Egfr基因的多态性检测用探针、扩增用引物及其应用的制作方法

专利名称：Egfr基因的多态性检测用探针、扩增用引物及其应用的制作方法
EGFR基因的多态性检测用探针、扩增用引物及其应用相关申请的交叉引用本申请要求享有以2010年10月四日提交的日本专利申请号2010-244643为基础的优先权，该申请的全部公开内容通过引用并入本文。
背景技术：
本发明涉及EGFR基因的多态性检测用探针、扩增用引物及其应用。表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor :EGFR)是表皮生长因子(EGF)的酪氨酸激酶受体。已知，EGFR在多种实体癌中高度表达，其过表达与癌症的恶性程度或预后相关联。因此，例如，将吉非替尼等EGFR的酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)作为癌症治疗药物使用。但是，患者中，既有通过吉非替尼肿瘤缩小效果得以提高的情形，也有出现了对吉非替尼的耐药性而无法获得治疗效果的情形。并且，近年，已有研究表明对这类药剂的敏感度与EGFR的突变相关(PLoS Medicine, 2005年，Vol. 2，No. 3，p. 225-235和 Journal of Clinical Oncology，2005 年，Vol. 23，No. 11，ρ·2513-2520)。已知上述突变例如是EGFR的第790位和第858位上的替换突变，EGFR基因外显子 19 中的缺失突变(PLoS Medicine, 2005 年，Vol. 2，No. 3，p. 225-235 和 Journal of Clinical Oncology，2005 年，Vol. 23, No. 11, p. 2513-2520)。上述第 790 位上的突变是EGFR 的第790位氨基酸苏氨酸⑴被替换为甲硫氨酸(M)的突变，序列编号21所示的EGFR基因的部分序列中，第347位碱基胞嘧啶(c)被替换为胸腺嘧啶(t)。上述第858位上的突变是EGFR的第858位氨基酸赖氨酸(L)被替换为精氨酸(R)的突变，序列编号1所示的EGFR 基因的部分序列中，第261位碱基胸腺嘧啶(t)被替换为鸟嘌呤(g)。上述EGFR基因外显子19中的缺失突变是上述外显子19中连续几个到十几个碱基缺失的突变，序列编号2所示的EGFR基因的部分序列中，例如，第112-164位碱基中的任何碱基缺失。因此，如果能检测出EGFR基因中有无这样的突变，在治疗前评价对吉非替尼的敏感度，会使更为有效的个体化癌症治疗成为可能。另一方面，已报道了多种检测基因多态性的方法，例如PCR_RFLP(限制性片段长度多态性，Restriction Fragment Length Polymorphism)法等。但是，上述PCR-RFLP法操作复杂，并且有扩增产物散布、混入第二次的其他反应的可能。由于存在这样的问题，多态性检测的自动化仍是难题。由于存在这样的问题，近年来，实施了利用熔解曲线分析(Tm分析)的检测作为基因多态性的检测方法。其是这样的方法使用与含有检测目标的基因多态性的检测对象序列互补的探针，使检测样品的靶标单链DNA与上述探针形成杂交体(双链DNA)，对该杂交形成体实施加热处理，根据吸光度等信号测定来检测随着温度上升的杂交体解离(熔解)，基于该检测结果确定Tm值，由此判断目标多态性的有无。杂交形成体的同源性越高，Tm值就越高，杂交形成体的同源性越低，Tm值就越低。因此，可以针对含有目标多态性的检测对象序列和与其互补的探针的杂交形成体预先求出Tm值(评价基准值)，然后测定检测样品的靶标单链DNA与上述探针的Tm值(测定值)，如果测定值与评价基准值相同，就能判断靶标DNA中存在目标多态性，如果测定值低于评价基准值，就能判断靶标DNA中不存在目标多态性。"Tm值”是指双链核酸解离的温度(解离温度Tm)，一般将其定义为，260nm处的吸光度达到吸光度完全上升值的50%时的温度。即，对双链核酸(例如含有双链DNA的溶液) 进行加热，260nm处的吸光度就会上升。这是因为，双链DNA的两链之间的氢键由于加热发生断裂，解离为单链DNA (DNA的熔解)。当全部双链DNA都解离成为单链DNA时，其吸光度显示为加热开始时的吸光度(仅双链DNA时的吸光度)的约1. 5倍，据此可判断为熔解完全。Tm值是根据这种现象设定的。但是，这种利用Tm分析的检测方法根据Tm值来判断至少一个碱基的差异，因此， 存在多个基因多态性时，对一个样品的分析也要花费大量的劳力。

发明内容
基于上述理由，EGFR基因的多态性检测，例如，对于上述疾病治疗方法的选择来说非常重要。因此，本发明的目的是提供下述多态性检测用探针及多态性检测方法，其能够简便且以优秀的可信度来判别关于EGFR基因的一个碱基不同的多态性。为了实现上述目的，本发明所用的多态性检测用探针是能检测EGFR基因突变的探针，其特征在于，所述多态性检测用探针包括选自下述Pl、P3、P5 P7及P15 P18中的至少一种经荧光标记的寡核苷酸。(Pl)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号251
的11 50个碱基长的碱基序列互补的序列或与所述互补的序列具有同源性的序列，其中， 与碱基编号261对应的碱基为腺嘌呤或胞嘧啶，与碱基编号251对应的碱基为胞嘧啶，所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P3)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号257
的5 50个碱基长的碱基序列互补的序列或与所述互补的序列具有同源性的序列，其中， 与碱基编号261对应的碱基为腺嘌呤或胞嘧啶，与碱基编号257对应的碱基为胞嘧啶，所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P5)寡核苷酸，其具有与含有序列编号2所示的碱基序列中碱基编号104 112 的9 50个碱基长的碱基序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号112同源的碱基为胸腺嘧啶，与碱基编号104同源的碱基为胞嘧啶，所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P6)寡核苷酸，其具有与含有序列编号2所示的碱基序列中碱基编号104 119 的16 50个碱基长的碱基序列具有同源性的序列，其中，碱基编号119的碱基被G以外的碱基替换，与碱基编号104同源的碱基为胞嘧啶，所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P7)寡核苷酸，其具有与含有序列编号3所示的碱基序列中碱基编号136 145 的10 50个碱基长的碱基序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号145同源的碱基为胞嘧啶，所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P15)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号259 264 的6 50个碱基长的碱基序列互补的序列或与所述互补的序列具有同源性的序列，其中， 与碱基编号261对应的碱基为腺嘌呤或胞嘧啶，位于所述碱基3’侧的胞嘧啶被荧光色素标记；
(P16)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号258 262 的5 50个碱基长的碱基序列互补的序列或与所述互补的序列具有同源性的序列，其中， 与碱基编号261对应的碱基为腺嘌呤或胞嘧啶，位于所述碱基5’侧的胞嘧啶被荧光色素标记；(P17)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号249 264 的16 50个碱基长的碱基序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号同源的碱基为胸腺嘧啶或鸟嘌呤，位于所述碱基5’侧的胞嘧啶被荧光色素标记；(P18)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号257 264 的8 50个碱基长的碱基序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号同源的碱基为胸腺嘧啶或鸟嘌呤，位于所述碱基3’侧的胞嘧啶被荧光色素标记。本发明的多态性检测方法是EGFR基因中多态性的检测方法，其特征在于使用本发明的探针。本发明的判定方法是判定对EGFR-TKI的耐药性或EGFR-TKI的药效的方法，所述方法特征在于包括利用本发明的方法来检测EGFR基因中的多态性的步骤，以及根据多态性的有无来判断对EGFR-TKI的耐药性或药效的步骤。本发明的试剂盒是用于检测EGFR基因中的多态性的试剂盒，其特征在于含有本发明的探针。本发明的引物是能检测EGFR基因突变的引物，其是选自于下述P8-13的多态性检测用引物。(P8)与序列编号1同源的10 50个碱基的寡核苷酸，其中以第233位的碱基C 作为3’末端，(P9)与序列编号1互补的10 50个碱基的寡核苷酸，其中以与第284位的碱基 G互补的碱基C作为3’末端，(PlO)与序列编号1互补的10 50个碱基的寡核苷酸，其中以与第290位的碱基 G互补的碱基C作为3’末端，(Pll)与序列编号2同源的10 50个碱基的寡核苷酸，其中以第95位的碱基G 作为3’末端，(P12)与序列编号2同源的10 50个碱基的寡核苷酸，其中以第73位的碱基C 作为3’末端，(P13)与序列编号2互补的10 50个碱基的寡核苷酸，其中以与第155位的碱基 G互补的碱基C作为3’末端。使用本发明的多态性检测方法，通过使用本发明的多态性检测用探针，例如，能够简便且以优秀的可信度判别EGFR基因的多态性。具体地说，例如，即使在样品中共存目标多态性是野生型的EGFR基因和是突变型的EGFR基因的情况下，也能够简便且以优秀的可信度检测出野生型和突变型的多态性。而且，使用本发明的引物，例如，能够特异地扩增含有EGFR基因的多态性的区域。这样，根据本发明，能够简便且以优秀的可信度扩增及判定 EGFR基因的多态性，因此，例如，检测结果能被反映于对上述疾病的治疗方法的选择中。例如，能够判定对吉非替尼等EGFR-TKI的耐药性或药效。此外，本发明不仅适用于例如医疗领域，其还适用于在生物化学等广泛的领域中对EGFR多态性的检测。


图1是示出本发明实施例1中反应液的Tm值分析结果的图。图2是示出本发明实施例2中反应液的Tm值分析结果的图。图3是示出本发明实施例4中反应液的Tm值分析结果的图。图4是示出本发明实施例5-1中反应液的Tm值分析结果的图。图5是示出本发明实施例5-2中反应液的Tm值分析结果的图。图6是示出本发明实施例5-3中反应液的Tm值分析结果的图。图7是示出比较例1中反应液的Tm值分析结果的图。图8是示出比较例2中反应液的Tm值分析结果的图。图9是示出实施例3-1中反应液的Tm值分析结果的图。图10是示出实施例3-2中反应液的Tm值分析结果的图。图11是示出实施例3-1中反应液的Tm值分析结果的图。图12是示出比较例3中反应液的Tm值分析结果的图。
