专利名称：一种维持鱼类肠细胞增殖分化的原代培养方法
技术领域：
本发明涉及一种动物肠细胞分离和培养方法，具体涉及一种鱼肠细胞分离、纯化和原代培养方法。
背景技术：
鱼类肠细胞为肠道主要功能性细胞，参与肠道营养物质的消化吸收、免疫屏障和应激反应等多种重要生理过程。同时，肠细胞还是增殖分化最快的一类细胞，对维持肠道黏膜上皮功能正常非常重要。由于神经、体液和许多类群细胞与肠细胞间存在广泛的相互作用，使体内试验研究肠细胞非常困难。而肠细胞体外培养研究模型为研究肠细胞增殖、分化凋亡，营养物质吸收利用及转化提供了准确的手段，是探讨营养物质对肠细胞营养作用机制、重金属及其它有毒有害物质对肠道损伤与肠道修复机制、筛选有益鱼类肠道健康的功能性饲料的理想模型。因此，依据肠细胞的生物学特点，建立体外鱼肠细胞培养研究模型， 对于各相关领域的研究非常重要。目前鱼类肠细胞原代培养已有研究。其方法是采用单一的胶原蛋白酶分离鱼肠细胞，利用鱼皮胶原蛋白为肠细胞贴壁支持物，在二氧化碳培养箱中培养。由于现有培养方法条件要求高，在科学试验研究中应用很少。主要问题表现在以下几个方面(1)现有的鱼肠细胞分离单一使用胶原蛋白酶，需要酶量较大，细胞损伤严重，产率低。肠细胞团比例小，肠细胞贴壁生长困难，细胞接种数量需要量大。因此，需要研究一种更有效的鱼肠细胞分离方法，使分离的肠细胞受损更小，细胞团比例大，增殖分化能力更强。(2)现有的鱼肠细胞贴壁培养方法使用鱼皮胶原蛋白涂抹促进肠细胞贴壁，由于鱼皮胶原蛋白制作程序繁复，无商品试剂购买，实践使用比较困难。因此，需找一种更方便的涂抹材料，以保证接种鱼类肠细胞的贴壁生长效果更好。(3)现有鱼肠细胞原代培养方法采用二氧化碳培养箱进行培养，易受污染，使得培养操作过程比较复杂。因此，寻找一种更为简便的培养方法非常必要。(4)谷氨酰胺是细胞体外培养生长的重要营养物质之一。由于鱼类对谷氨酰胺的代谢利用与陆生温血动物相比差异很大。因此，有必要优化调整谷氨酰胺的使用量。故本研究主要致力于建立简便有效的鱼肠细胞分离和方法，以供研究鱼肠细胞增殖分化和代谢等的需要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种简便有效鱼类肠细胞的分离和原代培养方法。为了解决上述技术问题，本发明提供一种鱼类肠细胞分离和原代培养方法，依次包括以下步骤1、按常规方法将鱼体表消毒，无菌取出整个内脏，去除肠道表面的系膜组织，洗净
3肠道内容物。2、用眼科剪将肠道剪切成2 3mm的组织小块。3、用胶原酶和中性蛋白酶混合液消化分离肠细胞，得到鱼肠细胞和细胞团。4、用离心方法分离纯化得到鱼肠细胞团。5、将分离纯化的鱼肠细胞团计数接种于胶原蛋白涂抹的培养板中进行培养。6、接种的鱼肠细胞团在M 条件下原代培养，细胞贴壁生长，增殖分化。作为本发明的鱼肠细胞体外培养方法的改进步骤幻肠细胞消化分离处理包括以下内容A、混合酶消化液中胶原蛋白酶XI浓度为50IU/ml，中性蛋白酶I浓度为20ug/ ml οB、肠道组织小块与混合消化液的质量体积比大约为1 10。C、组织小块消化液温度为25°C恒温摇床中，100转/分振荡消化70分钟。作为本发明的鱼肠细胞体外培养方法的改进步骤4)肠细胞团的分离纯化包括以下内容用S-DMEM液(含3. 5%山梨醇的DNEM培养液)洗涤分离纯化得到的细胞团。作为本发明的鱼肠细胞体外培养方法的改进步骤幻肠细胞团的适宜接种数量处理包括以下内容A、利用商品胶原蛋白涂抹细胞培养器皿。B、将分离到的细胞团悬液稀释后在血细胞计数板上计数，以350个细胞团/平方厘米的浓度接于胶原蛋白包被的培养器皿。作为本发明的鱼肠细胞体外培养方法的改进步骤6)肠细胞团的培养条件处理包括以下内容A、培养温度以25 为宜。B、所用细胞生长培养液含2. 5%胎牛血清，10yg/ml胰岛素，40μ g/ml转铁蛋白，1. lmg/ml谷氨酰胺，3. 7g/L碳酸氢钠，200IU/ml青霉素，200IU/ml链霉素的DMEM培养液。C、培养液中加入lOmmol/1 Hepes维持pH稳定，密闭培养细胞。与现有技术相比，本发明的鱼肠细胞原代培养方法具有以下明显的优点1、本发明首次提出用混合酶液消化分离鱼类肠细胞的方法。2、本发明根据鱼类肠道组织结构特点，摸索了最佳的鱼肠细胞分离酶的种类、使用浓度和肠细胞团的纯化方法。3、采用商品胶原蛋白涂抹方便涂抹细胞培养器皿，摸索了最佳的鱼肠细胞接种和密闭培养条件。4、本发明所述的培养条件和方法，能够帮助初次进行细胞培养的研究人员，比较顺利的完成鱼类肠细胞的分离和原代培养。
