剂的组合物形式给予。如本文所使用的，“药用载体”或“赋形剂”包括任何以及所有生理相容的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌试剂、等渗和延缓吸收剂等。在一个具体实施方式
中，该载体适合于肠胃外给予。可替代地，该载体可适合于静脉内、腹膜内、肌内、舌下或口服给予。药用载体包括无菌水性溶液或分散液以及用于无菌可注射溶液或分散液的临时制剂的无菌粉末。这些用于药学活性物质的介质和试剂应用在本领域是熟知的。除了任何与该活性化合物不相容的常规介质或试剂的范围之外，均考虑其在本发明药物组合物中的应用。补充的活性化合物也可并入到该组合物中。用于肠胃外给药的药物制剂可以包括脂质体。脂质体和乳液是熟知的对于疏水性药物特别有用的递送工具或载体的实例。根据治疗试剂的生物学稳定性，可以采用其它用于稳定蛋白质的方案。此外，人们可以给予存在于靶向药物递送系统中的药物，例如，存在于涂覆靶特异性抗体的脂质体中。该脂质体会结合于靶蛋白并由表达靶蛋白的细胞选择性吸收。通常，在生产和贮存条件下治疗性组合物应该是无菌且稳定的。该组合物可配制成溶液、微乳液、脂质体或其它适于高药物浓度的有序结构。该载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。适当的流动性可通过例如利用涂层如卵磷脂、通过在分散的情况下保持所需颗粒大小以及通过利用表面活性剂来保持。在许多情况下，优选在该组合物中包括等渗剂，例如糖类、多醇(如甘露醇、山梨糖醇)或氯化钠。可注射组合物的延迟吸收可通过在该组合物中包含一种延缓吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶而实现。此外，刺激因子可以在延时释放制剂中给予，例如在包括缓释聚合物的组合物中给予。该活性化合物可利用防止该化合物快速释放的载体如控释制剂一起制备，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯基乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLG)。用于制备这些制剂的许多方法都被授予专利或通常对于本领域熟练技术人员是已知的。另外，刺激因子的悬浮液可被制成适当的油状悬浮液用于注射。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油；或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酸酯；或脂质体。用于注射的悬浮液也可含有增加该悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。可选地，该悬浮液还可含有合适的稳定剂或增加该化合物溶解性的试剂，以制备高度浓缩的溶液。无菌可注射溶液可通过在合适溶剂中以需要量的活性化合物根据需要与上述列举组分中的一种或其组合加以混合而制备，随后进行过滤消毒杀菌。通常，分散液通过将活性化合物并入含有一种基本分散介质以及所需的来自以上列举的其它组分的无菌载体中而制备。在用于无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，可从其之前已无菌过滤的溶液得到一种活性成分与任何其它希望组分的粉末。根据本发明的一个可替代方面，刺激因子可以与一种或多种增强其溶解性的其它化合物一起配制。如果该刺激性化合物需要通过吸入给予，则它们可以以压缩包装的气溶胶喷射规格(spray presentation)或雾化剂的形式，同时采用合适的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、 三绿氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它合适的气体)一起方便地加以递送。在一种压缩气溶胶的情况下，剂量单位可以通过一个阀递送可测定的量来确定。例如用于吸入器的胶囊和明胶套可以配制成包含该化合物和一种合适粉末基质如淀粉或乳糖的粉末混合物。本发明的细胞组合物的给予包含MEMPs和/或TSCCs的本发明的细胞组合物可对多种类型的组织再生很有用，包括骨、软骨、腱、韧带、肌肉、皮肤和其它结缔组织，以及神经、心脏、肝、肺、肾、胰腺、脑和其它器官组织。在一些具体实施方式
中，本发明的组合物可以结合一种适当的基质(例如，用于支持MEMPs和/或其衍生后代并为骨、软骨、肌肉、神经、表皮和/或其它结缔组织的生长提供表面)一起给予。该基质可以是传统基质生物材料的形式。该基质可以提供所述表达的蛋白和分化的细胞的缓释和/或其存在的适当环境。在一些具体实施方式
中，预期多种胶原和非胶原被上调并从MEMI^s分泌。这种现象通过增强基质沉积而加速组织再生。基质蛋白也可在遗传改造的细胞中表达且促进移植的细胞移入并附着于移植区。基质材料的选择根据生物相容性、生物降解性、机械性能、创面外观和界面性质。 该基于细胞的组合物的特定应用将确定适当的制剂。用于该组合物的可能基质可以是生物可降解的以及化学定义的硫酸钙、磷酸三钙、羟磷灰石、聚乳酸和聚酐(polyanhydride)。其它可能的材料是生物可降解的和生物学上良好定义的，如骨或真皮胶原。其它基质由纯蛋白或胞外基质组分构成。其它可能的基质是非生物降解的和化学定义的，如烧结的羟磷灰石、生物玻璃、铝酸盐或其它陶瓷材料。基质可以由上述类型的材料中任意的组合构成，如聚乳酸和羟磷灰石或胶原与磷酸三钙的组合。生物陶瓷在组成上可以被改变如在磷酸铝钙中，也可经加工以改变孔径大小、颗粒大小、颗粒形状和生物降解性。本发明的细胞组合物可以用来治疗由疾病或创伤或该组织发育不正常引起的需要软骨或骨组织修复或置换的患者，或用来提供一种整容功能，如增强身体的面部或其它特征。治疗可使得本发明的细胞的应用很必要，以产生新的软骨组织和骨组织。例如，包含未分化的或软骨形成分化诱导的前体细胞的组合物可用来治疗软骨病症，例如风湿性关节炎或骨关节炎，或对软骨的创伤性或手术性损伤。作为另一个实施例，包含骨前体细胞的组合物可用来治疗骨的病症，包括代谢和非代谢骨疾病。骨病症的实例包括半月板撕裂、脊柱融合、脊椎盘摘除、脊柱重建、骨折、骨/脊柱变形、骨肉瘤、骨髓瘤、骨发育异常、脊柱侧凸、 骨质疏松症、牙周病、牙骨质丢失、骨软化症、软骨病、纤维性骨炎、肾性骨营养不良和骨佩吉特式病(Paget' s disease of bone，变形性骨炎)。本发明的细胞组合物可单独给予或作为与其它细胞的混合物给予。可以结合本发明组合物而给予的细胞包括但不限于其它多能或多向性细胞或软骨细胞、成软骨细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、骨衬细胞、干细胞或骨髓细胞。不同类型的细胞可在给予前立即或短期内与本发明的组合物进行混合，或在给予前它们可共培养一段时间。本发明的细胞组合物可与其它有益的药物或生物分子(生长因子、营养因子)一起给予。当MEMI^s与其它试剂一起给予时，它们可以在单一药物组合物中一起给予，或在分开的药物组合物中同时或与其它试剂按顺序给予(在给予其它试剂之前或之后)。可以共同给予的生物活性因子包括抗凋亡试剂(例如，EPO, EPO模拟抗体(mimetibody)，ΤΡ0,IGF-I 和 IGF-II，HGF，胱冬酶抑制剂(caspase inhibitor))、抗炎剂(例如，p38 MAPK 抑制剂，TGF-β 抑制剂，他汀类药物，IL-6 和 IL-I 抑制剂，PEMIROLAST, TRANILAST, REMICADE, SIR0LIMUS,和 NSAID (非甾族抗炎剂物；例如 TEPOXALIN，TOLMETIN, SUPR0FEN))、免疫抑制 / 免疫调节剂(例如，钙调磷酸酶(calcineurin)抑制剂，如环孢素，他克莫司(tacrolimus)； mTOR抑制剂(例如，SIROLIMUS，EVER0LIMUS)；抗增殖剂(例如，咪唑巯嘌呤，吗乙霉酚酸盐/酯)；皮质激素类(例如，氢化泼尼松(prednisolone)，氢化可的松)；抗体如单克隆抗-IL-2Ra受体抗体(例如，巴利昔单抗、达克珠单抗)、多克隆抗-T细胞抗体(例如，抗胸腺细胞球蛋白(ATG)、抗淋巴细胞球蛋白(ALG)、单克隆抗-T细胞抗体0KT3))、抗-血栓形成剂(例如，肝磷脂、肝磷脂衍生物、尿激酶、PPack(右旋苯丙氨酸脯氨酸精氨酸氯甲基酮)、抗凝血酶化合物、血小板受体拮抗剂、抗凝血酶抗体、抗血小板受体抗体、阿斯匹林、双嘧啶胺醇、鱼精蛋白，水蛭素，前列腺素抑制剂，和血小板抑制剂)和抗氧化剂(例如，丙丁酚，维生素A，抗坏血酸，生育酚，辅酶Q-10，谷光甘肽，L-半胱氨酸，N-乙酰基半胱氨酸)以及局部麻醉剂。作为另一个实施例，该细胞可以与瘢痕抑制因子(如在第5，827，735号美国专利中描述的，其内容结合于此作为参考)一起给予。在一个具体实施方式