具体实施例方式本发明中，基因多态性表示例如因为突变而产生的一个或多个基因座中的多样性。上述突变例如是替换、缺失、插入以及添加。作为EGFR基因，序列编号1、2以及21所示的部分序列，例如分别被收录为如下所示的GeneBank登记号。(序列编号1)NT_033968第48486 位 第4849033位的碱基序列(序列编号2)NT_033968. 6第4831717位 第4832033位的碱基序列(序列编号21)NG_007726第167001位 第168020位的碱基序列本发明中，EGFR基因中检测目标的多态性例如是以下的多态性。序列编号1所示的EGFR基因的部分序列中第261位碱基(k)的多态性序列编号2所示的EGFR基因的部分序列中第104 133位碱基的至少任意一个碱基的多态性序列编号2所示的EGFR基因的部分序列中第130 164位碱基的至少任意一个的多态性序列编号21所示的EGFR基因的部分序列中第347位碱基(y)的多态性。下文中，序列编号1的上述多态性被称为“EGFR外显子21 858多态性”，序列编号 2的上述多态性被称为“EGFR外显子19多态性”，序列编号21的上述多态性称为“EGFR790 多态性”。上述各多态性均分别存在野生型和突变型。就上述各多态性而言，野生型EGFR基因被称为“野生型基因”，突变型EGFR基因被称为“突变型基因”。上述序列编号1中第261位碱基(k)的多态性为，野生型为胸腺嘧啶(t)，突变型为鸟嘌呤(g)。野生型的情况下，EGFR第858位氨基酸为赖氨酸(L)，突变型的情况下，EGFR 第858位氨基酸为精氨酸(R)。本发明中，“EGFR外显子21 L858R”表示EGFR基因的外显子21中的突变，密码子 858的突变意指氨基酸赖氨酸(L)到精氨酸(R)的突变。此外，本发明中“EGFR外显子21的突变型”意指“EGFR外显子21L858R”。本发明中EGFR外显子21的碱基序列意指GeneBank 登记号NT_033968中的第48486 位 第4849033位；EGFR外显子21 L858R的突变意指 GeneBank登记号NT_033968中所示的碱基序列的第4848884位碱基由“T (胸腺嘧啶)，，向 “G(鸟嘌呤)”的突变。上述序列编号2的第104-164位碱基的多态性，例如是下表1所示的多态性(参见 Journal of Clinical Oncology，2005 年，Vol. 23、No 11，p. 2513-2520)。下表 1 中，多态性1为野生型。下述多态性1的碱基序列对应于序列编号2中第104 164位的寡核苷酸。下表1中，多态性2 18为序列编号2中第112 164位的区域内至少任意一个碱基缺失的突变型(外显子19缺失突变)。其中，下述多态性2 17为序列编号2中第122 132位的区域内至少任意一个碱基缺失的突变型，特别地，上述第112 140位的区域内多个碱基缺失的突变型。下述多态性18为序列编号2中第137 151位的碱基缺失的突变型。下表1的多态性2 18中“_”指与多态性1相对应的位点的碱基缺失。[表 1]
多态性碱基序列
1041111211311411511611CCCGTCGCTATCAAGGA ATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAACaaggaaatc ctcg3CCCGTCGCTATCAAG—-—ACATCTCCGAAAGCCAA-aaggaaatcctcg4CCCGTCGCTATCAAGGAA一響 一一一一一一cCAACATCTCCGAAAGCCAACaaggaaatcctcg5CCCGTCGCTATCAAGGAAT------CTCCGAAAGCCAACaaggaaatcctcg6CCCGTCGCTATCAAGGAAT--------CGAAAGCCAACaaggaaatcctcg7CCCGTCGCTATCAAGGAA---------cCATCTCCGAAAGCCAACaaggaaatcctcg8CCCGTCGCTATCAAGGAA------------------CCGAAAGCCAACaaggaaatcctcg9CCCGTCGCTATCAAGG--------tTCCGAAAGCCAACaaggaaatcctcg10CCCGTCGCTATCAAGGAAT------------CATCTCCGAAAGCCAACaaggaaatcctcg11CCCGTCGCTATCAAGGAAT-------CGAAAGCCAACaaggaaatcctcg12CCCGTCGCTATCAAGGAA------------------CaGAAAGCCAACaaggaaatcctcg13CCCGTCGCTATCAAGG-——tATCTCCGAAAGCCAACaaggaaatcctcg14CCCGTCGCTATCAAGGt--------TCCGAAAGCCAACaaggaaatcctcg15CCCGTCGCTATCAA----AaTCTCCGAAAGCCAACaaggaaatcctcg16CCCGTCGC--------AATTAAGAt--------ATCTCCGAAAGCCAACaaggaaatcctcg17CCCGTCGCTATCAAGGA A----------CAA-----CCGAAAGCCAACaaggaaatcctcg18CCCGTCGCTATCAAGGA ATTAAGAGAAGCAACA——-aaggaaatcctcg※上述1 18的序列分别如序列编号四 31、34 48所示EGFR基因中，上述两处的多态性中至少一种为上述突变型的话，例如则能够判断为存在对吉非替尼等EGFR-TKI的耐药性的高可能性。上述序列编号21的第347位碱基(y)的野生型为胞嘧啶(C)，此时，EGFR第790 位氨基酸为苏氨酸(T)。其突变型为胸腺嘧啶(t)，此时，EGFR第790位氨基酸为甲硫氨酸 (M)。EGFR基因中，该多态性为上述突变型的话，例如，则能够判断为存在显示出对吉非替尼等EGFR-TKI的耐药性的可能性。本发明中，“具有同源性的序列”优选是对于特定的碱基序列而言例如具有80%以上的同源性的序列。前述同源性例如优选为85%以上，更优选为90%以上，进一步优选为 95%以上，最优选为96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、100%。即，本发明中，具有同源性的序列可以是包括上述特定的碱基序列的序列(同源性100% )，也可以是相对上述特定的碱基序列而言有一个碱基以上的替换、缺失、插入和/或添加的序列(例如，同源性在 80%以上但小于100%)(下文中也适用)。上述多态性发生的位点，即，正义链中的位点及其互补的反义链中的位点，称为“检测位点”。包含上述检测位点在内，上述多态性检测用探针可能杂交的区域被称为“杂交区域或检测序列”。上述检测位点为野生型的检测序列也称为“野生型检测序列”，检测位点为突变型的检测序列也称为“突变型检测序列”。本发明中，上述用于检测EGFR858多态性(t/g)的探针，也称为“EGFR858用探针”， 上述用于检测外显子19多态性的探针，也称为“外显子19用探针”，上述用于检测EGFR790 多态性(c/t)的探针，也称为“EGFR790用探针”。此外，上述检测序列中，较之上述突变型检测序列而言，对上述野生型检测序列杂交更强的探针，被称为“野生型探针”。另一方面， 上述检测序列中，较之上述野生型检测序列而言，对上述突变型检测序列杂交更强的探针被称为“突变型探针”。“杂交强度”例如能根据Tm值的关系来表示，具体而言，能针对探针和野生型检测序列的Tm值以及上述探针与突变型检测序列的Tm值，根据两个Tm值的高低关系来表示。即，上述野生型探针例如是，显示出比与突变型检测序列的Tm值更高的、与野生型检测序列的Tm值的探针。另一方面，上述突变型探针例如是，显示出比与野生型检测序列的Tm值更高的、与突变型检测序列的Tm值的探针。上述“显示出比……更高的……Tm值”例如可以是只要能检测出各Tm值的峰的差异即可，具体而言，上述各Tm值的差为3°C以上是优选的，更优选4°C以上，进一步更优选 5°C以上，对上述各Tm值的差没有上限限制，例如，30°C。本发明中，EGFR基因中的扩增区域例如可以是EGFR正义链中的区域，也可以是与其相对应的反义链的区域，也可以两者兼有。本发明中，碱基序列末端意指碱基序列5’侧以及3’侧最边缘的碱基。此外，5’末端区域为碱基序列5’末端起多个碱基的区域，3’末端区域为碱基序列3’末端起多个碱基的区域。上述多个碱基例如是末端起的1个碱基 10个碱基。本发明中，碱基序列末端起第Z位碱基(Z为正整数)是从末端第一位碱基开始计数的。<多态性检测用探针>(1)EGFR858 用探针本发明的多态性检测探针，如前所述，是能够检测EGFR外显子21L858R的基因突变的探针，其特征在于，所用探针包括选自Pl、P3及P15 P18中的至少一种经荧光标记的
寡核苷酸。(Pl)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号251 261的11 50个碱基长的碱基序列互补的序列或与所述互补的序列具有同源性的序列，其中， 与碱基编号261对应的碱基为腺嘌呤或胞嘧啶，与碱基编号251对应的碱基为胞嘧啶，所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P3)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号257
的5 50个碱基长的碱基序列互补的序列或与所述互补的序列具有同源性的序列，其中， 与碱基编号261对应的碱基为腺嘌呤或胞嘧啶，与碱基编号257对应的碱基为胞嘧啶，所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P15)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号259 264 的6 50个碱基长的碱基序列互补的序列或与所述互补的序列具有同源性的序列，其中， 与碱基编号261对应的碱基为腺嘌呤或胞嘧啶，位于所述碱基3’侧的胞嘧啶被荧光色素标记；(P16)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号258 262 的5 50个碱基长的碱基序列互补的序列或与所述互补的序列具有同源性的序列，其中， 与碱基编号261对应的碱基为腺嘌呤或胞嘧啶，位于所述碱基5’侧的胞嘧啶被荧光色素标记；(P17)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号249 264 的16 50个碱基长的碱基序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号同源的碱基为胸腺嘧啶或鸟嘌呤，位于所述碱基5’侧的胞嘧啶被荧光色素标记；(P18)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号257 264 的8 50个碱基长的碱基序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号同源的碱基为胸腺嘧啶或鸟嘌呤，位于所述碱基3’侧的胞嘧啶被荧光色素标记。包括上述PI、P3及P15 P18的寡核苷酸的探针是用于检测上述EGFR 858多态性(t/g)的探针，即上述EGFR 858用探针。这些探针，例如是用于检测序列编号1所示的碱基序列中第261位碱基是否发生替换突变的探针。上述PI、P3及P15 P18的各寡核苷酸，例如与EGFR基因的正义链互补，能够通过与上述正义链的杂交来确定上述多态性。上述Pl的寡核苷酸中，与序列编号1第261位碱基(t或g)互补的(对应的)碱基为腺嘌呤(a)或胞嘧啶(C)。上述Pl的寡核苷酸中， 上述碱基是腺嘌呤(a)的寡核苷酸也称为“Pl-wt”，上述碱基是胞嘧啶(c)的寡核苷酸也称为“Pl-mt”。上述Pl-wt对EGFR858野生型检测序列的杂交比对EGFR858突变型检测序列更强，故而可被称为EGFR858用野生型探针。上述Pl_mt对EGFR858突变型检测序列的杂交比对EGFR858野生型型检测序列更强，故而可被称为EGFR858用突变型探针。可通过这些寡核苷酸与上述EGFR基因的检测序列中EGFR858野生型检测序列或EGFR858突变型检测序列的某一个的强杂交，来检测EGFR基因的多态性。上述P3的寡核苷酸，例如与EGFR基因的正义链互补，能够通过与上述正义链的杂交来确定上述多态性。上述P3的寡核苷酸中，与序列编号1第261位碱基(t或g)互补的(对应的)碱基为腺嘌呤(a)或胞嘧啶(C)。上述P3的寡核苷酸中，上述碱基是腺嘌呤 (a)的寡核苷酸也称为“P3-wt”，上述碱基是胞嘧啶(c)的寡核苷酸也称为“P3-mt”。上述 P3-wt对EGFR858野生型检测序列的杂交比对EGFR858突变型检测序列更强，故而可被称为EGFR858用野生型探针。上述P3_mt对EGFR858突变型检测序列的杂交比对EGFR858野生型型检测序列更强，故而可被称为EGFR858用突变型探针。可通过这些寡核苷酸与上述 EGFR基因的检测序列中EGFR858野生型检测序列或EGFR858突变型检测序列的某一个强的杂交，来检测EGFR基因的多态性。上述Pl的寡核苷酸(3T-EGFR-858-R2)，如前所述，可以为11 50个碱基长，优选为11 40个碱基长，更优选为11 30个碱基长，进一步更优选为12 20个碱基长。上述P3的寡核苷酸(3T-EGFR-858-R1)，如前所述，可以为5 50个碱基长，优选为10 40 个碱基长，更优选为10 30个碱基长，进一步优选为12 20个碱基长。上述各寡核苷酸中，经上述标记物质标记的位点无特别限制，例如优选为5’末端区域或3’末端区域，更优选为5’末端或3’末端。此外，如下文所述，上述寡核苷酸中，经上述标记物质标记的碱基，例如优选为胞嘧啶(c)或鸟嘌呤(g)。上述标记物质例如可以直接标记碱基，也可以通过标记含有上述碱基的核苷酸残基的任何位点，来对上述碱基间接进行标记。上述Pl的寡核苷酸优选在3’末端起算的第1 3位的位置具有经荧光色素标记的、与碱基编号251互补的(对应的)碱基。上述寡核苷酸中，“与碱基编号251互补的(对应的)碱基”意指对上述寡核苷酸与序列编号1的碱基序列进行比对时，与序列编号1的碱基序列中第251位碱基(g)互补的碱基(c)。具体地，与碱基编号251互补的碱基在Pl 的寡核苷酸中表示为C。上述Pl的寡核苷酸优选在3’末端具有经荧光色素标记的与第251位碱基互补的碱基。上述Pl-mt例如是序列编号7所示的寡核苷酸，上述Pl_wt例如是序列编号8所示的寡核苷酸。5，-ttggcccgcccaaaatc-3‘(序列编号 7) (3T-EGFR-858-R2)5' -ttggccagcccaaaatc-3'(序歹[J编号 8)上述P3的寡核苷酸优选在3’末端起算的第1 3位的位置具有经荧光色素标记的、与碱基编号257互补的(对应的)碱基。上述寡核苷酸中，“与碱基编号257互补的(对应的)碱基”意指对上述寡核苷酸与序列编号1的碱基序列进行比对时，与序列编号1的碱基序列中第257位碱基(g)互补的碱基(c)。具体地，与碱基编号257互补的碱基在P3 的寡核苷酸中表示为C。