图1分离良好的鲤鱼肠细胞团；分离的肠细胞团结构完整，数量多，所占比大。图2接种时的鲤鱼肠细胞团；细胞团和细胞已附着在培养器皿的胶原大白涂抹层上。
图3接种培养160小时后生长良好的鲤鱼肠细胞形态；细胞数迅速增加，形成单层并融合成片，为典型的上皮型细胞。图4不同浓度谷氨酰胺对鱼肠细胞增殖的影响。谷氨酰胺能促进鱼肠细胞增殖， 各处理组细胞增殖率分别为35. 24%,81. 53%U08. 07%U16. 56%和114. 65%。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。以下实施例中所用生长培养液的具体配方为01^11培养基，2.5%胎牛血清， 10 μ g/ml胰岛素，40μ g/ml转铁蛋白，1. lmg/ml谷氨酰胺，3. 7g/L碳酸氢钠，200IU/ml青霉素，200IU/ml链霉素。其配制方法如下在200ml DMEM培养基中加入5ml标准胎牛血清、0. 2mg胰岛素、0. 4mg转铁蛋白、220mg谷氨酰胺、0. 84g碳酸氢钠、40000IU的青霉素、 40000IU的链霉素。实施例1 一种鱼肠细胞分离和原代培养方法，依次进行以下步骤1、将体重50克左右鲤鱼2尾，去头，破坏脊髓。体表用75%酒精棉球常规擦拭灭菌，用眼科剪开腹腔，取出整个内脏，放入一个盛有30ml Hanks液的培养皿中。2、用不锈钢小镊子将肠道分离出来，剪取肠道从肠球后面到肠道最后一个自然折前面所有的部分，放入盛有30ml Hanks液的培养皿，小心去除肠道表面的系膜组织，后用注射器将肠腔冲洗干净。3、称重冲净后的肠道组织，然后用眼科剪剪切成2 3mm的组织小块。用Hanks液将冲洗肠道组织小块冲洗干净后，移到50毫升的细胞培养瓶，待到组织小块沉淀下来后， 移去多余的Hanks液，得到大约3g组织小块。4、加入30ml混合消化液，混合消化液中胶原蛋白酶XI为50IU/ml，中性蛋白酶I 为20ug/ml，并加入30000IU青霉素，30000单位链霉素，于25 °C恒温摇床中，振荡器转速 100转/分，振荡消化70分钟。不同消化酶浓度所对应的消化结果如表1所示表1 不同消化酶浓度分离细胞、细胞团的比例(％ )
胶原蛋白酶XI(U/ml)中性蛋白酶I(20ug/ml)细胞细胞团30010088121506083178040802050207030 不同浓度消化试验确定其最佳消化酶浓度为胶原蛋白酶XI为50IU/ml，中性蛋白酶 I 为 20ug/ml。 5、轻轻反复吹打消化后的组织块3分钟后，用15毫升S-DMEM液(含3. 5%山梨醇的DNEM培养液)洗涤分离消化细胞培养瓶中的残留物，将洗液转移到50ml离心管中，盖好盖子，1000转/分离心5分钟。图1示分离良好的鲤鱼肠细胞团。
6、离心结束后，移去上清液，加入30毫升S-DMEM液将沉淀细胞团轻轻吹打均勻， 静置1分钟，待管内未消化的组织块全部沉降后，轻轻将悬浮有细胞团的上清液移入50ml
离心管中。7、重复用S-DMEM液提取消化产物中的细胞团7_8次，每次用10毫升S-DMEM液， 直到上清液变得清亮，最后将离心管中未消化的组织块沉淀弃去。8、将收集的上清液250g离心^iin后，去上清液，用30ml S-DMEM液将离心后的细胞团沉淀重新悬浮，轻弹离心管底部，使细胞团分散均勻后，再250g离心％iin，重复洗涤离心6次。9、分离得到的细胞团沉淀用IOml生长培养液(添加lOmmol/1 Hepes)重新悬浮。 移取细胞团悬液20μ 1，稀释后在倒置显微镜下进行细胞团计数。根据细胞团的计数结果， 以350个细胞团/平方厘米的浓度接于商品胶原蛋白包被的M孔培养板(涂抹商品胶原蛋白)中。不同接种数量的肠细胞团对肠细胞分化成熟的影响见表2。不同接种浓度试验确定其最佳接种浓度为350个细胞团/平方厘米。表2不同接种数量的肠细胞团对肠细胞分化成熟的影响