中，本发明的细胞组合物作为未分化的细胞给予，S卩，如在生长培养基中培养的细胞。可替代地，该细胞组合物可以在培养过程中暴露于刺激分化朝向希望表型例如成骨表型的条件之后给予。本发明的细胞组合物可以手术植入、注射、递送(例如，通过导管或注射器)，或以其它方式直接或间接给予至需要修复或加强的部位。这些细胞可以借助基质(例如，一种三维支架)而给予。这些细胞可以与传统药用载体一起给予。本发明的细胞或其组合物或组分(例如，ECM，细胞溶解产物，条件培养基)的给予途径包括肌内、眼用、肠胃外(包括静脉内)、动脉内、皮下、口服以及鼻道给予。肠胃外给药的特定路径包括但不限于肌内、皮下、 腹膜内、大脑内、心室内、脑心室内、胸内、脑池内，脊柱内和/或脊柱周围的给药路径。当这些细胞以半固态或固态装置进行给予时，手术植入体内的精确位置通常是一种合适的给药方式。然而，液体或流体药物组合物可以给予至一个更广泛的位置(例如，整个广泛受影响的区域)，其从该位置移动到一个特定位置，例如，通过对化学信号产生反应。其它具体实施方式
涵盖了通过给予含细胞组分(例如，细胞溶解产物或其组分) 或产物(例如，通过遗传修饰产生的胞外基质、营养和其它生物因子)的药物组合物的治疗方法。用于给予本文所述的细胞组合物的剂型和方案是根据良好的医疗实践而开发的， 考虑了个体患者的情况，例如正治疗病症的性质和程度、年龄、性别、体重和整体医疗条件以及其它为医疗人员所知的因素。因此，待给予患者的药物组合物的有效量是通过本领域已知的这些考虑来确定的。在本发明的一些具体实施方式
中，在用本发明的细胞组合物开始治疗之前抑制一个患者的免疫反应可能是不必要的或不希望的。因此，利用同种异体或甚至异基因的MEMPs 进行移植在某些情况下可耐受的。然而，在其它情况下，可能希望或需要在细胞治疗开始之前药理学地抑制患者的免疫反应。这可以通过系统或局部应用免疫抑制剂来实现，或者通过在囊化装置中递送该细胞而实现。MEMI^s可以被包被于胶囊中，该胶囊允许细胞和治疗因子所需的营养物质和氧气透过，而该细胞对免疫体液因子和这些细胞是不可透过的。优选地，该胶囊密封材料是低变应原性的，易于稳定定位于靶组织中，并且对该植入的结构提供额外保护。这些以及其它用于减少和消除对该植入细胞的免疫反应的方式在本领域中是已知的。作为一种替代方案，MEMPs可以经过遗传修饰以减少其免疫原性。移植的MEMPs在生存患者中的存活可通过利用各种扫描技术来确定，例如计算机化轴向断层检查(CAT或CT)扫描、磁共振成像(MRI)或正电子发射断层成像术(PET)扫描。移植物存活的确定也可通过死后取出靶组织，并通过肉眼或通过一个显微镜来检查而完成。可替代地，这些细胞可利用特异于特定种系细胞染剂来处理。移植的细胞也可通过提前并入示踪性染料如罗丹明或荧光素标记的微球体、快蓝(fast blue)、二苯甲酰胺、含铁微粒或遗传性引入报道子基因产物如牛乳糖或葡糖醛酸糖苷酶来而加以鉴定。移植的MEMPs功能性整合入患者可通过检查被损伤或不健全的功能的恢复而进行评估，例如关节或骨功能的恢复或功能的加强。本发明的细胞组合物可以包括一种或多种生物活性因子，例如但不限于生长因子、分化诱导因子、细胞存活因子如胱冬酶抑制剂、抗炎剂如Ρ38激酶抑制剂或血管生成因子如VEGF或bFGF。生物活性因子的一些实例包括PDGF_bb、EGF、bFGF、IGF-I和LIF。可替代地，待移植的MEMI^s可以经过遗传改造，以表达这些生长因子、抗氧化剂、 抗凋亡剂、抗炎剂或血管生成因子。本发明的药物组合物可以包含MEMPs的同源或异源群体、胞外基质或其细胞溶解产物或其在药用载体中的条件培养基。用于本发明细胞的药用载体包括合适的有机或无机载体物质，其不会与本发明的细胞或其组合物或组分有害地反应。在它们是生物相容性的程度上，合适的药用载体包括水、盐溶液(如林格氏溶液)、乙醇、油、明胶和碳水化合物如乳糖、直链淀粉或淀粉、脂肪酸酯、羟甲基纤维素和聚乙烯基吡咯烷。这样的制剂可被消毒杀菌，如果需要，其可与辅助试剂如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂和着色剂混合。适合用于本发明中的药用载体在本领域是已知的，且在例如 Pharmaceutical Sciences(17. sup. th Ed.，Mack Pub.Co.，Easton，Pa.)禾口 WO 96/05309 中有描述，每一个的内容均结合于此作为参考。可将一种或多种其它组分添加到移植的细胞中，包括所选的胞外基质组分，如本领域已知的一种或多种类型的胶原、和/或生长因子、富血小板血浆以及药物。可替代地， 本发明的细胞可经遗传改造以表达和产生生长因子。本文中提供了关于本发明细胞的遗传改造的详细内容。在一个非限制性具体实施方式
中，制备包含本发明细胞的制剂，用于直接给予至需要新组织如骨组织产生的部位。例如，但不限制地，该MEMPs可被悬浮在一种用于注射的水凝胶溶液中。用于本发明的合适水凝胶的实例包括自组装肽如RAD16。可替代地，含有这些细胞的水凝胶溶液植入前可允许固化，例如在一个模具中形成细胞分散于其中的一种基质。或者，一旦该基质已被固化，则该细胞制备物可以被培养，以使这些细胞在植入前经有丝分裂而扩增。该水凝胶是一种有机聚合物(天然的或合成的)，其通过共价键、离子键或氢键交联产生三维开放的晶格结构，其捕获水分子而形成凝胶。可用来形成凝胶的材料的实例包括离子交联的多糖(如藻酸盐)及其盐、肽、聚磷嗪和聚丙烯酸酯，或者嵌段聚合物如聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物，其分别通过温度或PH进行交联。在一些具体实施方式
中，MEMPs的支撑物是生物可降解的。在本发明的一些具体实施方式
中，制剂包含一种可原位聚合的凝胶，例如美国专利申请公开 2002/002洸76 ；Anseth et al. , J. Control Release, 78 (1-3) :199-209(2002)； Wang et al. , Biomaterials, 24 (22) :3969-80(2003)中所描述的。在一些具体实施方式