上述P3-wt例如是序列编号12 14所示的寡核苷酸；上述P3-mt例如是序列编 11所示的寡核苷酸。 5' -cagtttggccagccc-3'(序列编号 12) 5' -ctgtttggccagccc-3'(序列编号 13) 5' -ccgtttggccagccc-3'(序列编号 14) 号9 5，-cagtttggcccgccc-3'(序列编号 9) (3T-EGFR-858-R1)
5' -ctgtttggcccgccc-3'(序列编号 10) 5' -ccgtttggcccgccc-3'(序列编号 11) 上述P15的寡核苷酸例如是下述P15-1 P15-5的寡核苷酸c
(P15-1)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号235
264的30 50个碱基长的碱基序列互补的序列或与所述互补的序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号261对应的碱基为腺嘌呤或胞嘧啶，与碱基编号235对应的碱基为胞嘧啶， 所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P15-2)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号239 264的沈 50个碱基长的碱基序列互补的序列或与所述互补的序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号261对应的碱基为腺嘌呤或胞嘧啶，与碱基编号239对应的碱基为胞嘧啶， 所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P15-3)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号244 264的21 50个碱基长的碱基序列互补的序列或与所述互补的序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号261对应的碱基为腺嘌呤或胞嘧啶，与碱基编号244对应的碱基为胞嘧啶， 所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P15-4)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号258 264的7 50个碱基长的碱基序列互补的序列或与所述互补的序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号261对应的碱基为腺嘌呤或胞嘧啶，与碱基编号258对应的碱基为胞嘧啶， 所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P15-5)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号259 264的6 50个碱基长的碱基序列互补的序列或与所述互补的序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号261对应的碱基为腺嘌呤或胞嘧啶，与碱基编号259对应的碱基为胞嘧啶， 所述胞嘧啶被荧光色素标记。上述P16的寡核苷酸例如是下述P16-1 P16-10的寡核苷酸。(P16-1)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号258 263的6 50个碱基长的碱基序列互补的序列或与所述互补的序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号261对应的碱基为腺嘌呤或胞嘧啶，与碱基编号263对应的碱基为胞嘧啶， 所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P16-2)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号258 262的5 50个碱基长的碱基序列互补的序列或与所述互补的序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号261对应的碱基为腺嘌呤或胞嘧啶，与碱基编号262对应的碱基为胞嘧啶， 所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P16-3)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号258 271的14 50个碱基长的碱基序列互补的序列或与所述互补的序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号261对应的碱基为腺嘌呤或胞嘧啶，与碱基编号271对应的碱基为胞嘧啶， 所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P16-4)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号258 274的17 50个碱基长的碱基序列互补的序列或与所述互补的序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号261对应的碱基为腺嘌呤或胞嘧啶，与碱基编号274对应的碱基为胞嘧啶， 所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P16-5)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号258 275的18 50个碱基长的碱基序列互补的序列或与所述互补的序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号261对应的碱基为腺嘌呤或胞嘧啶，与碱基编号275对应的碱基为胞嘧啶， 所述胞嘧啶被荧光色素标记；
(P16-6)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号258 276的19 50个碱基长的碱基序列互补的序列或与所述互补的序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号261对应的碱基为腺嘌呤或胞嘧啶，与碱基编号276对应的碱基为胞嘧啶， 所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P16-7)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号258 278的21 50个碱基长的碱基序列互补的序列或与所述互补的序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号261对应的碱基为腺嘌呤或胞嘧啶，与碱基编号278对应的碱基为胞嘧啶， 所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P16-8)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号258 280的23 50个碱基长的碱基序列互补的序列或与所述互补的序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号261对应的碱基为腺嘌呤或胞嘧啶，与碱基编号280对应的碱基为胞嘧啶， 所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P16-9)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号258 281的M 50个碱基长的碱基序列互补的序列或与所述互补的序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号261对应的碱基为腺嘌呤或胞嘧啶，与碱基编号281对应的碱基为胞嘧啶， 所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P16-10)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号258 284的27 50个碱基长的碱基序列互补的序列或与所述互补的序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号261对应的碱基为腺嘌呤或胞嘧啶，与碱基编号284对应的碱基为胞嘧啶， 所述胞嘧啶被荧光色素标记。上述P17的寡核苷酸例如是下述P17-1 P17-4的寡核苷酸。(P17-1)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号236 264的四 50个碱基长的碱基序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号同源的碱基为胸腺嘧啶或鸟嘌呤，与碱基编号236同源的碱基为胞嘧啶，所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P17-2)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号241 264的M 50个碱基长的碱基序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号同源的碱基为胸腺嘧啶或鸟嘌呤，与碱基编号Ml同源的碱基为胞嘧啶，所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P17-3)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号247 264的18 50个碱基长的碱基序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号同源的碱基为胸腺嘧啶或鸟嘌呤，与碱基编号M7同源的碱基为胞嘧啶，所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P17-4)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号249 264的16 50个碱基长的碱基序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号同源的碱基为胸腺嘧啶或鸟嘌呤，与碱基编号M9同源的碱基为胞嘧啶，所述胞嘧啶被荧光色素标记；上述P18的寡核苷酸例如是下述P18-1 P18-5的寡核苷酸。