细胞团接种数量(个/CM2)502003505006508009501100肠细胞AKP活性(U/MTT0D)0. 0020. 0130. 0150. 0140. 0120. 0100.0040.00510、将接种好的培养板放在倒置显微镜的载物台上(温度为25 )，整体观察细胞培养板每一孔细胞团的数量和分布情况，并作描述和照相记录，从中随机选择六个细胞团，用记号笔在培养板上作上标记，定位观察细胞团分散贴壁生长的过程。图2示接种时的鲤鱼肠细胞团。11、接种培养96小时后，将培养板每孔中的细胞培养液、细胞碎片和未贴壁的细胞一并移出，细胞培养板的每一孔中加入200 μ 1 DMEM培养液，轻轻振荡洗涤1次，移出洗涤液后，每孔中加入新的生长培养液lml，在相同条件下继续培养，或并根据不同实验需要利用培养的细胞进行试验。图3示接种培养160小时后生长良好的鲤鱼肠细胞形态。不同浓度谷氨酰胺对鱼肠细胞增殖的影响见图4。不同浓度谷氨酰胺对鱼肠细胞增殖的影响试验结果确定其最佳浓度为1100mg/L。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.一种维持鱼类肠细胞增殖分化的原代培养方法，其特征在于，包括以下步骤1)、按常规方法将鱼体表消毒，无菌取出整个内脏，去除肠道表面的系膜组织，洗净肠道内容物；2)、将肠道剪切成2 3mm的组织小块；3)、用混合液消化分离肠细胞，得到鱼肠细胞和细胞团；4)、用离心方法分离纯化得到鱼肠细胞团；5)、将分离纯化的鱼肠细胞团计数接种于胶原蛋白涂抹的培养板中进行培养；6)、接种的鱼肠细胞团在24 ^TC条件下原代培养，细胞贴壁生长，增殖分化。
2.根据权利要求1所述的原代培养方法，其特征在于，所述步骤3)肠细胞消化分离处理包括以下内容A、混合酶消化液中胶原蛋白酶XI浓度为50IU/ml，中性蛋白酶I浓度为20ug/ml；B、肠道组织小块与混合消化液的质量体积比大约为1 10;C、组织小块消化液温度为25°C恒温摇床中，100转/分振荡消化70分钟。
3.根据权利要求1所述的原代培养方法，其特征在于，所述步骤4)肠细胞团的分离纯化包括以下内容用S-DMEM液(含3. 5%山梨醇的DNEM培养液)洗涤分离纯化得到的细胞团。
4.根据权利要求1所述的原代培养方法，其特征在于，所述步骤5)肠细胞团的适宜接种数量处理包括以下内容A、利用商品胶原蛋白涂抹细胞培养器皿；B、将分离到的细胞团悬液稀释后在血细胞计数板上计数，以350个细胞团/平方厘米的浓度接于胶原蛋白包被的培养器皿。
5.根据权利要求1所述的原代培养方法，其特征在于，所述步骤6)肠细胞团的培养条件处理包括以下内容A、培养温度25 ；B、所用细胞生长培养液含2.5%胎牛血清，10yg/ml胰岛素，40μ g/ml转铁蛋白， 1. lmg/ml谷氨酰胺，3. 7g/L碳酸氢钠，200IU/ml青霉素，200IU/ml链霉素的DMEM培养液；C、培养液中加入lOmmol/1Hepes维持pH稳定，密闭培养细胞。
全文摘要
本发明公开了维持鱼类肠细胞增殖分化的原代培养方法，包括以下步骤1)、按常规方法将鱼体表消毒，无菌取出整个内脏，去除肠道表面的系膜组织，洗净肠道内容物；2)、将肠道剪切成2～3mm的组织小块；3)、用混合液消化分离肠细胞，得到鱼肠细胞和细胞团；4)、用离心方法分离纯化得到鱼肠细胞团；5)、将分离纯化的鱼肠细胞团计数接种于胶原蛋白涂抹的培养板中进行培养；6)、接种的鱼肠细胞团在24～26℃条件下原代培养，细胞贴壁生长，增殖分化。本发明根据鱼类肠道组织结构特点，摸索了最佳的鱼肠细胞分离酶的种类、使用浓度和肠细胞团的纯化方法。采用商品胶原蛋白涂抹方便涂抹细胞培养器皿，摸索了最佳的鱼肠细胞接种和密闭培养条件。
文档编号C12N5/071GK102382795SQ20111034882
公开日2012年3月21日 申请日期2011年11月8日 优先权日2011年11月8日
发明者冯琳, 刘扬, 周小秋, 姜俊, 姜维丹, 胡凯 申请人:四川农业大学