中，该聚合物在含水溶液如水、缓冲盐溶液或水-乙醇溶液中至少部分可溶，所述溶液具有带电侧基或其单价离子盐。带有可与阳离子反应的酸性侧基的聚合物实例是聚(磷腈)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物，聚(乙酸乙烯酯)和磺酸化聚合物，如磺酸化聚苯乙烯。也可以使用通过丙烯酸或甲基丙烯酸与乙烯基醚单体或聚合物反应形成的具有酸性侧基的共聚物。酸性基团的实例是羧酸基、磺酸基、卤化的(优选氟化的)醇基、酚OH基和酸性OH基。带有可与阴离子反应的碱性侧基的聚合物实例是聚(乙烯基胺)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基咪唑)以及一些亚胺基取代的聚磷腈。该聚合物的铵盐或季盐也可由主链氮或侧链亚氨基形成。碱性侧基的实例是氨基和亚氨基。室温下，藻酸盐可在水中与二价阳离子进行离子交联，形成一种水凝胶基质。由于这些温和的条件，藻酸盐已成为用于杂交瘤细胞囊化最通用的聚合物，例如在Lim的第 4，352，883号美国专利中描述的。在该Lim工艺中，包含待封装生物材料的含水溶液被悬浮于水溶性聚合物的溶液中，所述悬浮液形成微滴，其通过接触多价阳离子而被配制成分散的微胶囊，然后该微胶囊的表面用多氨基酸进行交联，而在囊化的材料周围形成半透膜。聚磷腈是其主链由交替单键和双键分隔的氮和磷构成的聚合物。每一个磷原子共价键合至两条侧链。适合于交联的聚磷腈其大部分的侧链基团是酸性的并且能够与二价或三价阳离子形成盐桥。优选的酸性侧基的实例是羧酸基和磺酸基。水解稳定的聚磷腈由具有羧酸侧基(其通过二价或三价阳离子如Ca2+或Al3+进行交联)的单体形成。通过并入具有咪唑、 氨基酸酯或丙三醇侧基的单体可合成通过水解作用而降解的聚合物。例如，一种聚阴离子的聚[双(苯氧基)]磷腈(PCPP)可以被合成，其可于室温或低于室温下在含水介质中与溶解的多价阳离子进行交联，以形成水凝胶基质。生物可降解的聚磷腈具有至少两种不同类型的侧链能够与多价阳离子形成盐桥的酸性侧基以及在体内条件下可水解的侧基，例如咪唑基、氨基酸酯、甘油和葡糖基。侧链的水解导致聚合物的腐蚀。水解性侧链的实例是未取代和取代的咪唑以及氨基酸酯，其中该基团通过一个氨基键键合于磷原子(其中两个R基团以这种方式连接的磷腈聚合物被称为聚氨基磷腈)。对于聚咪唑磷腈，在聚磷腈主链上的“R”基团的一部分是咪唑环，通过一个环氮原子连接于主链中的磷。其它“R”基团可以是不参与水解的有机残基，如甲基苯氧基基团或其它在Allcock et al. ,Macromolecule 10 =824(1977)的科学论文中示出的基团。该水凝胶材料的合成方法以及用于制备这种水凝胶的方法在本领域中是已知的。制剂中也可包括其它组分，包括但不限于下列组分中的任何一种(1)用来提供适当PH和等渗压性的缓冲剂；(2)润滑剂；(3)用来在给予部位或附近保持该细胞的粘性材料，包括例如藻酸盐、琼脂和植物胶；以及(4)可以在给予部位产生预期效应的其它细胞类型，例如组织或其物化特性形成的增强或修饰，或者作为用于细胞生存的支撑物，或者抑制炎症或排斥。这些细胞可以用一种适当的创面覆盖物加以覆盖以防止细胞离开该部位。 这样的创面覆盖物对于本领域的熟练技术人员是已知的。骨组织补片的配制MEMPs在预成型孔中的培养或共培养使得能够制造预定厚度和体积的组织补片。 所得组织补片的体积取决于孔的体积和该孔中MEMPs的数量。最佳预定体积的组织可通过改变前述参数中的一个或两个而以常规实验进行制备。孔的细胞接触表面可以涂覆一种阻碍MEMPs粘附至该细胞接触表面的分子。优选的涂覆剂包括硅基试剂，即二氯二甲基硅烷，或聚四氟乙烯基试剂，即TEFLON。用于将材料涂覆硅基试剂，特别是二氯二甲基硅烷的流程步骤在本领域是熟知的。参见，例如Sambrook et al. (1989) “ Molecular Cloning A Laboratory Manual " , Cold Spring Harbor Laboratory I^ress，其内容结合于此作为参考。应当理解，阻止细胞附着于孔表面的其它生物相容性试剂在本发明的实践中可能很有用。可替代地，该孔可由一种柔韧性或可塑性生物相容材料(其本身不允许细胞附着)铸成。阻止这种细胞附着的优选材料包括但不限于琼脂糖、玻璃、未处理的细胞培养塑料和聚四氟乙烯(即TEFLON)。未处理的细胞培养塑料，即还没有用具有静电荷的材料处理或由其制成的塑料是商业上可获得的，并且可从例如i^alcon Labware,Becton-Dickinson, Lincoln Park, N.J.购得。然而，前述材料不用于限制的目的。应当理解，本身可阻止MPC 或其衍生后代附着的任何其它柔韧性或可塑性生物相容材料在本发明的实践中可能很有用。悬浮液中的MEMPs可以接种到预成型孔中并进行培养。MEMPs可以在该孔的培养基中被诱导分化成成软骨或成骨表型，或可能在接种到孔中之前已被诱导分化。可通过加入培养基而将细胞稀释到细胞密度为约IxlO5至IxlO9个细胞/毫升。这些细胞可以形成一种细胞的内聚塞(cohesive plug)。所述细胞内聚塞可以从该孔移出，经手术植入组织缺损中。预期未分化的MPC或其衍生后代可以原位分化，从而在体内形成组织。骨缺损可以通过利用计算机辅助层析成像(CAT扫描)、X射线检查、磁共振成像 (MRI)、滑液或血清标记物的分析，或通过本领域已知的任何其它工艺步骤而进行推理鉴定。哺乳动物中的缺损在关节镜检查或开放性手术过程中也易于肉眼鉴定。该缺损的治疗可利用本文中披露的方法和组合物在关节镜检查或开放性手术过程中实现。因此，一旦该缺损被鉴定，则该缺损可通过以下步骤进行治疗(1)在预定部位手术植入利用本文所述方法学制备的组织补片，以及( 允许该组织补片整合入预定部位处。该组织补片具有的最适大小和形状可使得当该补片被植入所述缺损中时，植入的组织的边缘直接接触该缺损的边缘。另外，可在手术过程中将该组织补片固定于适当位置。 这可以通过手术将该补片利用生物可降解的缝固定入所述缺损中和/或通过将生物粘合剂施加于该补片和缺损的分界区域而实现。在某些情况下，损伤的组织可以在该组织补片植入前手术切除。利用支架移植MEMPs本发明的细胞组合物或其共培养物可以接种到一个三维支架上或其内部并植入体内，其中接种的细胞将在该框架上增殖并与患者的细胞共同在体内形成置换组织，如骨组织。例如但不限制地，该支架可以被设计，以使该支架结构(1)在没有后续降解的情况下支撑接种的细胞；( 从接种直至该组织移植物由宿主组织重建的时间内支撑这些细胞；( 允许接种的细胞附着、增殖并在体外发育成具有足够机械整体性以支撑其自身的组织结构，此时该支架被降解。支架设计的综述由Hutmacher，J. Biomat. Sci. Polymer Edn.，12(1) :107-124(2001)提供。本发明的支架可联合任意一种或多种生长因子、细胞(例如，干细胞，骨髓细胞， 软骨细胞，成软骨细胞，骨细胞，成骨细胞，破骨细胞，骨衬细胞，或它们的前体)、药物或上述的刺激组织形成或其它方式增强或改进本发明实践的其它组分一起给予。待接种于该支架上的MEMPs可进行遗传改造以表达生长因子或药物。本发明的细胞可用来在体外产生新的组织，其随后可被植入、移植或以其它方式插入患者需要组织修复、置换或加强的部位。在一个非限制性具体实施方式
中，本发明的细胞用来在体外产生三维组织构建体，其随后植入体内。作为产生三维组织构建体的一个实例，参见第4，963，489号美国专利，其内容结合于此作为参考。例如，本发明的细胞可“接种”到一个三维框架或支架上，并在体外增殖或生长，以形成可植入体内的活组织。本发明的细胞可在培养皿内自由生长至亚融合或融合，从培养基转移接种于三维框架上。利用高浓度细胞(例如，约IO6至切107个细胞/毫升)接种该三维框架将实现在相对较短的时间周期内建立三维支撑物。可用于本发明的支架实例包括无纺垫、多孔泡沫或自组装肽。无纺垫可以是例如利用由合成的乙醇酸和乳酸的可吸收共聚物(PGA/PLA)构成的纤维形成，该共聚物以商标名VICRYL出售。由例如利用诸如冷冻干燥或冻干过程(如在美国专利第6，355，699中论述的)形成的聚(ε -己内酯)/聚(乙醇酸)(PCL/PGA)共聚物构成的泡沫也是可能的支架。也可以使用诸如自组装肽(例如，RAD16)的水凝胶。这些材料经常用作用于组织生长的支撑物。三维框架可由陶瓷材料制成，其包括但不限于磷酸一钙、磷酸二钙、磷酸三钙、磷酸α三钙、磷酸β三钙和磷酸四钙；羟磷灰石；氟磷灰石；硫酸钙；氟化钙；氧化钙；碳酸钙；磷酸钙镁；生物学活性玻璃如 BIOGLASS(University of Florida, Gainesville, Fla.) 及其混合物。目前在市场上存在多种合适的多孔生物相容性陶瓷材料，如SURGIBON(Unilab Surgibone, Inc. , Canada)、END0B0N(Merck Biomaterial France, France)、CEROS(Mathys, A. G. , Bettlach, Switzerland)禾口 INTERPORE (Interpore, Irvine, Calif. , United States), 以及矿化胶原骨嫁接产品，如 HEALOS(Orquest，Inc.，Mountain View, Calif.)和 VIT0SS， RHAK0SS,以及C0RT0SS (Orthovita，Malvern, Pa.)。该框架可以是天然和/或合成材料的混合物、掺合物或复合物。在一些具体实施方式