(P18-1)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号257 264的8 50个碱基长的碱基序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号261同源的碱基为胸腺嘧啶或鸟嘌呤，与碱基编号沈4同源的碱基为胞嘧啶，所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P18-2)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号257 265的9 50个碱基长的碱基序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号261同源的碱基为胸腺嘧啶或鸟嘌呤，与碱基编号沈5同源的碱基为胞嘧啶，所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P18-3)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号257 269的13 50个碱基长的碱基序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号同源的碱基为胸腺嘧啶或鸟嘌呤，与碱基编号沈9同源的碱基为胞嘧啶，所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P18-4)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号257 272的16 50个碱基长的碱基序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号同源的碱基为胸腺嘧啶或鸟嘌呤，与碱基编号272同源的碱基为胞嘧啶，所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P18-5)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号257 279的23 50个碱基长的碱基序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号同源的碱基为胸腺嘧啶或鸟嘌呤，与碱基编号279同源的碱基为胞嘧啶，所述胞嘧啶被荧光色素标记。本发明的EGFR858用探针可以例如是下述探针，所述探针两端的碱基是胞嘧啶， 所述两个胞嘧啶被荧光标记。这样的探针例如是下述P19的经荧光标记的寡核苷酸。(P19)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号257 274 的18 50个碱基长的碱基序列互补的序列或与所述互补的序列具有同源性的序列，其中， 与碱基编号261对应的碱基为腺嘌呤或胞嘧啶，与碱基编号257对应的碱基及与碱基编号 274对应的碱基为胞嘧啶，所述两个胞嘧啶被荧光色素标记。本发明中，(Pl)、(P3)、(P15)、(P16)、(P19)的寡核苷酸例如可以是在严谨条件下与上述各寡核苷酸的互补链杂交的寡核苷酸。例如可根据各种杂交检验来检测上述杂交。 上述杂交检验及严谨条件例如可采用Sambrook等编著的一·夕口一二 W 7 . 7 7 卜 U — 二工了卟第2版(Molecular Cloning :A Laboratory Manual 2nd Ed.， [Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)])等记载的方法和条件。除非另有说明，例如，与上述Pl及P3的各寡核苷酸相关的说明可应用至上述 P15 P19的寡核苷酸。例如，各寡核苷酸中的经标记位点如上文所述优选胞嘧啶残基，对上述P15、P16及P19而言，例如，对应于序列编号1中的鸟嘌呤的胞嘧啶残基是优选的，对上述P17和P18而言，例如，序列编号1中的胞嘧啶是优选的。P15的寡核苷酸的碱基长度下限为6个碱基长，优选为16个碱基长。P16的寡核苷酸的碱基长度下限为5个碱基长，优选为6个碱基长，更优选为18个碱基长。P17的寡核苷酸的碱基长度下限为16个碱基长，优选为20个碱基长。P18的寡核苷酸的碱基长度下限为8个碱基长，优选为20个碱基长。上述P15 P19的各寡核苷酸的碱基长度上限为例如40个碱基长，优选为30个
碱基长。关于上述P15 P19的寡核苷酸，下文给出了各序列分别的具体实施例。下文所述的序列中，与目标多态性位点对应的碱基例如可以是野生型，也可以是突变型。具体而言，对上述P15、P16和P19来说，例如，序列中的上述碱基可表示为m(a或c)，对上述P17和 P18来说，例如，序列中的上述碱基可表示为k(t或g)。并且，本发明不限于这些序列。P15-l(序列编号 72)5' -gccCgcccaaaatctgtgatcttgacatgc-3' (3T-EGFR-858-R4)P15_2(序列编号 73)
5' -gccCgcccaaaatctgtgatcttgac-3‘ (3T-EGFR-858-R5)P15_3(序列编号 74)5' -tggccCgcccaaaatctgtgatc-3‘ (3T-EGFR-858-R6)P15_4(序列编号 75)5' -agcagtttggccCgcc-3' (3T-EGFR-858-R7)P15_5(序列编号 76)5' -acccagcagtttggccCgc-3‘ (3T-EGFR-858-R8)P16-l(序列编号 77)5' -ccCgcccaaaatctgtga-3‘ (3T-EGFR-858-R9)P16_2(序列编号 78)5' -cCgcccaaaatctgtgat-3‘ (3T-EGFR-858-R10)P16_3(序列编号 79)5' -cagtttggccCgcccaaaatct-3‘ (3T-EGFR-858-R11)Pl6_4(序列编号 8O)5' -cagcagtttggccCgcccaaaa-3‘ (3T-EGFR-858-R12)P16_5(序列编号 81)5' -ccagcagtttggccCgcccaaaa-3‘ (3T-EGFR-858-R13)P16_6(序列编号 82)5' -cccagcagtttggccCgcccaaaa-3‘ (3T-EGFR-858-R14)P16-7 (序列编号 83)5' -cacccagcagtttggccCgcccaa-3‘ (3T-EGFR-858-R15)P16_8(序列编号 84)5' -cgcacccagcagtttggccCgccc-3‘ (3T-EGFR-858-R16)P16_9(序列编号 85)5' -ccgcacccagcagtttggccCgcc-3‘ (3T-EGFR-858-R17)P16_10(序列编号 86)5' -cttccgcacccagcagtttggccCgcc-3‘ (3T-EGFR-858-R18)P17-l(序列编号 89)5' -catgtcaagatcacagattttgggcGggc-3‘ (5T-EGFR-8 58-F1)P17_2(序列编号 90)
0173]5' -caagatcacagattttgggcGggc-3‘ (5T-EGFR-858-F2)
0174]P17_3(序列编号 91)
0175]5' -cacagattttgggcGggccaaa-3‘ (5T-EGFR-858-F3)
0176]P17_4(序列编号 92)
0177]5' -cagattttgggcGggccaaa-3‘ (5T-EGFR-858-F4)
0178]P18-l(序列编号 94)
0179]5' -atcacagattttgggcGggc-3‘ (3T-EGFR-858-F6)
0180]P18-2 (序列编号 ％)
0181]5' -atcacagattttgggcGggcc-3‘ (3T-EGFR-858-F7)
P18_3(序列编号 96)5' -attttgggcGggccaaac-3‘ (3T-EGFR-858-F8)P18_4(序列编号 97)5' -attttgggcGggccaaacTgc-3‘ (3T-EGFR-858-F9)P18-5 (序列编号 98)5' -ggcGggccaaacTgctgggtgc-3‘ (3T-EGFR-858-F10)P19-l(序列编号 88)5' -cagcagtttggccCgccc-3‘ (35T-EGFR-858-R21)(2)外显子19用探针本发明的外显子19用探针，如前文所述，是能检测EGFR外显子19缺失的基因突变的探针，其特征在于，所述探针包括选自下述P5 P7中的至少一种经荧光色素标记的寡核苷酸。(P5)寡核苷酸，其具有与含有序列编号2所示的碱基序列中碱基编号104 112 的9 50个碱基长的碱基序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号112同源的碱基为胸腺嘧啶，与碱基编号104同源的碱基为胞嘧啶，所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P6)寡核苷酸，其具有与含有序列编号2所示的碱基序列中碱基编号104 119 的16 50个碱基长的碱基序列具有同源性的序列，其中，碱基编号119的碱基被G以外的碱基替换，与碱基编号104同源的碱基为胞嘧啶，所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P7)寡核苷酸，其具有与含有序列编号3所示的碱基序列中碱基编号136 145 的10 50个碱基长的碱基序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号145同源的碱基为胞嘧啶，所述胞嘧啶被荧光色素标记。包括上述P5 P7的寡核苷酸的探针是用于检测上述外显子19多态性的探针， 即，上述外显子19用探针。上述P5 P7的寡核苷酸，例如与EGFR基因的反义链互补，能够通过与上述反义链的杂交来确定上述多态性。上述P5的寡核苷酸在例如当序列编号2的第104 112位碱基为野生型时，较之上述碱基被缺失突变的突变型的情况而言，与上述检测序列更强地杂交。因此，根据上述 P5的寡核苷酸对上述EGFR基因的检测序列中的上述野生型或突变型中的任一种更强的杂交，可以确定EGFR基因的外显子19多态性，即，是外显子19野生型(上述表1的多态性1) 还是外显子19突变型(上述表1的多态性2 17)。下文中，将包括上述P5的寡核苷酸的探针称为“外显子19用野生型探针”。上述P6的寡核苷酸在例如当序列编号2的第104 119位碱基为野生型时，除了第119位的碱基之外，与检测序列强杂交。因此，根据上述P6的寡核苷酸对上述EGFR基因的检测序列是否更强的杂交，可以确定EGFR基因的外显子19多态性，即，是外显子19野生型(上述表1的多态性1)还是外显子19突变型(上述表1的多态性2 15及17)。下文中，将包括上述P6的寡核苷酸的探针称为“外显子19用突变型(sub)探针”。上述P7的寡核苷酸在例如当序列编号2的第137 151位碱基是缺失突变的突变型时，较之上述碱基未缺失突变的野生型的情况而言，与上述检测序列更强地杂交。因此， 根据上述P7的寡核苷酸对上述EGFR基因的检测序列中的上述野生型或突变型中的任一种更强的杂交与否，可以确定EGFR基因的外显子19多态性，即，是外显子19野生型(上述表 1的多态性1)还是外显子19突变型(上述表1的多态性18)。下文中，将包括P7的寡核苷酸的探针称为“外显子19用突变型(del)探针”。上述P5的寡核苷酸(5FL-EGFR-EX19-F2)，如前文所述，为9 50个碱基长，优选为20 40个碱基长，更优选为25 35个碱基长，进一步优选为10 30个碱基长。上述 P6的寡核苷酸(5T-EGFR-EX19-Nol9-F2-3)，如前文所述，为9 50个碱基长，优选为20 40个碱基长，更优选为25 35个碱基长，进一步优选为10 30个碱基长。上述P7的寡核苷酸(3T-EGFR-EX19-Nol8-Fl)，如前文所述，可以为10 50个碱基长，优选为10 30 个碱基长，更优选为12 30个碱基长，进一步优选为15 20个碱基长。上述各寡核苷酸中，经上述标记物质标记的位点无特别限制，例如，优选为5’末端区域或3’末端区域，更优选为5’末端或3’末端。此外，后文述及的上述寡核苷酸中，经上述标记物质标记的碱基，例如优选为胞嘧啶(c)或鸟嘌呤(g)。