专利名称：一株纤维素酶产生菌株p5的制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株纤维素酶产生菌株P5的制备和应用，及其菌种鉴定的方法，所筛选到的细菌其分泌型纤维素酶具有适应温度范围广、耐一定酸碱性的特点。
背景技术：
纤维素是自然界中分布广泛且产量最丰富的一种碳水化合物资源，但是由于降解困难，导致纤维素资源的利用率非常的低。比如秸秆和皮壳等原料大部分都被焚烧掉，这样做既危害生态平衡，又加重环境污染。纤维素分子可被纤维素酶降解。纤维素酶是一个酶系，能降解β-1，4-葡萄糖苷键。纤维素酶的研究是纤维素资源综合利用的基础。目前用于纤维素生物降解研究的微生物大多属于真菌，而在细菌中筛选开发高效纤维素降解菌和纤维素酶的研究相对要少很多。纤维素降解细菌的研究大多集中在芽胞杆菌类，在 ma/^iis中的研究未有报道。随着分子生物学、基因工程的迅猛发展，国内外均尝试应用基因工程技术来筛选、改造和构建高效纤维素降解菌株、开发新型高效的纤维素酶。因此， 需要通过生物技术方法加大对细菌纤维素酶的研究，以开发出新型的纤维素酶。
发明内容
本发明的目的在于提供一株新型纤维素酶产生菌，以及通过16S rDNA对菌株鉴定的方法。所筛选到的纤维素酶产生菌株P5具有适应温度范围广、耐一定酸碱性的特点。能被应用于生物能源、洗衣纺织、食品加工、发酵生产等多个行业。本发明的技术方案是一株纤维素酶产生菌，所述菌株在中国普通微生物保藏管理中心的保藏号为CGMCC NO. 5356 ；保藏日期2011年10月17日，分类命名为Paflioea a/K^aiis，菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO. 1所述。该菌株的16S rDNA基因序列已登录Genbank数据库，登录号是FJ796221。上述纤维素酶产生菌的制备方法为
(1)从腐烂植物枝叶表面及附近的土壤中分离样品，样品加入50mLLB培养基中，在250 mL锥形瓶中，以160 rpm转速于37° C培养M h涂布于LB固体平板上，获得菌株；所述 LB液体培养基组分为每IL蒸馏水中含有蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl IOg ；所述LB固体平板组分为每IL蒸馏水中含有蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl IOg琼脂粉12g ；
(2)将菌落接种到产纤维素酶菌株筛选培养基，于培养温箱中培养2-4d，筛选纤维素酶的产生菌，所用的培养基为每IL培养基中含有羧甲基纤维素钠10 g，蛋白胨10g，酵母粉5 g, KH2PO4 1 g，MgSO4 0.2 g, NaCl 10 g，葡萄糖2 g，琼脂粉12 g，以蒸馏水补足体积至IL ；
(3)将0.5%的刚果红倒入接种培养后的产纤维素酶菌株筛选培养基中染色5 min，倒掉刚果红后，使用5%的NaCl溶液浸泡脱色lh，筛选获得产纤维素酶菌株。(4)对菌株16S rDNA基因克隆和序列分析；用于克隆细菌16S rDNA基因的通用
3上游引物序列为AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,通用下游引物序列为GGTTACCTTGTTA CGACTT 本发明的有益效果是用含有羧甲基纤维素钠的产纤维素酶菌株筛选培养基和基因工程技术手段，从土壤中筛选并鉴定本发明的纤维素酶产生菌株P5，经菌株分泌型纤维素酶特性分析表明，该菌分泌的纤维素酶具有适应温度范围广、耐一定酸碱性的特点。本发明采用的筛选和鉴定方法易操作，结果准确性高。该菌及其分泌的纤维素酶将在生物能源、洗衣纺织、食品加工、发酵生产等多个行业中具有应用潜力。
图1是纤维素酶产生菌株P5的基因组DNA和16S rDNA的琼脂糖凝胶电泳图(1 基因组 DNA ；2 =Marker,从上到下一次大小为 2000bp, IOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp ； 3 :16S rDNA)ο图2是培养时间对菌株P5产纤维素酶的影响数据图。图3是培养温度对菌株P5产纤维素酶的影响数据图。图4是pH对菌株P5纤维素酶酶活的影响数据图。图5是温度对菌株P5纤维素酶酶活的影响数据图。
具体实施例方式一、主要材料
(1)培养基
LB液体培养基组分为每L培养基中含有蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl IOg ； LB固体平板组分为每L培养基中含有蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl IOg琼脂粉12g ； 筛选培养基组分为每IL培养基中含有羧甲基纤维素钠10 g，蛋白胨10g，酵母粉5 g， KH2PO4 1 g，MgSO4 0.2 g, NaCl 10 g，葡萄糖 2 g，琼脂粉 12 g ；
发酵培养基组分为每L培养基中含有羧甲基纤维素钠10g，蛋白胨10g，酵母粉10g， KH2PO4 1 g, (NH4)2SO4 2 g，NaCl 5g。(2)实验仪器设备
FA2004电子天平——上海越平科学仪器有限公司
电子电炉——上海树立仪器仪表有限公司
DNP-9162型电热恒温培养箱——上海精宏实验设备有限公司
DYY-12型电泳仪——北京市六一仪器厂
YXJ-2高速离心机——常州国华电器有限公司
低速离心机——常州国华电器有限公司
数显式电热恒温水浴锅——上海跃进医疗器械厂
D-I型高压蒸汽灭菌锅——北京发恩科贸有限公司
7230G可见分光光度计——上海精密科学仪器有限公司