中，该支架为笼子形式。在一个优选具体实施方式
中，该支架涂覆有胶原。根据一个优选的具体实施方式
，该框架是毡制品，其可由多纤维丝(复丝)构成， 而该多纤维丝由生物可吸收材料，例如PGA、PLA、PCL共聚物或掺合物或透明质酸制成。该纤维丝利用标准的织物加工技术(包括卷边、剪切、梳理和缝制)制成毡制品。
在另一个优选的具体实施方式
中，本发明的细胞被接种于可为复合结构的泡沫支架上。另外，该三维框架可以被模制成有用的形状，如为耳朵外部、骨、关节或体内待修复、 置换或加强的特定结构的形状。在另一个优选的具体实施方式
中，这些细胞被接种到构成用于植入患者体内的假体装置的框架上，如描述于第6，200, 606号美国专利中的，其内容并入本文作为参考。如其中所描述的，多种临床有用的假体装置已被开发用于骨和软骨嫁接手术。(参见例如，Bone Grafts and Bone Substitutions. Ed. Μ. B. Habal & A. H. Reddi，W. B. Saunders Co.，1992)。 例如，有效的膝关节和髋关节置换装置已被且将持续广泛用于临床环境中。许多这些装置是利用各种具有较低免疫原活性的无机材料制造的，其在体内安全地发挥作用。已经过试验证实的合成材料的实例包括钛合金、磷酸钙、陶瓷羟磷灰石以及各种不锈钢和钴-铬合金。这些材料提供结构支撑并且可形成宿主血管形成和细胞迁移可在其内部发生的支架。该框架可以在接种本发明的细胞之前加以处理以便增强细胞附着。例如，在用本发明的细胞接种之前，尼龙基质可用0. 1摩尔乙酸加以处理并在多聚赖氨酸、PBS和/或胶原中孵育以涂覆该尼龙基质。聚苯乙烯可利用硫酸类似地加以处理。另外，该三维框架的外部表面可加以修饰以改善细胞的附着或生长以及组织分化，如通过等离子喷涂的框架或加入一种或多种蛋白质(例如，胶原，弹力纤维，网状纤维)、糖蛋白、糖胺聚糖(例如，硫酸肝素，4-硫酸软骨素，6-硫酸软骨素，硫酸皮肤素，硫酸角质素)、细胞基质和/或其它材料如但不限于明胶、藻酸盐、琼脂、琼脂糖和植物胶，等等。在一些具体实施方式
中，该支架由可使其为非血栓形成性的材料构成或用该材料进行处理。这些处理和材料也可促进并维持内皮生长、迁移和胞外基质沉积。这些材料和处理的实例包括但不限于天然材料如基膜蛋白如层粘连蛋白和IV型胶原，合成材料如 ePTFE，以及分段的聚氨酯脲硅酮如 PURSPAN(The Polymer Technology Group, Inc., Berkeley, Calif.)。这些材料可进一步加以处理以使该支架为非血栓形成性的，这些处理包括抗血栓形成剂如肝素，以及改变该材料表面电荷的处理如等离子喷涂。在一些具体实施方式
中，支架的表面是粗糙的。例如，在本发明的某些方面，所提供的支架带有一种凹槽和山脊纹型。该凹槽优选小于约500微米，较优选小于约100微米， 并且最优选在约10纳米与10微米之间。这样的“微槽”允许细胞可以根据表面凹槽的引导进行排列和/或迁移。在一些具体实施方式
中，在培养基中再造体内存在的细胞微环境很重要，以使本发明的细胞在植入体内或在体外应用之前的生长程度可以变化。另外，可以在这些细胞接种之前、过程中或之后将生长因子、软骨形成分化诱导剂、成骨诱导剂以及血管形成因子加入培养基中，以引发利用MPC或其衍生后代或其共培养物的分化和组织形成。该三维框架可以被修饰以使细胞的生长和其上的组织产生增强，或使得对植入物的排斥减弱。因此，可以将一种或多种生物学活性化合物(包括但不限于抗炎剂、免疫抑制剂或生长因子)添加到该框架。胞外基质或细胞溶解产物的治疗应用作为本发明植入这些细胞或其产生的活组织的可替代方案，需要组织修复、置换或加强的患者可获益于MEMPs的组分或产物的给予(尤其是在它们已经过遗传修饰的情况下)，如由这些细胞产生的胞外基质(ECM)或细胞溶解产物。
在一些具体实施方式
中，本发明的细胞已在体外培养后，例如通过利用本文描述的三维支架系统，使得希望量的ECM分泌到该框架上。一旦ECM分泌到该框架上，即可移出这些细胞。ECM可以进一步处理以备后用，例如作为一种可注射的制剂。在一些具体实施方式
中，这些细胞被处死并且将细胞碎片(例如，细胞膜)从该框架移出。这个过程可以多种不同方式实施。例如，活组织可在没有低温保存剂(低温防腐剂)时在液氮中被闪冻，或者该组织可被浸入无菌蒸馏水中，以使这些细胞响应于渗透压而破裂。一旦这些细胞被处死，则细胞膜可被破坏并且通过用温和去垢剂漂洗(如EDTA、 CHAPS或两性离子去垢剂)处理而移出细胞碎片。利用温和去垢剂漂洗的优点在于其溶解膜结合的蛋白(其经常是高度抗原性的)。可替代地，该组织可被酶促消化和/或用破碎细胞膜的试剂进行提取。这种酶的实例包括但不限于透明质酸酶、分散酶(中性蛋白酶)、蛋白酶、核酸酶(例如，脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶)。去垢剂的实例包括非离子去垢剂例如烷基芳基聚醚醇 (TRIT0NTMX-100)，辛基苯氧基聚乙氧基-乙醇(Rohm and Haas Philadelphia, Pa.), BRIJ-35，聚乙氧基乙醇月桂酰醚(Atlas Chemical Co. , SanDiego, Calif.)，聚山梨酸酯 20 (TWEEN 20 )，聚乙氧基乙醇山梨聚糖单月桂酸酯(Rohm and Haas)，聚乙烯月桂酰醚 (Rohm andHaas)；以及离子去垢剂例如十二烷基硫酸钠，硫酸化高级脂肪醇，在支化或未支化链中含有7至22个碳原子的磺酸化烷烃和磺酸化烷基芳烃。包含ECM的支架可以如上所述在治疗上使用。可替代地，ECM可从该支架收集。 ECM的收集可以以多种方式来实现，取决于例如该支架为生物可降解的还是非生物可降解的。例如，如果该框架为非生物可降解的，则ECM可通过使该框架经受声波降解、高压水射流、机械刮取或者用去垢剂或酶的温和处理或上述处理的任意组合而移出。如果该框架是生物可降解的，则ECM可通过例如使该框架在溶液中降解或溶解而收集。可替代地，如果该生物可降解框架由一种其自身可与ECM —起注射的材料构成，则该框架和ECM可全部加工用于随后的注射。可替代地，ECM可通过用于从非生物可降解框架收集ECM的上述方法中的任何一种从该生物可降解框架移出。优选地，所有收集工艺加以设计，以便不会使由本发明的细胞所产生的ECM或细胞溶解产物变性。现在，将参考以下非限制性实施例对本发明的具体实施方式