上述标记物质例如可以直接标记碱基，也可以通过标记含有上述碱基的寡核苷酸残基中的任一位点，对上述碱基间接进行标记。上述P5的寡核苷酸优选在5’末端起算的第1 3位的位置具有经荧光色素标记的与碱基编号104同源的碱基。上述P6的寡核苷酸优选在5’末端起算的第1 3位的位置具有经荧光色素标记的与碱基编号104同源的碱基。上述寡核苷酸中“与碱基编号104 同源的碱基”意指与序列编号2的碱基序列中第104位的碱基(c)同源的碱基(C)。具体地，与碱基编号104同源的碱基在P5及P6的寡核苷酸中表示为C。上述P7的寡核苷酸优选在3’末端起算的第1 3位的位置具有经荧光色素标记的与碱基编号145同源的碱基。 上述寡核苷酸中“与碱基编号145同源的碱基”意指与序列编号3的碱基序列中第145位的碱基(c)同源的碱基(C)。具体地，与碱基编号145同源的碱基在P7的寡核苷酸中表示为C。上述P5的寡核苷酸优选在5’末端具有经荧光色素标记的与碱基编号104同源的碱基。上述P6的寡核苷酸优选在5’末端具有经荧光色素标记的与碱基编号104同源的碱基。上述P7的寡核苷酸优选在3’末端具有经荧光色素标记的与碱基编号145同源的碱基。上述P5的寡核苷酸，例如是序列编号5所示的寡核苷酸。5，-cccgtcgctatcaaggaattaagagaagc-3，(序歹丨J编号 5) (5FL-EGFR-EX19-F2)上述P6的寡核苷酸，例如是序列编号4所示的寡核苷酸。5，-cccgtcgctatcaagtaattaagagaag3’(序列编号4) (5T-EGFR-EX19-Nol9-F2-3)上述P7的寡核苷酸，例如是序列编号6所示的寡核苷酸。5，-agcaacaaaggaaatc-3，(序列编号 6) (3T-EGFR-EX19-Nol8_Fl)。如前文所述，本发明中，上述PI、P3、P5 P7及P15 P19的寡核苷酸可以是具有下述序列的寡核苷酸，所述序列与例举的上述序列中任一具有同源性。上述同源性例如是80%以上，优选85%以上，更优选90%以上，进一步更优选95%以上，最优选96%以上、 97%以上、98%以上、99%以上、100%。本发明的探针例如可以是由上述寡核苷酸构成的探针，也可以是含有上述寡核苷酸的探针。上述探针例如可以是由天然碱基构成的，也可以是非天然核酸构成的。所述天然
18核酸例如是DNA或RNA。所述非天然核酸例如是桥联核酸(Bridged Nucleic Acid, BNA 也称为LNA(Locked Nucleic Acid，锁核酸))等交联核酸或PNA(肽核酸)等。上述探针例如是上述非天然核酸构成时，由于对检测对象序列杂交的能力能被提高，所以例如可设计短的探针序列。由所述LNA构成的探针和所述检测对象序列的Tm值的预测可例如通过 EXIQON 土白勺 (http//www. exiqon. com/oligo—tools) Jfei十胃。上述经荧光色素标记的寡核苷酸，例如在未与上述靶标序列杂交时发出荧光，并且与上述靶标序列序列杂交时荧光强度减少或增加。此外，上述经荧光色素标记的寡核苷酸，例如在未与上述靶标序列杂交时发出荧光，并且与上述靶标序列序列杂交时荧光强度减少或增加。上述荧光色素无特别限制，例如是荧光团等荧光色素。上述荧光色素例如是荧光素、磷光体、罗丹明、聚甲炔色素衍生物等。市售的荧光色素例如为I^cific Blue(注册商标，Molecular Probes 公司制造)、BODIPY FL (注册商标，Molecular Probes 公司制造)、 FluorePrime (商品名，Amersham Pharmacia 公司制造)、Fluoredite (商品名，Millipore 公司制造)、FAM(注册商标，ABI公司制造)、Cy3以及Cy5(商品名，Amersham Pharmacia 公司制造)、TAMRA(注册商标，Molecular Probes公司制造)等等。上述荧光色素的检测条件无特别限制，例如可根据荧光色素的种类做出合适的决定，例如，对I^acific Blue而言检测波长450 480nm、对TAMRA而言检测波长585 700nm、对BODIPY FL而言检测波长 515 555nm时，能够进行检测。使用这类经荧光色素标记的寡核苷酸，例如，通过检测作为信号的荧光、测定作为信号值的荧光强度，就能从荧光强度的变动容易地确认杂交和解离。从检测效率的观点来看，多态性检测用探针优选为带标记的经标记探针。经标记的探针中的标记物质的具体例子例如是荧光色素以及荧光团。作为上述经标记的探针的具体例子，优选为经荧光色素标记、单独存在时显示荧光并且杂交体形成时荧光强度减少 (例如，淬灭)的探针。这种利用荧光淬灭现象(Quenching phenomenon)的探针，一般称为荧光淬灭探针。其中，优选地，上述探针中，寡核苷酸的3’区域(例如3’末端)或5’区域(例如5’ 末端)的碱基经荧光色素，经标记的上述碱基优选为胞嘧啶(C)。此时，优选地，将上述经标记的探针的碱基序列设计为使得与上述经标记的探针杂交的检测目标序列中，与上述经标记的探针末端碱基C配对的碱基或与上述配对的碱基距离1 3个碱基的碱基为鸟嘌呤 (G)。这种探针一般称为鸟嘌呤淬灭探针，即已知的所谓QProbe (注册商标)。这种鸟嘌呤淬灭探针与检测目的序列杂交后，经荧光色素标记的末端C，会靠近上述检测目标序列中的 G，由此出现上述荧光色素发光变弱(荧光强度减少)的现象。通过使用这种探针，通过测定信号的变动，能够容易地确定杂交和解离。此外，上述标记物质例如通常能与核苷酸的磷酸基团结合。本发明的探针例如可以在3’末端添加磷酸基团。可以通过PCR等基因扩增法来制备待检测突变有无的DNA(靶标DNA)，此时，其可以与本发明的探针在基因扩增反应的反应液共存。这种情况下，在探针的3’末端添加磷酸基团，能够充分防止探针自身通过基因扩增反应而出现延伸。此外，在3’末端添加如前文所述的标记物质，也能获得同样的效果。而且，除使用QProbe的检测方法以外，也适用公知的检测手段。这类检测手段可以是Tag-man Probe法或RFLP法等。
上述荧光色素无特别限制，例如是荧光素、磷光体、罗丹明、聚甲炔色素衍生物等。市售的荧光色素例如为BODIPY FL(注册商标，Molecular ftx)bes公司制造)、 FluorePrime (商品名，Amersham Pharmacia 公司制造)、Fluoredite (商品名，Millipore 公司制造)、FAM(注册商标，ABI公司制造)、Cy3以及Cy5 (商品名，Amersham Wiarmacia公司制造)、TAMRA (注册商标，Molecular ftx)bes公司制造)等等。用于多个探针的荧光色素的组合例如只要能在不同条件下被检测出即可，并无特别限制，例如是I^acific Blue (检测波长 450 480nm) ,TAMRA (检测波长 585 700nm)及 BODIPY FL (检测波长 515 555nm) 的组合等等。〈多态性检测方法〉本发明的多态性检测方法是检测EGFR基因的多态性的方法，其特征在于使用与上述检测序列杂交的探针。 而且，本发明的多态性检测方法，其特征在于使用本发明的多态性检测用探针，其他构成和条件等不限于下文的记载。本发明例如能够适用于医疗领域之外、并非诊断及治疗方法的领域中的EGFR基因多态性检测。本发明的多态性检测方法包含例如下述㈧步骤和⑶步骤。(A)步骤使含有上述待检测多态性的被检测核酸与本发明多态性检测用探针的反应体系的温度变化，测定显示上述被检测核酸与上述多态性检测用探针的杂交形成体的熔解状态的信号值。(B)步骤根据伴随上述温度变化的上述信号值的变动，来确定上述被检测核酸中的上述多态性。上述(A)步骤中，上述本发明的多态性检测用探针例如可以使用任一种，也可以组合使用两种以上。使用的上述多态性检测用探针的种类例如可以对应于检测目标的多态性来适当地确定。上述(A)步骤中使用的上述多态性检测用探针，可以其中至少一种是本发明的多态性检测用探针。上述探针的种类，例如可对应于EGFR基因中的检测目标多态性来适当地确定。本发明中，例如可以仅检测EGFR858多态性，也可以仅检测外显子19多态性，也可以在同一反应体系中检测这两种多态性。此外，也可以在同一反应体系中检测上述EGFR858 多态性和外显子19多态性中的至少一种和其他多态性。上述其他多态性并无特别限制，其例如是EGFR基因的EGFR790多态性等等。仅检测上述EGFR858多态性时，上述本发明的多态性检测用探针中，优选使用上述EGFR858用探针。上述EGFR858用探针例如可以是EGFR858用野生型探针，可以是 EGFR858用突变型探针，也可以组合使用两者。仅检测上述外显子19多态性时，上述本发明的多态性检测用探针中，优选使用上述外显子19用野生型探针、上述外显子19用突变型(sub)探针以及上述外显子19用突变型(del)探针中的至少任意一种。通过使用上述外显子19用野生型探针，例如能检测出外显子19多态性是外显子19野生型(上述多态性1)还是外显子19突变型(上述多态性 2 17)；通过使用上述外显子19用突变型(sub)探针，例如能检测出外显子19多态性是外显子19野生型(上述多态性1)还是外显子19突变型(上述多态性2 15，17)通过使用上述外显子19用突变型(del)探针，例如能检测出外显子19多态性是外显子19野生型(上述多态性1)还是外显子19突变型(上述多态性18)。本发明中，可以使用上述外显子 19用野生型探针、上述外显子19用突变型(sub)探针以及外显子19用突变型(del)探针中的任意一种，能够判断出是上述多态性1还是上述多态性2 18，也可以组合使用两种以上探针。探针的组合无特别限制，例如，优选地，P5与P7的组合能够检测多态性1 18的 18种多态性；P6与P7的组合能够检测多态性16以外的17种多态性(P5自身淬灭，P6自身不淬灭)；单独使用P5能够检测出多态性18以外的17种多态性；单独使用P6能够检测出多态性16、18以外的16种多态性(P5自身淬灭，P6自身不淬灭)；单独使用P7仅能检测出多态性18—种多态性。本发明中，将上述EGFR858用探针和上述外显子19用探针组合使用是令人期望的。本发明的探针，如前文所述，能够以优秀的可信度检测出多态性，因此，即时在同一反应液中使用上述EGFR858用探针和上述外显子19用探针，也能够分别特异性地检测上述 EGFR858多态性和上述外显子19多态性。上述外显子19用探针，如前文所述，优选地为，组合使用上述外显子19用野生型探针、上述外显子19用突变型(sub)探针和外显子19用突变型(del)探针。本发明，例如，还可以检测上述EGFR790的多态性，还优选同时检测上述EGFR858 的多态性和/或上述外显子19的多态性。“同时检测”例如包括使用同一反应体系进行检测的含义。此时，除上述两种探针以外，本发明还可以组合使用上述EGFR790用探针。上述EGFR790用探针，无特别限制，例如是包括下述(P14)的寡核苷酸的探针。(P14)寡核苷酸，其包括与碱基长为14 50个碱基长的、以序列编号21所示的碱基序列中第334位碱基(g)作为5’末端的寡核苷酸互补的碱基序列或与所述互补的序列具有同源性的碱基序列，其中，与第347位碱基对应的碱基是鸟嘌呤或腺嘌呤，与第334位对应的碱基是胞嘧啶。包括上述(P14)的寡核苷酸探针，例如是用于检测序列编号21所示的碱基序列中第347位的碱基的替换突变的有无的探针。上述(P14)的寡核苷酸例如与EGFR基因的正义链互补，能够通过与上述正义链的杂交来确定上述多态性。上述(P14)的寡核苷酸中，与序列编号21的第347位碱基对应的互补的碱基表示为r，所述r为鸟嘌呤(g)和腺嘌呤(a)。 其中r为鸟嘌呤(g)的上述寡核苷酸与EGFR790野生型的检测序列的杂交比对EGFR790突变型的检测序列的杂交更强，因此可被称为EGFR790野生型用探针。其中r为腺嘌呤(a)的上述寡核苷酸与EGFR790突变型的检测序列的杂交比对EGFR790野生型的检测序列的杂交更强，因此可被称为EGFR790突变型用探针。通过判断这些寡核苷酸与上述EGFR790基因的检测序列中EGFR790野生型的检测序列或EGFR790突变型的检测序列中任一的强杂交， 就能检测EGFR基因的多态性。上述(P14)的寡核苷酸中，3’末端为胞嘧啶。上述(P14)的寡核苷酸例如是序列编号22所示的寡核苷酸，该碱基序列中r如前文所述。上述寡核苷酸的具体例子例如是EGFR790用突变型探针(序列编号23所示的寡核苷酸)以及EGFR790用野生型探针(序列编号M所示的寡核苷酸)。