进行详细描述。材料和方法患者，细胞培养和抗体按照由南澳大利亚皇家阿德莱德医院的伦理委员会(theethicscommittee of the Royal Adelaide Hospital, South Australia)批准的方法步骤，在知情同意后，骨髓(BM)吸出物获自正常成人志愿者Q0-35岁)的后髂嵴。Bone marrow mononuclear cells (BMMNC) were obtained by centrifugation over Ficoll 1.077g/ml(Lymphoprep, Nycomed,Oslo,Norway)at 400g for 30 minutes(min)and then washed and resuspended with Hank ' s buffered saline solution containing 1 % bovine serum albumin and IOmM HEPES, pH 7. 35 (HBSS).。原代BMSSC培养物如前所述在补充了 20%胎牛血清、 2mM L-谷氨酰胺和100 μ M L-抗坏血酸-2-磷酸盐的α-MEM(最小必需培养基)中建立 (Gronthos et al. J Cell Sci. 116 :1827-1835,2003) 如下所述，在血清充足的培养基中传代培养后，BMSSC克隆细胞系通过从第14天的集落(来源于STR0-lto7VCAM-l+分选的细胞)的限制性稀释而形成，用于增殖、RT-PCR、免疫组织化学和发育研究。STR0-1抗体可从R&D Systems购得(Minneapolis，US)。其他在本发明中很有用的抗体列于表1中。磁激活的细胞分选(MACS)可如前所述而实施(Gronthos et al. , Isolation, Purification and In Vitro Manipulation of Human Bone Marrow Stromal Precursor Cells. In Marrow Stromal Cell Culture. Owen M. and Beresford J. N. (eds). Cambridge University Press UK, Chapter 3, p. 26-42,1998 ；Gronthos and Simmons, Blood 85(4) :929_940，1995)。大约 IxlO8 BMMNC与终浓度10 μ g/ml的STR0-1上清液在冰上共孵育60分钟。标记了 STR0-1 的细胞用HBSS洗涤，分别重悬于Iml含1/50稀释的生物素化的羊抗鼠IgM(y-链特异； Southern Biotechnology Associates,Birmingham, AL)或者生物素化的羊抗鼠 IgG( γ-链特异；SouthernBiotechnology Associates,Birmingham, AL)的 HBSS，冰上 45 分钟。随后， 细胞在MACS缓冲液中洗涤两次，重悬于其中加入100 μ 1抗生蛋白链菌素微珠(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, F. R. G.)的 900 μ 1 MACS 缓冲液中。所述细胞在冰上孵育 15 分钟后，将抗生蛋白链菌素-荧光素异硫氰酸酯(盐)(FITC)直接加入悬浮液，再放置5分钟。按照制造商的说明，细胞在Mini MACS磁性柱(柱容量IO7个细胞，Miltenyi Biotec) 上分离。荧光激活的细胞分选(FACS)将STRO-Γ MACS分离的细胞用轭合抗生蛋白链菌素的FITC进行标记，然后在冰上利用纯化的抗-⑶106 (VCAM-I)抗体6G10或抗-⑶146 (MUC-18)抗体或同型对照 lB5(10yg/ml)孵育30分钟，洗涤并在冰上用轭合藻红蛋白(PE)的羊抗-鼠IgG抗体 (1/50 ；Southern Biotechnology Associates， Birmingham， AL) # 胃 20 .中。禾Ij M FAC^tarpuis 流式细胞仪(Becton Dickinson, Sunnyvale, CA)来分选细胞。将 STRO-Itoi/ ⑶106+或STRO-Itoi/⑶146+细胞在在补充了 20%胎牛血清、L-谷氨酰胺2mM、抗坏血酸-2-磷酸盐(100 μ M)的α-MEM中进行培养，于含5% C02、37°C的湿润大气环境下启动原代培养。利用间接免疫荧光进行单色和双色流氏细胞计数分析这个步骤之前已经报道过(Gronthoset al. , Isolation, Purification and In Vitro Manipulation of Human Bone Marrow Stromal Precursor Cells. In Marrow Stromal Cell Culture. Owen M. and Beresford J. N. (eds). Cambridge University Press UK, Chapter 3，p. 26-42,1998)。简而言之，MPC或MPC衍生细胞的初代培养物通过胰蛋白酶/EDTA消化而释放，然后在冰上孵育30分钟。大约MlO5细胞被洗涤并重悬于200 μ 1第一抗体混合物中，冰上1小时。第一抗体混合物由饱和浓度的鼠IgM单克隆抗体STR0-1和 /或抗人碱性磷酸酶(ALP，B4-78)的鼠IgG单克隆抗体组成。对于利用与细胞内抗原反应的抗体进行的染色，细胞首先用PBS洗涤，然后用70%乙醇冰上处理10分钟以透化细胞，然后在染色前进行洗涤。鼠同型IgM和IgG阴性对照Mabs在相同条件下进行处理。用第一抗体孵育后，洗涤细胞并使其暴露于饱和水平的羊抗鼠IgM 链特异-FITC(1/50稀释) 以及羊抗鼠IgG Y-链特异-PE (1/50稀释)或羊抗兔Ig-特异-PE (1/50稀释)(Southern Biotechnology Associates)，终体积100 μ 1。细胞在冰上孵育45分钟后洗涤两次，然后在FAX FIX(补充了 (v/v)D-右旋糖、2% (w/v)0. 01 %叠氮化钠的PBS)中固定。随后细胞在Epics -XL-MCL 流氏细胞仪上进行分析(BeckmanCoulter，Hialeah, FL)。羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记细胞通透性荧光素基染料CFSE用来研究在MPC衍生细胞发育过程中分裂相关的表型和功能变化。CFSE共价结合于细胞的胞质组分，得到均勻的明亮荧光，其随细胞分裂而均等分布于子细胞之间。利用流式细胞仪，该技术可实现达8个细胞分裂周期的分辨率。 将体外扩增的MPC衍生细胞的单细胞悬浮液洗涤一次，再悬浮在Iml的PBS/0. BSA中， 加入2 μ 1的5mM CFSE (终浓度10 μ M)，然后在37°C孵育lOmin。通过加入5体积的冰冷培养基α -ΜΕΜ-10使染色淬火，并在冰上孵育5min。将这些细胞在培养基中洗涤三次，然后以低密度IxlO5铺于培养瓶(T-25)中。在各个时间点，通过胰蛋白酶-EDTA解离细胞并利用流式细胞计数进行分析。逆转录酶聚合物酶链式反应(RT-PCR)分析如上所述，原代MPC衍生培养物通过胰蛋白酶/EDTA处理而释放，然后用 STR0-1上清液染色。洗涤后，将细胞与轭合藻红蛋白的羊抗鼠IgM抗体(1/50 ； Southern Biotechnology Associates,Birmingham, AL) 一起在冰上再孵育 20 分钟。利用 FAC^tarpuis 流式细胞仪(Becton Dickinson, Sunnyvale, CA)分选细胞。根据制造商的建议，从hlO6个 STRO-Ibri或STRO-Idim分选的原代细胞、软骨细胞团以及其它诱导培养物制备细胞总RNA， 并利用RNAzoIB提取方法(Biotecx Lab. Inc. ,Houston,TX)使其溶解。从每一个亚群分离的RNA随后用作cDNA合成的模板，而cDNA利用First-strand cDNA合成试剂盒(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)制备。利用以前描述的一种标准流程(Gronthos et al.，J. Bone andMin. Res. 14 =48-57,1999)，通过PCR扩增评估各种转录体的表达。用于本研究中的引物对示于表2。扩增后，将每一个反应混合物通过1. 5%琼脂糖凝胶电泳进行分析并通过溴化乙锭染色使其可视化。RNA完整性通过GAPDH的表达来评估。CFU-F的体外分化我们之前已报道了用于诱导在补充了 10% FCSUOOyM L-抗坏血酸_2_磷酸盐、 地塞米松1(ΓΜ和3mM无机磷酸盐的α -MEM中培养的人BM基质细胞在体外形成矿化骨基质的条件(Gronthos etal.，Blood. 84 :4164_4173，1994)。矿物沉淀通过阳性 von Kossa 染色进行鉴定。脂肪形成如前所述在0.5mM甲基异丁基甲基黄嘌呤、0.5μΜ氢化可的松和60Mm吲哚美辛存在的情况下进行诱导(Gimble，J.M. Marrow stromal adipocytes. In Marrow stromal cell culture. Owen M. and Beresford J. N. (eds) · Cambridge :Cambridge University Press UK. Chapter 5，p. 67-87，1998)。油红 0 染色用来鉴定充满脂质的脂肪细胞。软骨形成分化如前所述在用10ng/mlTGF-i3 3处理的聚集培养物中加以评估 (Pittenger et al.，kience，284 143-147，1999)。骨形成的体内分析将来源于代2-3的STR0-lto7VCAM-l+细胞的粘附细胞胰蛋白酶化，与40mg羟磷灰石/磷酸三钙陶瓷颗粒(Zimmer Corporation, Warsaw, IN)进行混合，然后如前所述植入两月龄 SCID 小鼠的背侧皮下间隙中(Gronthos et al. ,Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), 97 (25) : 13625-13630，2000)。这些方法步骤依据一个批准的动物方案来实施(Adelaide University AEC#M/079/94)。将植入物在6-8周后取回，在4%多聚甲醛中固定2天，随后在10% EDTA中再脱钙10天，然后包埋入石蜡。制备该植入物的 5μπι切片并用苏木精和伊红进行染色(Gronthos et al.，Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), 97 (25) :13625_13630，2000)，用于组织学分析。神经组织发育。将单层培养物在成神经细胞A培养基(Ivitrogen/GIBCO+5%马血清，胎牛血清，L-谷氨酰胺OmM)，转铁蛋白(100yg/ml)，胰岛素Qyg/ml)，维甲酸 0.5mM，脑衍生的神经营养因子(lOng/ml))中进行培养。脂肪发育。将单层培养物在补充了 10%胎牛血清、L-谷氨酰胺2mM、抗坏血酸-2-磷酸盐(100 μ Μ)、0. 5mM甲基异丁基黄嘌呤、0. 5mM氢化可的松、60mM吲哚美辛的 α-MEM(JRH)中进行培养。软骨发育将在聚丙烯管中的颗粒培养物在补充了牛血清白蛋白、转铁蛋白 (100 μ g/ml)、胰岛素O μ g/ml)、L_谷氨酰胺QmM)、抗坏血酸_2_磷酸盐(100 μ M/ml)、地塞米松(IO^8M)和 BMP-7(50ng/ml)、TGF33(10ng/ml)的 α-MEM 中进行培养。骨骼肌/心肌发育。将单层培养物在补充了 10%胎牛血清、L-谷氨酰胺QmM)、 抗坏血酸-2-磷酸盐(100 μ M/ml)以及5-氮胞苷(5 μ M/ml)的α-MEM(JRH)中进行培养。上皮发育。将单层培养物在补充了牛垂体提取物(50yg/ml)、表皮生长因子 (lOng/ml)、氢化可的松(0.5 μ g/ml)、胰岛素(5 μ g/ml)的角化细胞基本培养基中进行培养。成骨细胞、腱、韧带或成牙本质细胞发育。将单层培养物在补充了 10%胎牛血清、 L-谷氨酰胺2mM、抗坏血酸-2-磷酸盐(100 μ M)、地塞米松(I(T7M)和ΒΜΡ-2 (50ng/ml)的 α-MEM(JRH)中进行培养。周细胞或平滑肌细胞发育。将体外培养的MPC培养物以20，000个/孔在补充了 10%胎牛血清、L-谷氨酰胺2mM、抗坏血酸-2-磷酸盐(100 μ M)、血小板源性生长因子-BB (10ng/ml)(悬浮于48孔板的200 1的基质胶(matrigel)中)的α -MEM(JRH)中进
行培养。实施例1 Atro-Idim培养细胞是较高定型的而Mro-Itoi细胞是较低定型的前体细胞。我们之前已报道了，多能间充质前体细胞(MPC)可根据STRO-Itoi/ VCAM-I (CD 106) + 或 STRO-ltoi/MUC_ 18 (CDl46) + 表型从成人骨髓单核细胞纯化(Gronthos et al. J. Cell Sci 116 1827—1835，2003;Shi and Gronthos JBMR 18(4) :696-704, 2003 ;PCTAU2004/000416)。在特定培养条件下MPC群体易于进行体外扩增(Gronthos et al. J.Cell Sci 116 :1827-1835, 2003) 0我们现在根据与不同细胞系相关的标记物，分别利用逆转录聚合物酶链反应(RT-PCR)和流式细胞计数分析在mRNA和蛋白质水平提供表征体外扩增的MPC后代的数据。同时，在体外扩增后，所有新鲜分离的骨髓MPC高水平表达 STR0-1 (Stro-Ibri)，而大多数细胞下调 STR0-1 表达(Stro-Idim) (Gronthos et al. J. Cell Sci 116:1827-1835,2003)。在首次系列实验中，采用半定量RT-PCR分析来检查各种由 STRO-Itum或STRO-Itoi群体表达的种系相关基因的基因表达谱，所述群体通过荧光激活细胞分选加以分离(图1A)。每个标记物的相对基因表达参照管家基因GAPDH的表达利用 ImageQant软件进行评估(图1B、C)。另外，双色流式细胞计数分析连同STR0-1抗体用来检查体外扩增MPC的蛋白质表达谱，这基于其更宽范围的细胞系相关标记物的表达(图2)。基于STRO-Idim和STRO-Itoi培养细胞的基因和蛋白质表达的通用表型概括展示于表3中。 该数据表明，体外扩增的STRO-Itoi MPC表现出与血管周细胞相关的标记物(包括血管生成素-1、VCAM-I、SDF-I、IL-I β、TNF α和RANKL)的差异性较高表达。相反地，STRO-Idim体外扩增细胞表达较高水平的nestin、GFAP, osterix、骨钙蛋白、S0X9、GATA-4、瘦素和平滑肌肌球蛋白重链。因此，相比于STRO-Idim细胞，似乎体外扩增的STRO-Itoi MPC表现为一种更不成熟和血管周样表型，而STRO-Idim细胞表现为一种较高定型的前体细胞型(包括成软骨细胞、成骨细胞、成脂肪细胞、表皮细胞、神经祖细胞和成心肌细胞)的表型特性。STRO-Idim 和STRO-Itoi培养细胞的蛋白质和基因表达谱之间的比较总结在表3、4和5中。新鲜分离的MPCs和MPCs的STRO-Itoi培养子代(MEMPs)之间标记物表达的比较示于表6中。实施例2 =STRO-Idim和STRO-Itoi培养细胞(MEMPs)在体外分化的差异能力接下来，我们考察了在STRO-Idim和STRO-Itoi培养细胞的基因和蛋白质表达谱之间观察到的差异是否反映其分化成多种细胞系的能力方面的任何功能性差异。体外扩增的 STRO-Itoi/⑶146+衍生细胞的培养物如上所述基于其STR0-1抗原表达而通过FACS进行分离。随后FACS分离的STRO-Idim和STRO-Ibri培养细胞置于用于脂肪(图3)、骨(图4)和软骨(图幻形成的诱导条件下。在所有情形下，相比于STRO-Idim培养细胞，STR0-lto4§ 养细胞在指定条件下，显示出较高的脂肪、骨和软骨形成的能力。来自这些实验的数据证实了以上获得的基因和蛋白表达结果，表明STRO-Itoi培养细胞是一种含有高比例较低定型的前体细胞的原始群体，其可被影响以在适当培养条件下朝向任何特定细胞系分化(图3、4、 5)，并且可以称为MPC。相反，STRO-Idim培养细胞含有高比例的代表各种种系的定型细胞并且可以称为TSCC。我们提出STRO-Itwm群体是异源性的，包含单独定型于一系列不同组织类型的细胞。