5' -tgagctgcrtgatgaggtgcac-3'(序列编号 22)5，-tgagctgcatgatgaggtgcac-3‘(序列编号 23) (3T-EGFR-T790M_mt-R3)5，-tgagctgcgtgatgaggtgcac-3，(序列编号 24)本发明中，如前文所述，上述P14的寡核苷酸可以是具有下述序列的寡核苷酸，所述序列与例举的上述序列中任一具有同源性。上述同源性例如是80%以上，优选85%以上，更优选90%以上，进一步更优选95%以上，最优选96%以上、97%以上、98%以上、99% 以上、100%。(A)步骤中，当上述多态性检测用探针两种以上组合使用时，优选地，各探针是具有不同标记物质的标记探针。所述不同的标记物质例如是检测条件不同的标记物质。本发明中，上述被检测核酸可以是单链核酸，也可以是双链核酸。当上述被检测核酸为上述双链核酸时，例如，如后文所述，所述步骤(A)中优选包括对所述反应体系进行加热、使得双链的所述被检测核酸解离的步骤。由于上述双链核酸解离为单链核酸，例如，本发明的多态性检测用探针易于与所述单链核酸杂交。本发明中，上述被检测核酸例如可以是样品中原本含有的核酸，为了提高检测精度，其也可以是以上述核酸为模板核酸、通过核酸扩增法扩增得到的扩增产物。上述扩增产物例如可以是以上述样品中的DNA为模板得到的扩增产物。而且，上述被检测核酸例如可以是将上述样品中总RNA、mRNA等RNA通过RT-PCR(Revese Transcripition PCR)合成得到的cDNA，也可以是以上述cDNA为模板得到的扩增产物。上述扩增产物例如优选是含有上述检测序列的区域的扩增产物。上述检测序列的上述检测位点例如可以仅含有上述EGFR858 多态性的检测位点，也可以仅含有上述外显子19多态性的检测位点。此外，上述检测位点可以同时含有上述EGFR858多态性和上述外显子19多态性。进一步，上述检测位点还可以含有上述EGFR790多态性。例如当上述被检测核酸为上述扩增产物时，本发明的多态性检测方法可以进一步包括由上述模板核酸生成上述扩增产物的步骤。上述扩增产物的产生步骤例如可以在上述 (A)步骤之前进行，也可以在上述(A)步骤中进行。当上述被检测核酸为上述扩增产物时，上述(A)步骤中，例如可以使用预先制备得到的扩增产物来制备含有本发明的多态性检测用探针与上述扩增产物的反应体系；也可以在存在本发明的多态性检测用探针的情况下，在上述反应体系中，由上述模板核酸产生上述扩增产物，然后制备含有上述多态性检测用探针和上述扩增产物的反应体系。上述核苷酸的扩增方法无特别限制，例如是PCR(聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction)法、NASBA(基于核酸序列的扩增，Nucleic Acid Sequence Based Amplification)法、TMA(转录介导的扩增，Transcription Mediated Amplification)法、 SDA(链置换扩增，Strand Displacement Amplification)法等，其中PCR法是优选地。此外，上述扩增方法的条件无特别限制，可以使用现有的公知的方法进行操作。对由上述模板核酸产生上述扩增产物而言，例如，优选使用用于扩增含有EGFR基因中检测目标多态性的序列的引物。通过上述引物得到的扩增区域无特别限制，可以根据检测目标多态性进行适当设定，即，检测目标多态性为上述EGFR858多态性时，上述扩增区域例如是含有上述EGFR858 基因多态性检测位点的区域，即，优选为序列编号1的碱基序列中含有第261位碱基的区域。具体而言，优选为EGFR基因的序列编号1所示的碱基序列中含有与寡核苷酸P1、P3及 P15 P19中的至少一个寡核苷酸杂交的序列的区域。此外，检测目标多态性为上述外显子 19多态性时，上述扩增区域，例如为含有上述外显子19多态性的检测位点的区域，即，优选为序列编号2的碱基序列中含有第112 151位碱基的区域。具体而言，优选为含有与序列编号2所示的碱基序列中P5 P6的寡核苷酸以及序列编号3所示的碱基序列中P7的寡核苷酸中的至少一个杂交的序列的区域。此外，检测目标多态性为上述EGFR858多态性和外显子19多态性时，上述扩增区域例如可以是含有上述EGFR858多态性检测位点的区域和含有上述外显子19多态性检测位点的区域和这两个区域二者。上述扩增区域，还例如可以含有含上述EGFR790基因多态性检测位点的区域。此外，上述引物的序列无特别限制，其例如能够扩增含有上述检测位点的检测序列即可，也可以根据上述检测序列及其周围序列等，按现有公知的方法进行合适的设定。上述引物的长度无特别限制，可以设定为一般的长度，例如为16 50个碱基长。上述引物可以使用扩增正义链的正向引物(下文也称为“F引物”)以及扩增反义链的反向引物(下文也称为“R引物”)中的任意一种，使用将两者作为一对的引物组是优选的。下文将以上述引物的一个例子来说明本发明的引物。用于检测EGFR外显子21 L858基因突变的引物，例如是用于扩增EGFR基因的序列编号1所示的碱基序列中的下述区域的引物，所述区域含有与P1、P3及P15 P19中的至少一种寡核苷酸杂交的序列，作为具体的例子，所述引物是选自下述P8 PlO的多态性检测用引物。(P8)与序列编号1同源的10 50个碱基的寡核苷酸，其中以第233位的碱基C 作为3’末端，(P9)与序列编号1互补的10 50个碱基的寡核苷酸，其中以与第284位的碱基 G互补的碱基C作为3’末端，(PlO)与序列编号1互补的10 50个碱基的寡核苷酸，其中以与第290位的碱基 G互补的碱基C作为3’末端.上述P8的寡核苷酸，例如是序列编号15记载的寡核苷酸；上述P9的寡核苷酸，例如是序列编号17记载的寡核苷酸；上述PlO的寡核苷酸，例如是序列编号16记载的寡核苷酸。5，-aggaacgtactggtgaaaacaccgc-3‘(序列编号 I5) (EGFR-L858R-F2)5，-ttactttgcctccttctgcatggtattc-3，(序歹[J编号 16) (EGFR-L858R-R2)5，-gcctccttctgcatggtattctttctc-3，(序歹[J编号 17) (EGFR-L858R-R1)此外，用于检测EGFR外显子19缺失的基因突变的引物例如是用于扩增下述区域的引物，所述区域含有与EGFR基因的序列编号2所示的碱基序列中P5及P6中至少一种寡核苷酸杂交的序列，或者含有与序列编号3所示的碱基序列中P7的寡核苷酸杂交的序列， 作为具体例子，所述引物是选自下述Pll P13的多态性检测用引物。(Pll)与序列编号2同源的10 50个碱基的寡核苷酸，其中以第95位的碱基G 作为3’末端，(P12)与序列编号2同源的10 50个碱基的寡核苷酸，其中以第73位的碱基C 作为3’末端，(P13)与序列编号2互补的10 50个碱基的寡核苷酸，其中以与第155位的碱基 G互补的碱基C作为3’末端。上述Pll的寡核苷酸，例如是序列编号18记载的寡核苷酸；上述P12的寡核苷酸， 例如是序列编号19记载的寡核苷酸；上述P13的寡核苷酸例如是序列编号20记载的寡核苷酸。5，-gatcccagaaggtgagaaag-3，(序列编号 18) (EGFR-EX19-F1)5，-tctctctgtcatagggactc-3，(序列编号 19) (EGFR-EX19-F2)5，-gaaactcacatcgaggatttc-3，(序列编号 20) (EGFR-EX19-R1)上述反应体系中，上述引物的添加浓度无特别限制，例如，对于一种引物，可以为 0. 1 4 μ mol/L,优选为0. 25 1. 5 μ mol/L,特别优选为0. 5 1 μ mol/L。此外，使用F 引物和R引物二者时，上述F引物(F)和上述R(R)引物的添加比例(摩尔比F R)无特别限制，例如，优选为1 0.25 1 4，更优选为1 0. 5 1 2。上述步骤(A)中，本发明的多态性检测用探针相对于上述被检测核酸的添加比例 (摩尔比)无特别限制，为能充分确保检测信号，优选为1倍以下。此时，上述被检测核酸例如可以是，含有野生型检测序列的核酸和含有突变型检测序列的核酸的组合，也可以是含有野生型检测序列的扩增产物和含有突变型检测序列的扩增产物的组合。而且，被检测核酸中，含有与上述多态性检测用探针更强杂交的检测序列的核酸比例通常未知，但结果， 上述多态性检测用探针的添加比例(摩尔比)优选为相对于含有更强杂交的检测序列的核酸(含有上述检测序列的扩增产物)而言20倍以下，更优选为10倍以下，进一步更优选为5倍以下。此外，其下限无特别限制，例如为0. 001倍以上，优选为0. 01倍以上，更优选为0. 1倍以上。本发明的多态性检测用探针与上述被检测核酸的添加比例，例如可以是相对于双链核酸的摩尔比，也可以是相对于单链核酸的摩尔比。本发明的多态性检测用探针在上述反应体系中的添加浓度无特别限制，例如，对于每一种上述的多态性检测用探针而言，以10 lOOOnmol/L的范围添加是优选的，更优选为 20 500nmol/L。适用于本发明的多态性检测方法的样品无特别限制，其可以是生物体样品。上述生物体样品的具体例子例如，全血，白细胞等血细胞，骨髓，口腔粘膜等口腔细胞，指甲、毛发等体细胞，生殖细胞，痰液，羊水，石蜡包埋的组织，尿液，胃液，洗胃液等。本发明中，上述样品的采取方法以及由所述样品制备被检测核酸的方法无特别限制，可采用已有的公知方法。当上述生物体样品为全血时，上述全血在上述反应体系中的浓度例如为0. 01 2体积％，优选为0. 05 1. 5体积％，更优选为0. 1 1体积％。此外，当上述生物体样品为血清时，上述血清在上述反应体系中的浓度例如为0. 1 20体积％，优选为0. 25 15体积％，更优选为0. 5 10体积％。如上文所述，本发明的多态性检测方法能利用所谓的Tm分析(又称熔解曲线分析)。下面，对Tm分析中的Tm值进行说明。例如，对含有双链DNA的溶液进行加热时，260nm 处的吸光度会升高。原因是因为，双链DNA两链之间的氢键由于加热而断裂，解离为单链 DNA (DNA的熔解)。因此，当所有双链DNA全部解离成为单链DNA时，该吸光度显示为加热开始时的吸光度(仅双链DNA时的吸光度)的约1. 5倍，由此可以判断熔解完全。根据该现象，一般而言，熔解温度Tm值被定义为吸光度达到吸光度最大上升值的50%时的温度。在上述(A)步骤中，对显示上述被检测核酸和上述多态性检测用探针的杂交形成体的熔解状态的信号的测定，如前文所述，优选为对上述荧光色素的信号进行测定。上述探针例如是单独存在时显示信号并且形成杂交体时不显示信号的标记探针；或者是单独存在时不显示信号并且形成杂交体时显示信号的标记探针。前一种探针的情况下，与上述扩增产物形成杂交体(双链DNA)时不显示信号，加热后上述探针从上述扩增产物上解离时显示信号。后一种探针的情况下，与上述扩增产物形成杂交体(双链DNA)时显示信号，加热后上述探针从上述扩增产物上解离时信号减少(消失)。因此，通过检测上述荧光色素的信号，与测定260nm处的吸光度一样，能够确定杂交形成体的熔解过程以及Tm值。上述荧光色素的信号检测，例如可在对上述荧光色素的信号来说特殊的条件下进行检测，上述条件例如是激发波长、检测波长等。而且，关于上述标记探针和上述荧光色素，参见前文所述。下面，以一具体实施方式
来说明本发明的多态性检测方法。在该实施方式中，使用经荧光色素标记的标记探针作为本发明的多态性检测用探针，存在上述多态性检测用探针时，从模板核酸进行扩增，将得到的扩增产物用作为上述被检测核酸。而且，本发明的多态性检测方法的特征在于其本身使用多态性检测用探针，其他步骤、条件无任何限制。首先，从上述生物体样品中分离出基因组DNA。可以采用已有的公知方法，来从所述生物体样品中分离出基因组DNA。具体例子例如，可以使用市售的基因组DNA分离试剂盒 (商品名 GFX Genomic Blood DNA Purification kit ；GE Healthcare Bioscience 公司制造)等。接下来，向含有经分离的基因组DNA的样品中添加标记探针，制备反应液。上述标记探针例如优选是前文所述的QProbe (注册商标)。上述标记探针例如可添加至含有经分离的基因组DNA的样品中，也可以在溶剂中与基因组DNA混合。上述溶剂无特别限制，例如是Tris-HCl等缓冲溶液，含有KC1、MgCl2、 MgSO4、甘油等的溶剂，PCR用反应液等扩增用反应液等已有的公知溶剂。而且，上述标记探针的添加时机无特别限制，例如可以在扩增反应之前、期间或之后添加。其中，例如，为了进行添加，不必将上述反应液暴露给外部环境，并且，所述扩增反应和信号值的测定可连续进行，因此，在上述扩增反应前添加上述反应液是优选的。此时， 如前文所述，上述标记探针优选是其3’末端被标记物质或磷酸基团修饰的探针。接下来，以经分离的基因组DNA为模板，在上述标记探针存在的情况下，通过PCR 等扩增方法，扩增含有发生目标多态性的检测位点的序列。下面以PCR作为扩增方法的例子，对本发明进行说明，但不限于此例。此外，PCR的条件无特别限制，可按照已有的公知的方法进行。具体地，使用含有上述基因组DNA、上述标记探针以及上述引物的所述反应液进行 PCR0该反应液的组成无特别限制，本领域技术人员可以进行合适的设定，例如，除上述基因组DNA、上述标记探针以及上述引物之外，还有DNA聚合酶等聚合酶、三磷酸核苷、缓冲液、 各种催化剂等。上述反应液中的上述标记探针以及上述引物的添加比例无特别限制，例如分别为前文所述的范围。上述DNA聚合酶无特别限制，例如可以使用现有公知的来源于耐热细菌的聚合酶。作为具体例子，来源于水生栖热菌(Thermus aquaticus)的DNA聚合酶(美国专利4，889，818和5，079，352)(商品名Taq聚合酶)、来源于嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的DNA聚合酶(W091/09950) (rTth DNA聚合酶)、来源于极端嗜热菌 (Pyrococcus furiosus)的 DNA 聚合酶(W0 92/9689) (Pfu DNA 聚合酶，Stratagenes 公司制造)、来源于附岸热球菌(Thermococcus litoralis)的DNA聚合酶(EP-A45M30 (商标 Vent) =New England Biolabs公司制造)等可商业获得的DNA聚合酶，其中来源于水生栖热菌(Thermus aquaticus)的耐热性聚合酶是优选的。上述反应液中DNA聚合酶的添加比例无特别限制，例如是1 100U/mL，优选为 5 50U/mL，更优选为20 40U/mL。此外，关于DNA聚合酶的活性单位(U)，一般来说，以活化的鲑鱼精DNA作为模板引物，在活性测定用反应液中，在74°C，30分钟内将IOnmol的所有核酸转换为酸不溶性沉淀物的活性被记为1U。上述活性测定用反应液的组成例如是 25mmol/L TAPS 缓冲液(pH 9. 3，25°C )、50mmol/L KCl、2mmol/LMgCl2、lmmol/L 巯基乙醇、 200 μ mol/L dATP、200 μ mol/L dGTP、200 μ mol/L dTTPUOO μ mol/L “ α -32P"dCTP 缓冲液、 0. 25mg/mL活化的鲑鱼精DNA。上述三磷酸核苷通常是dNTP (dATP、dCTP、dGTP以及dTTP或dUTP)。上述反应液中dNTP的添加比例无特别限制，例如是0. 01 lmmol/L，优选为0. 05 0. 5mmol/L,更优选为 0. 1 0. 3mmol/L0上述缓冲液例如是iTris-HCl、Tricine, MES、MOPS、HEPES, CAPS等，可以使用市售的PCR用缓冲液和市售的PCR试剂盒的缓冲液。此外，上述反应溶液还可以含有肝素、甜菜碱、KCl、MgCl2、MgS04、甘油等，这些物质的添加比例，例如被设定在不妨碍PCR反应的范围内即可。上述反应液的总体积无特别限制，例如可以根据使用的热循环仪等仪器进行适当设定，其通常为1 500 μ L，优选为10 100 μ Lo下面进行PCR反应。上述PCR的循环条件无特别限制，例如，关于⑴作为被检测核酸的双链DNA向单链DNA的解离，(2)引物向上述单链DNA的退火，(3)上述引物通过聚合酶反应的延伸，可分别例如下表2所示的条件。此外，循环数无特别限制，下述(1) (3) 的三步作为1个循环，例如30个循环以上是优选的。上述循环数总和的上限无特别限制， 例如是100个循环以下，优选为70个循环以下，进一步优选为50个循环以下。各步的温度变化，例如可以通过热循环仪等进行自动控制。[表 2]
温度(°c)和时间(秒)(1)单链DNA的解离例如90 99°C、1 120秒优选为92 95°C、1 60秒(2)引物的退火例如40 70 0C、1—300秒优选为50 70°C、5 60秒(3)延伸反应例如50 80°C、1—300秒优选为50 75"C、5 60秒 上述反应液中标记探针的添加比例无特别限制，例如，上述标记探针以10 1000nmol/L的范围添加是优选的，更优选为20 500nmol/L的范围。此外，例如，为了确保充分的信号值，上述反应液中，上述标记探针与上述被检测核酸的摩尔比，例如优选为1倍以下。上述标记探针与上述被检测核酸的添加比例，例如可以是与双链核酸的摩尔比，也可以是与单链核酸的摩尔比。
下面进行得到的扩增产物(双链DNA)的解离以及进行经解离得到的单链DNA与上述标记探针的杂交。上述反应，例如可在标记探针存在的情况下，改变上述反应液的温度来进行。此时，如前文所述，对于预先添加了上述标记探针的上述反应液来说，扩增反应结束后改变上述反应液的温度是优选的。上述解离步骤中的加热温度，即双链的上述扩增产物能解离为单链的温度无特别限制，例如是85 95°C。加热时间无特别限制，通常为1秒 10分钟，优选为1秒 5分钟。解离的单链DNA与上述标记探针的杂交例如可在上述解离步骤之后，通过降低解离步骤的加热温度来实现。温度条件例如是40 50°C。此外，上述温度的处理时间无特别限制，其例如是1 600秒。然后，改变上述反应液的温度，测定显示上述扩增产物与上述标记探针的杂交形成体熔解状态的信号值。具体地，例如，对上述反应液(上述单链DNA与上述标记探针的杂交形成体)加热，测定伴随温度上升的信号值的变化。如前文所述，使用鸟嘌呤淬灭探针 (即末端胞嘧啶(c)被标记的探针)时，其与单链DNA杂交的状态下荧光强度减少(或淬灭)，解离的状态下则发出荧光。因此，可以对荧光强度减少(或淬灭)的杂交形成体逐渐加热，测定伴随温度上升的荧光强度的增加。测定上述荧光强度变化时的温度范围无特别限制，起始温度例如是室温 85°C， 优选为25 70V ；终止温度例如是40 105°C。此外，温度的上升速度无特别限制，例如是0. 1 20°C /秒，优选为0. 3 5°C /秒。下面，分析上述信号值的变化，来确定Tm值。具体地，从测得的荧光强度计算出各温度点下单位时间内荧光强度的变化量(_d荧光强度增加量/dt)，显示为最低值的温度即确定为Tm值。此外，还可以将单位时间内荧光强度的增加量(d荧光强度增加量/dt)的最高点确定为Tm值。而且，上述标记探针不是荧光淬灭探针而是单独存在时不显示信号但形成杂交体后显示信号的探针时，与之前相反，可以测定荧光强度的减少量。上述iTm值，例如可根据已有的公知的MELTCALC软件(http://www. meltcalc. com) 计算得出，或者，也可以根据最邻近碱基对法(Nearest Neighbor Method)来确定。接下来，根据上述Tm值来确定EGFR基因的多态性是上述野生型还是上述突变型。 上述Tm分析中，野生型探针对上述野生型检测序列的杂交比对上述突变型检测序列的杂交更强。因此，较之上述野生型探针和上述突变型检测序列的Tm值，上述野生型探针和上述野生型检测序列的Tm值显示为更高的值。另一方面，突变型探针对上述突变型检测序列的杂交比对上述野生型检测序列的杂交更强。因此，较之上述突变型探针和上述野生型型检测序列的Tm值，上述突变型探针和上述突变型检测序列的Tm值显示为更高的值。通过预先确定上述探针与检测序列强杂交的Tm值(TmH)和探针以比该Tm值(TmH) 更低的值与检测序列杂交的Tm值(TnO，可以确定上述检测序列含有上述野生型多态性和上述突变型多态性中的某一个。此外，通过预先确定上述野生型探针对上述野生型检测序列强杂交的Tm值(TmH)，使用上述野生型探针得到比上述Tm值(TmH)更低的Tm值(TmJ时， 可以确定为上述突变型检测序列。另一方面，通过预先确定上述突变型探针对上述突变型检测序列强杂交的Tm值(TmH)，使用上述突变型探针得到比上述Tm值(TmH)更低的Tm值 (TmL)时，可以确定为上述野生型检测序列。
例如，使用突变型探针作为上述探针时，显示出与预定的突变型检测序列的Tm值 (Tma)时，可判断多态性为突变型，显示出比与预定的突变型检测序列的Tm值(TmH)更低的 Tm值(TnO时，可判断多态性为野生型。另一方面，例如，使用野生型探针作为上述探针时， 显示出与预定的野生型检测序列的Tm值(TmH)时，可判断多态性为野生型，显示出比与预定的野生型检测序列的Tm值(TmH)更低的Tm值(TmJ时，可判断多态性为突变型。此外，如前文所述，作为本发明中的方法(升高含有上述多态性检测用探针的反应体系的温度(对杂交形成体进行加热)、测定伴随温度升高的信号值的变化)的替代方法，例如也可以测定杂交体形成时信号值的变化。即，也可以降低含有上述多态性检测用探针的反应体系的温度以形成杂交形成体时，测定伴随上述温度降低的信号值的变化。作为具体实施方式
，使用单独存在时显示出信号、形成杂交体后不显示信号的标记探针(例如鸟嘌呤淬灭探针)的情况下，单链DNA与上述标记探针在保持解离的状态下发出荧光，降低温度形成杂交体时，上述荧光减少(或淬灭)。因此，例如，可以逐渐降低上述反应液的温度，测定伴随温度的荧光强度减少。另一方面，使用单独存在时不显示信号、 形成杂交体后显示信号的标记探针的情况下，上述单链DNA与上述标记探针在保持的解离状态下不发出荧光，降低温度形成杂交体时开始发出荧光。因此，例如，可以逐渐降低上述反应液的温度，测定伴随温度降低的荧光强度的增加。本发明中，如前文所述，例如可以在同一反应体系中使用两种以上的多态性检测用探针。使用多种多态性检测用探针对情况下，各探针的添加时机，例如与前文所述相同， 在上述(A)步骤之前加入、同时加入是优选的，在进行扩增反应的情况下，在扩增反应进行前加入、同时加入是优选的。多种探针例如是上述EGFR858用探针和上述外显子19用探针的组合，具体地，例如，可举例为上述EGFR858用探针和上述外显子19用野生型探针的组合，上述EGFR858用探针和上述外显子19用突变型(del)探针的组合，上述EGFR858用探针和上述外显子19 用野生型探针以及上述外显子19用突变型(del)探针的组合。本发明中，例如，还可组合所述EGFR790用探针。在同一体系中检测上述EGFR858多态性和外显子19多态性二者时，可以组合使用上述EGFR858用探针和上述外显子19用探针。此时，上述EGFR858用探针和上述外显子19 用探针，如前文所述，优选地分别具有不同的标记物质。然后，可以通过改变上述反应液的温度，对应于各标记物质的测定条件检测信号，来分别确定Tm值。此外，针对上述EGFR858多态性或上述EGFR790多态性的检测，分别地，例如，可组合使用针对目标多态性的上述野生型探针和突变型探针。此时，例如，可根据哪个探针显示出完全互补匹配的杂交体的Tm，来确定上述多态性的种类。例如，使用具有不同标记物质的突变型探针和野生型探针的情况下，突变型探针显示出完全互补的匹配杂交体的Tm值的话，则可判断多态性为突变型，野生型探针显示出完全互补的匹配杂交体的Tm值的话，则可判断多态性为野生型。此外，本发明的多态性检测方法，例如可以组合使用用于检测EGFR基因多态性的本发明的多态性检测用探针和用于检测其他基因多态性的探针。通过组合使用本发明的多态性检测用探针和用于检测其他基因的探针，能够在同一反应体系中检测出包括EGFR基因在内的两种以上基因的多态性。EGFR基因的上述其他多态性无特别限制，其例如是上述