实施例3 =STRO-Ibri细胞(MEMPs)可修饰体外和体内组织特异性定型细胞(TSCC) 的生长能力代表不同发育阶段的两种不同的体外扩增MPC衍生细胞群体的鉴定对于来源于 STRO-Ibri细胞的完全培养制备物应用于临床治疗具有重要启示。将最初研究设计为考察原始的较低定型的STRO-Itoi培养MPC对较成熟和定型STRO-Idim培养TSCC生长的影响。设计实验将FACS分离的STRO-Idim培养TSCC(其之前已用一种荧光标签CFSE进行标记)与百分比不断增加的FACS分离的STRO-Itoi培养MPC—起加入。图6示出了标记的STRO-Ito细胞的增殖受未标记的STRO-Itoi细胞存在的影响。当一个CFSE标记的细胞分裂时，两个子细胞含有亲细胞的一半荧光。因此，不同代的子细胞被表示为具有成比例不断降低的荧光强度的荧光分布，其中在直方图的最右方(垂线相交的)的曲线表示起始STRO-Idim群体的点(图6)。该数据表明，较高比例的STRO-Idim细胞被刺激以增加其增殖速率，其中可证实更多细胞在加入大于5% STRO-Itoi细胞后经历至少3至4次分裂。因此，为了获得未分裂 MPC衍生细胞的可持续且有效的体外扩增，应遵循该培养物需要多于5%的STRO-Itoi细胞存在于群体中。实施进一步考察以确定更原始的较低定型STRO-Itoi培养MPC是否也可以影响体内TSCC的增殖能力。两个体内模型用来解决这个问题。第一个模型采用无胸腺裸大鼠， 其进行了左前降支(LAD)冠状动脉的结扎并且在48小时后注射盐水、FACS分离培养的人 STRO-Itun^P STRO-Itoi细胞以及无STR0-1的骨髓单核细胞的新鲜吸出物(图7)。两周后，将动物处死，固定心脏组织并同时用两种单克隆抗体进行染色第一个与大鼠(而不是人) Ki67抗原选择性反应，第二个与心肌细胞标记物肌钙蛋白I反应。双重染色的细胞(表示增殖的大鼠心肌细胞)通过免疫过氧化物酶技术进行检测。与接受盐水或STRO-Idim人细胞的对照动物相比，接受STRO-Itoi人细胞的动物表现出2. 5-5倍较高数量的增殖大鼠心肌细胞(图7)。第二个模型利用无胸腺裸大鼠，其皮下注射了大鼠成胶质细胞瘤细胞，其组成性地分泌VEGF。两周后，该大鼠接受瘤内注射盐水、FACS分离的STRO-Idim或STRO-Itoi人细胞(图8)。一周后，将动物处死，固定肿瘤组织并同时用两种单克隆抗体进行染色第一个与平滑肌细胞表达的α平滑肌肌动蛋白抗原反应，第二个与脉管内皮细胞表达的vWF抗原反应。双重染色的结构(表示既含内皮又含平滑肌的微动脉和动脉)通过免疫过氧化物酶技术进行检测。与接受盐水或STRO-ItumA细胞的对照动物相比，接受STRO-Itoi人细胞的动物在肿瘤内的细胞注射部位处表现出3. 5-8倍较高数量的微动脉和动脉(图8)。在已注射人细胞处的远端部位处未观察到差异。实施例4 来源于STR0-1阳性细胞的细胞培养物中的STRO-ItoiMEMPs的数量增加在证实STRO-Itoi培养MEMPs促进更多TSCC增殖的能力之后，我们接下来考察了一系列生长因子增加体外扩增的STRO-ItoiMPC比例的作用(图9)。将已建立的来源于STR0-ltoi/tD146+分离的骨髓细胞的培养物在补充了 10% FCS(A)或一系列因子包括 IxlO-7M Ia ,25- 二羟基维生素 D3(1，25D)) (B)、10ng/ml 血小板源性生长因子(PDGF) (C)、 10ng/ml 肿瘤坏死因子 a (TNF- a ) (D) ； 10ng/ml 白介素-1 β (IL-1 β ) (E)以及 30ng/ml 基质衍生因子1-a (SDF-1 a ) (F)的基础培养基中培养5天，用STRO-ImAb进行染色(图9)。 发现这些因子极大地增加体外STRO-ItoiMPC的数量。为了研究这些因子如何在体外扩增后增高表达STRO-Itoi的细胞百分数的机制，将培养的Mro-Itoi如方法中所述用CFSE进行标记，然后暴露于各种因子。图10示出了一个代表性实验，其中IL-I β增加用CFSE标记(如方法中所述)的MPC的增殖能力。将细胞在lOng/ml IL-I β存在的情况下培养5天，用STRO-ImAb染色并如上所述进行分析。发现IL-I β通过增加亮STRO-Γ骨祖细胞的数量而增加MPC分裂的次数。1，25D、PDGF-BB, TNF- a、IL-I β和SDF-1 α用来刺激MPC时也可获得类似结果。实施例5 增加STRO-Itoi细胞的增殖也增加Mro-Idim细胞的数量在各种因子存在的情况下增加STRO-Itoi培养MEMPs比例的能力也与STRO-Idim 细胞的数量增加相关。例如，STR0-lto7AlkPhOS+(图10B)，一种与成骨前细胞一致的表型 (Gronthos et al.，JBone Miner Res. 14 :47-56,1999 ；Pan et al.，Bone 34(1) :112-23, 2004)。因此，我们考察了表型的这种变化是否也与诱导的STRO-ItoiMPC分化为骨形成细胞 (成骨细胞)的能力增加相关。图11示出了在骨诱导剂地塞米松存在的情况下，IL-I β不仅刺激STRO-I阳性MPC增殖，而且增强其骨形成能力。浓度为0.01叫/!111的11^10显著将MPC数量增加到未处理的对照培养物的136. 6士 1. 2% (图11Α)，在大于0. lng/ml的浓度下获得了平台效应。将体外扩增的MPC后代如方法中所述在骨诱导条件存在的情况下接种到M孔板中。这些细胞也用浓度为lOng/ml的IL-I β进行处理，每周给培养物“补充” 含IL-I β的新鲜培养基。根据所述方法确定绝对胞外基质钙浓度。结果表明，相比于未处理的细胞(图11Β)，用IL-I β处理的细胞(图11C)中矿物沉积增加。经IL-I β处理的细胞中钙水平在第4周和第6周显著高于未处理细胞的钙水平。图12中展示的数据表明，IL-I β刺激STRO-IfciMPC的增殖，引起骨祖细胞的扩增， 同时随后加入另一种分化试剂地塞米松，诱导碱性磷酸酶(ALP)表达和STR0-1表达丧失， 有效地提高体外功能性成骨细胞的数量。不同因子可扩增和调节STRO-ImMPC群体的概念进一步在体内进行测试。从Mro-ItoiMPC扩增的的半融合的体外继代培养物在存在或缺乏 PDGF-BB(10ng/ml)(另一种已知可增高体外扩增的STRO-IbhMPC数量的因子)下进行培养 (请参考图9C)。PDGF诱导的和非诱导的细胞制备物接着如方法中所述用羟磷灰石/磷酸三钙颗粒(HA/TCP)共移植到免疫缺陷的小鼠中。8周后，对收集的移植物进行研究表明，如通过kion Imaging量化的(图13A)，与未处理的对照培养物(图13B)相比，用PDGF-BB 预处理的培养物表现出显著较多的异位成骨(图13C)。实施例6 缺乏可检测的ALP表达的未定型STRO-ItoiMPC持续存在于STR0-1选择的BM衍生的MPC体外培养物中。人BM吸出物如方法中所述进行制备，MPC利用mAb STR0-1通过MACS分选而回收。利用间接免疫荧光和流氏细胞仪，评估MACS阳性部分(用来建立初始或PO培养物的细胞)中高水平表达STRO-I抗原(STRO-Itoight)的细胞比例，发现其占总群体的22. 4% (数据未显示)。然后这些细胞以IxlO4细胞/cm2进行接种，在无血清培养基中培养，直至其达到 80-90%的融合，如前所述的(Gronthos et al. Journal of Cell Science 116 1827-1835, 2003) 0每次传代时，细胞如方法中所述进行解离，并以IxlO4细胞/cm2进行再接种。每一代的细胞样品，对其STR0-1和TSCC标记物碱性磷酸酶(ALP)的表达进行染色。 如在图14中示出的，4次传代后，尽管高水平表达STR0-1的细胞(缺乏可评估水平的TSCC 标记物ALP)比例降至12. 7%，这些培养物仍然包含相当数量的STRO-Itoi ALPlffiMPs。表1 本专利中采用的抗体
权利要求