28EGFR790多态性。<判定方法>本发明的判定方法特征在于使用本发明的多态性检测用探针的多态性检测方法， 其他步骤和条件无任何特别限制。此外，根据多态性对针对EGFR-TKI的耐药性或药效的判断，例如可以按照公知的基准进行。<试剂盒>本发明所用的试剂盒是用于检测EGFR基因中多态性的试剂盒，其特征在于含有上述的本发明的探针。本发明的试剂盒含有本发明的探针即可，对其他构成无特别限制。 本发明试剂盒中含有的本发明的探针可以是一种也可以是两种以上，其组合例如如前文所述。本发明的试剂盒例如还优选含有前文所述的本发明的引物，引物的组合无特别限制，如前文所述。本发明的试剂盒，例如还可含有核酸扩增反应必需的成份和使用说明书等。〈引物试剂〉本发明的引物试剂中可以含有上述的本发明引物中的任意一种，也可以含有两种以上。上述引物的种类，例如可以根据目标扩增区域来合适地确定。扩增含有上述EGFR858 多态性的检测序列的情况下，所述引物优选地包含包括上述P8、P9以及PlO的寡核苷酸的引物中的至少一种；特别地，优选地包含选自上文所述的序列编号15、序列编号16以及序列编号17所示的寡核苷酸构成的组中的至少一种引物。此外，在扩增含有上述外显子19多态性的检测序列的情况下，优选地包含包括上述Pll、P12以及P13的寡核苷酸的引物中的至少一种，特别地，优选地包含选自序列编号18、序列编号19以及序列编号20所示的寡核苷酸构成的组中的至少一种引物。本发明的引物试剂，例如通过含有上述P8的寡核苷酸、 和P9或PlO的寡核苷酸、和Pll或P12的寡核苷酸、和P13的寡核苷酸作为引物，可对含有上述EGFR 858多态性的检测序列以及含有上述外显子19多态性的检测序列进行扩增。此外，上述引物的组合，可如前文所述示例，但是不限于此。〈多态性检测用试剂〉本发明的多态性检测用试剂是用于检测EGFR基因的多态性的试剂，其特征在于含有本发明的多态性检测用探针。本发明中，特征在于含有上述的本发明的多态性检测用探针，其他构成、条件无任何特别限制。而且，本发明的多态性检测用试剂，例如也被称为 EGFR基因多态性检测用探针试剂盒。上述多态性检测用探针例如可以含有一种上述的多态性检测用探针，也可以含有两种以上，这可以根据检测目标多态性来合适地确定。在仅检测上述EGFR858多态性的情况下，例如优选地包含上述EGFR858用探针。上述EGFR858用探针可以是EGFR858用野生型探针，也可以是EGFR858用突变型探针，也可以同时含有两者。此外，在仅检测上述外显子 19多态性的情况下，例如优选包含上述外显子19用探针。上述外显子19用探针例如可以是外显子19用野生型探针、外显子19用突变型(sub)探针、外显子19用突变型探针(del) 中的任意一种，也可以是两种，也可以全部都含。上述探针的组合，可如前文所述示例，但是不限于此。<多态性检测用试剂盒>本发明的EGFR基因多态性检测用试剂盒是EGFR基因多态性检测用的试剂盒，其特征在于含有本发明的探针。本发明的试剂盒中，本发明的探针可以为一种，也可以为两种以上。对于后者的情况，两种以上的探针可以以混合状态被包含，也可以作为单独的试剂被包含。此外，两种以上的本发明的探针以混合状态包含于本发明的探针试剂盒中的情况下， 或者当作为分别的试剂被包含、但例如使用时在同一反应体系中进行对各探针和各检测对象序列的Tm分析的情况下，对各探针用分别的荧光物质进行标记是优选的。这样通过改变荧光物质的种类，即使在同一反应体系中也可针对各探针进行检测。上述荧光物质，例如优选为检测波长不同的物质。此外，EGFR基因多态性检测用试剂盒也可以包括用于扩增含有上述多态性位点的序列(探针杂交的区域)的探针组。实施例下面说明本发明的实施例。但是，本发明不限于下述实施例。实施例1在野生型质粒和突变型质粒的共存下，进行Tm分析，检测了 EGFR基因的EGFR858 多态性。 制备EGFR858野生型质粒(L858WT)和EGFR858突变型质粒(L858R)作为上述野生型质粒和突变型质粒。上述EGFR858野生型质粒(L858WT)中插入作为EGFR基因的部分序列的、序列编号1的第112位 第411位的寡核苷酸，其中序列编号1的第261位碱基(k) 为胸腺嘧啶(t)。上述EGFR858突变型质粒(L858R)中插入作为EGFR基因的部分序列的、 序列编号1的第112位 第411位的寡核苷酸，其中序列编号1的第261位碱基(k)为鸟嘌呤(g)。将这些质粒按照如下所示的设定比例进行混合，制备3种样品。每IyL上述样品包含250个拷贝的质粒。[表 3]样品各质粒的混合比例
权利要求
1.多态性检测用探针，所述探针是能检测EGFR基因的突变的探针，其特征在于所述探针包括选自下述P1、P3、P5 P7以及P15 P18中的至少一种经荧光标记的寡核苷酸(Pl)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号251 的 11 50个碱基长的碱基序列互补的序列或与所述互补的序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号261对应的碱基为腺嘌呤或胞嘧啶，与碱基编号251对应的碱基为胞嘧啶，所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P3)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号257 261的5 50个碱基长的碱基序列互补的序列或与所述互补的序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号261对应的碱基为腺嘌呤或胞嘧啶，与碱基编号257对应的碱基为胞嘧啶，所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P5)寡核苷酸，其具有与含有序列编号2所示的碱基序列中碱基编号104 112的9 50个碱基长的碱基序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号112同源的碱基为胸腺嘧啶， 与碱基编号104同源的碱基为胞嘧啶，所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P6)寡核苷酸，其具有与含有序列编号2所示的碱基序列中碱基编号104 119的 16 50个碱基长的碱基序列具有同源性的序列，其中，碱基编号119的碱基被G以外的碱基替换，与碱基编号104同源的碱基为胞嘧啶，所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P7)寡核苷酸，其具有与含有序列编号3所示的碱基序列中碱基编号136 145的 10 50个碱基长的碱基序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号145同源的碱基为胞嘧啶，所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P15)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号259 沈4的 6 50个碱基长的碱基序列互补的序列或与所述互补的序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号261对应的碱基为腺嘌呤或胞嘧啶，位于所述碱基3’侧的胞嘧啶被荧光色素标记；(P16)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号258 沈2的 5 50个碱基长的碱基序列互补的序列或与所述互补的序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号261对应的碱基为腺嘌呤或胞嘧啶，位于所述碱基5’侧的胞嘧啶被荧光色素标记；(P17)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号249 沈4的 16 50个碱基长的碱基序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号同源的碱基为胸腺嘧啶或鸟嘌呤，位于所述碱基5’侧的胞嘧啶被荧光色素标记；(P18)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号257 沈4的 8 50个碱基长的碱基序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号261同源的碱基为胸腺嘧啶或鸟嘌呤，位于所述碱基3’侧的胞嘧啶被荧光色素标记。
2.如权利要求1所述的探针，其中Pl的寡核苷酸在3’末端起算第1 3位的位置上具有经荧光色素标记的对应于碱基编号251的碱基；P3的寡核苷酸在3’末端起算第1 3位的位置上具有经荧光色素标记的对应于碱基编号257的碱基；P5的寡核苷酸在5’末端起算第1 3位的位置上具有经荧光色素标记的与碱基编号104同源的碱基；P6的寡核苷酸在5’末端起算第1 3位的位置上具有经荧光色素标记的与碱基编号 104同源的碱基；P7的寡核苷酸在3’末端起算第1 3位的位置上具有经荧光色素标记的与碱基编号 145同源的碱基；P15的寡核苷酸在3’末端起算第1 3位的位置上具有所述经荧光色素标记的胞嘧啶；P16的寡核苷酸在5’末端起算第1 3位的位置上具有所述经荧光色素标记的胞嘧啶；P17的寡核苷酸在5’末端起算第1 3位的位置上具有所述经荧光色素标记的胞嘧啶；P18的寡核苷酸在3’末端起算第1 3位的位置上具有所述经荧光色素标记的胞嘧啶。
3.如权利要求1所述的探针，其中Pl的寡核苷酸在3’末端具有经荧光色素标记的对应于碱基编号251的碱基； P3的寡核苷酸在3’末端具有经荧光色素标记的对应于碱基编号257的碱基； P5的寡核苷酸在5’末端具有经荧光色素标记的与碱基编号104同源的碱基； P6的寡核苷酸在5’末端具有经荧光色素标记的与碱基编号104同源的碱基； P7的寡核苷酸在3’末端具有经荧光色素标记的与碱基编号145同源的碱基； P15的寡核苷酸在3’末端具有所述经荧光色素标记的胞嘧啶； P16的寡核苷酸在5’末端具有所述经荧光色素标记的胞嘧啶； P17的寡核苷酸在5’末端具有所述经荧光色素标记的胞嘧啶； P18的寡核苷酸在3’末端具有所述经荧光色素标记的胞嘧啶。
4.如权利要求1 3中任意一项所述的探针，其中，所述经荧光标记的寡核苷酸在未杂交靶标序列时发出荧光，并且，与所述靶标序列杂交时荧光强度减少或增加。
5.如权利要求4所述的探针，其中，所述经荧光标记的寡核苷酸在未杂交靶标序列时发出荧光，与所述靶标序列杂交时荧光强度减少。
6.如权利要求1 5中任意一项所述的探针，其中，Pl的寡核苷酸的碱基长度为11 30个碱基，P3及P5 7的寡核苷酸的碱基长度为10 30个碱基，P15的寡核苷酸的碱基长度为16 30个碱基，P16的寡核苷酸的碱基长度为18 30个碱基，P17的寡核苷酸的碱基长度为20 30个碱基，P18的寡核苷酸的碱基长度为20 30个碱基。
7.如权利要求1 6中任意一项所述的探针，其中，所述探针是用于熔解曲线分析的探针。
8.EGFR基因中多态性的检测方法，其特征在于使用权利要求1 7中任意一项所述的探针。
9.如权利要求8所述的方法，其中，还包括检测EGFR外显子20T790M的多态性。
10.判定对EGFR-TKI的耐药性或EGFR-TKI的药效的方法，所述方法包括利用权利要求8或9所述的方法来检测EGFR基因中的多态性的步骤，以及，根据多态性的有无来判定对EGFR-TKI的耐药性或药效的步骤。
11.用于检测EGFR基因中多态性的试剂盒，所述试剂盒含有权利要求1 7中任意一项所述的探针。
12.如权利要求11所述的试剂盒，所述试剂盒还含有检测EGFR外显子20T790M的多态性的探针。
13.如权利要求11所述的试剂盒，所述试剂盒还含有下述引物，所述引物用于扩增 EGFR基因的序列编号1所示的碱基序列中、含有与P1、P3及P15 P18中至少一种寡核苷酸杂交的序列的区域；序列编号2所示的碱基序列中、含有与P5及P6中至少一种寡核苷酸杂交的序列的区诚 或序列编号3所示的碱基序列中、含有与Ρ7的寡核苷酸杂交的序列的区域。
14.如权利要求13所述的试剂盒，所述试剂盒还含有检测EGFR外显子20Τ790Μ的多态性的探针。
15.能检测EGFR基因的突变的引物，所述引物是选自下述Ρ8 13的多态性检测用引物(Ρ8)与序列编号1同源的10 50个碱基的寡核苷酸，其中以第233位的碱基C作为 3’末端，(Ρ9)与序列编号1互补的10 50个碱基的寡核苷酸，其中以与第284位的碱基G互补的碱基C作为3’末端，(PlO)与序列编号1互补的10 50个碱基的寡核苷酸，其中以与第290位的碱基G互补的碱基C作为3’末端，(Pll)与序列编号2同源的10 50个碱基的寡核苷酸，其中以第95位的碱基G作为 3’末端，(Ρ12)与序列编号2同源的10 50个碱基的寡核苷酸，其中以第73位的碱基C作为 3’末端，(Ρ13)与序列编号2互补的10 50个碱基的寡核苷酸，其中以与第155位的碱基G互补的碱基C作为3’末端。
全文摘要
本发明提供了能够简便且以优秀的可信度来判别关于EGFR基因中不同多态性的多态性检测用探针、扩增用引物及其用途。选自P1、P3、P5～P7及P15～P18中的至少一种经荧光标记的寡核苷酸作为多态性检测用探针来使用。
文档编号C12Q1/68GK102559866SQ20111034837
公开日2012年7月11日 申请日期2011年10月31日 优先权日2010年10月29日
发明者井口亚希, 伊集院萌子 申请人:爱科来株式会社