1.一种通过将TSCC与具Mro-ltoi、ALP_表型的MEMP共培养或通过将TSCC与从具有 Stro-Ibri,ALP"表型的MEMP获得的培养上清液、细胞裂解物或部分接触来刺激TSCC增殖的方法。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述MEMP以大于的水平与TSCC—起存在于共培养条件中。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述MEMP以大于5%的水平与TSCC—起存在于共培养条件中。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述MEMP以大于10%的水平与TSCC—起存在于共培养条件中。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述MEMP以大于20%的水平与TSCC—起存在于共培养条件中。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述MEMP以大于40%的水平与TSCC—起存在于共培养条件中。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的方法，其中所述TSCC在体外培养。
8.根据权利要求1到6中任一项所述的方法，其中TSCC与MEMP或来自MEMP的培养上清液、细胞裂解物或部分的共培养发生于接受者体外，且共培养的TSCC在体内被递送至所述接受者的组织部位。
9.根据权利要求1到6中任一项所述的方法，其中所述TSCC对于所述接受者是内源性的且位于组织部位的原位，并且所述TSCC的共培养在MEMP或来自MEMP的培养上清液、细胞裂解物或部分被递送到所述组织部位后发生于体内。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的方法，其中所述TSCC定型于组织类型，所述组织类型选自由骨、神经组织、脂肪、软骨、骨骼肌、心肌、上皮组织、成骨细胞、腱、韧带成牙本质细胞、周细胞、平滑肌、神经胶质组织、脉管组织、内皮组织、造血组织、肝组织和肾组织组成的组。
11.根据权利要求1到9中任一项所述的方法，其中所述TSCC为造血细胞。
12.一种用于富集具有Mro-ltoi、ALP—表型的MEMP的方法，所述方法包括在一种或多种刺激因子存在的情况下培养MPC或其子代，所述刺激因子选自由Ia，25_ 二羟基维生素 D3(1，25D)、血小板源性生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子α (TNF-α )、白介素-1 β (IL-1 β ) 和基质衍生因子1 α (SDF-1 α )组成的组。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述MPC或其子代在两种或多种刺激因子存在的情况下培养。
14.根据权利要求12或权利要求13中任一项所述的方法，其中所述MPC或其子代已经在体外被扩增。
15.根据权利要求12到13中任一项所述的方法，其中所述MPC是未扩增的分离MPC群体。
16.根据权利要求12到15中任一项所述的方法，其中，相对于未受刺激的对照，所述刺激引起具有Mro-Itoi、ALP_表型的MPC子代增加超过10%。
17.根据权利要求12到15中任一项所述的方法，其中，相对于未受刺激的对照，所述刺激引起具有Mro-Itoi、ALP_表型的MPC子代增加超过50%。
18.根据权利要求12到17中任一项所述的方法，其中所述MPC来源于任何一种或多种组织，其选自由骨髓、牙髓细胞、脂肪组织和皮肤组成的组，或者可能更广泛的来源于脂肪组织、牙齿、牙髓、皮肤、肝、肾、心、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、脾、淋巴结、胸腺、胰腺、骨、韧带、骨髓、腱和骨骼肌。
19.根据权利要求12到18中任一项所述的方法，其中所述MPC或其子代在一种或多种刺激因子存在的情况下在体内培养。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述刺激因子与包括MPC或其子代的细胞群体一起给予组织部位。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述方法进一步包括给予外源性TSCC。
22.—种产生组织特异性定型细胞群体的方法，所述方法包括在一种或多种刺激因子存在的情况下培养包括MPC或其子代和TSCC的细胞群体，所述刺激因子选自由Ia，25_ 二羟基维生素D3 (1，25D)、血小板源性生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子α (TNF- α )、白介素-1 β (IL_1 β )和基质衍生因子1 α (SDF-1 α )组成的组；以及使所述培养的群体处于使MPC或TSCC分化偏向于特异性组织类型的条件。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述组织类型选自由心肌、平滑肌、脉管组织、 骨组织、软骨组织、神经组织、脂肪组织、上皮组织和内皮组织组成的组。
24.—种包括MPC或其子代和刺激因子的组合物，所述刺激因子选自由1α，25_ 二羟基维生素D3(1，25D)、血小板源性生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子α (TNF-α )、白介素-1 β (IL-1 β )和基质衍生因子1 α (SDF-1 α )组成的组。
25.根据权利要求M所述的组合物，进一步包括TSCC。
26.根据权利要求M或权利要求25所述的组合物，进一步包括使TSCC或MPC或两者分化偏向于特异性组织类型的因子。
27.根据权利要求沈所述的组合物，其中所述组织类型选自由心肌、平滑肌、脉管组织、骨组织、软骨组织、神经组织、脂肪组织、上皮组织和内皮组织组成的组。
28.权利要求M到27中任一项所述的组合物在制造用于产生或修复组织的药物中的应用。
29.根据权利要求观所述的应用，其中所述组织选自由心肌、平滑肌、脉管组织、骨组织、软骨组织、神经组织、脂肪组织、上皮组织和内皮组织组成的组。
30.一种具有STRO-Itoi、ALP_表型的经分离的遗传修饰的MEMP。
31.根据权利要求30所述的经分离的遗传修饰的MEMP，其已经过遗传修饰以表达异种蛋白。
32.根据权利要求31所述的经分离的遗传修饰的MEMP，其中所述异种蛋白选自由Ia， 25-二羟基维生素D3 (1，25D)、血小板源性生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子α (TNF-α )、白介素-1 β (IL-1 β )和基质衍生因子1 α (SDF-1 α )、合成的糖皮质激素如地塞米松、或骨形态发生蛋白如BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-6或BMP-7组成的组。
全文摘要
本发明涉及多能扩增间充质前体子代(MEMP’s)，其特征在于早期发育标记物STRO-1bri和ALP。本发明还涉及用于生产MEMP’s的方法以及MEMP’s在治疗性应用中的用途。同时本发明提供了一种通过将TSCC与具Stro-1bri、ALP-表型的MEMP共培养或通过将TSCC与从具有Stro-1bri、ALP-表型的MEMP获得的培养上清液、细胞裂解物或部分接触来刺激TSCC增殖的方法。
文档编号C12N5/0775GK102391981SQ20111034907
公开日2012年3月28日 申请日期2005年9月26日 优先权日2004年9月24日
发明者安德鲁·克里斯托弗·威廉·赞内蒂诺, 斯坦·格龙托斯 申请人:成血管细胞系统公司