THZ-C恒温振荡器——太仓市实验设备厂
XS-213光学显微镜——南京江南永新光学有限公司
HYG型摇床——上海欣蕊自动化设备有限公司
Haier冰箱——青岛海尔集团
4移液器——大龙医疗设备(上海)有限公司三洋超低温冰箱——日本三洋电子有限公司 WD-9413A凝胶成像分析仪——北京六一仪器厂
二、一株纤维素酶产生菌株P5的筛选
(1)从腐烂植物枝叶表面及附近的土壤中分离样品，样品加入50mLLB培养基中，在250 mL锥形瓶中，以160 rpm转速于37° C培养M h涂布于LB固体平板上，获得菌株；
(2)将菌落接种到产纤维素酶菌株筛选培养基，于培养温箱中培养2-4d，筛选纤维素酶的产生菌，所用的培养基为每IL培养基中含有羧甲基纤维素钠10 g，蛋白胨10g，酵母粉5 g, KH2PO4 1 g，MgSO4 0.2 g, NaCl 10 g，葡萄糖2 g，琼脂粉12 g，以蒸馏水补足体积至IL ；
(3)将0.5%的刚果红倒入接种培养后的产纤维素酶菌株筛选培养基中染色5 min，倒掉刚果红后，使用5%的NaCl溶液浸泡脱色lh，筛选获得产纤维素酶菌株。三、菌株鉴定分析 (1)革兰氏染色
接菌于载玻片上；初染滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)染色1-2 min，水洗；媒染用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1 min，水洗；脱色用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗 (脱色时间一般为20-30 s)；复染用番红液复染约2 min，水洗；镜检干燥后，用油镜来观察。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的是革兰氏阴性菌。(2)菌株DNA的提取
按1%的接种量接种细菌到装有5 mLLB液体培养基的试管中，30 °C 150 r/min振荡培养过夜，使其生长至对数期，次日取1 mL菌液于1.5 mL离心管，1.0\104171^11离心1 min 沉淀菌液；弃上清，加450 PL蒸馏水，再加50 μ L 20%SDS，轻轻的上下颠倒离心管使之混勻，75 °C水浴5 min (直至菌液裂解变为澄清);500 μ L3 1的酚氯仿抽提蛋白质，轻轻上下颠倒使之混勻，IOOOOXg离心5 min ；轻轻吸取上清于一新的1.5 mL离心管(注意不要吸到中间的蛋白质)并补足体积到500 μ L，加500 yL3 1的酚氯仿，1. 0X IO4 r/min离心5 min，吸取上清，如此反复，直至看不到中间的蛋白质层为止(注意尽量防止DNA在抽提中发生断裂降解)；吸取上清于一新的1.5 mL离心管并补足体积到500 yL，加500 yL氯仿，轻轻混勻，1.0X104 r/min离心5 min ；吸取上清于一新的1. 5 mL离心管，加50 μ L 3Μ NaAc，然后加500 μ L的异丙醇，上下颠倒几次，此时应看到絮状沉淀产生，1.0Χ104 r/min 离心5 min ；将上清吸出，加1 mL70%乙醇清洗沉淀，1.0X104 r/min离心5 min，去上清，室温干燥；加20 PL无菌水溶解沉淀，取适量体积电泳检测DNA质量及浓度。提取的基因组 DNA见图1。(3)菌株16S rDNA序列分析
对菌株16S rDNA基因克隆和序列分析；用于克隆细菌16S rDNA基因的通用上游引物序列为AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,通用下游引物序列为GGTTACCTTGTTA CGACTT。PCR 反应条件是95 °C预变性5 min ；94 °C变性30 s ；57 °C退火60 s ；72 °C延伸90 s ；重复步骤2 4，反应22个循环；72 °C延伸10 min。将菌株16S rDNA连接到T载体上，筛选阳性克隆，送“上海生工生物工程技术服务有限公司”测序。将获得的16S rDNA序列提交NCBI网
5站，获得登录号。使用BLAST程序在GeneBank中进行序列比对，分析各产酶菌株的分类学地位，并分析筛选菌株与序列相近菌株的演化关系。PCR获得16S rDNA的电泳结果见图1。四、菌株纤维素酶活测定 (1)葡萄糖标准曲线制作
取6支洗净烘干的具塞刻度试管，编号后按0、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0 mL加入标准葡萄糖溶液，并分别使用蒸馏水定容至lmL，配制成一系列不同浓度的葡萄糖溶液。充分摇勻后， 向各试管中加入2 mLDNS溶液，摇勻后沸水浴5 min，取出冷却后用蒸馏水定容至25 mL，充分混勻。在MO nm波长下，以0号试管中的溶液作为空白对照，调零点，测定其它各管溶液的光密度值并记录结果。以葡萄糖含量(mg)为横坐标，以对应的吸光度值为纵坐标绘制出葡萄糖标准曲线。(2)粗酶液的制备
种子培养在试管中加入约1/3体积的LB液体培养基，接入菌种后置于观120 r/ min的摇床培养作为种子液。发酵培养种子培养12 h后，将所得种子液按洲接种量转接至装有发酵培养基的三角瓶中，置于37 120 r/min的摇床中培养。发酵液离心发酵培养至所需时间后，倒出适量发酵液，4000 r/min离心10 min, 取上清备用。(3)滤纸酶活测定
吸光度测定取4支具塞试管按0到3编号，0号管作为空白对照。向各试管加入2 mL 缓冲液，1、2、3号试管中加入1 mL粗酶液，4支试管同时在42 °C水浴中预热。5 min后将 6片事先剪成1 cmXl cm小片的新华1号滤纸放入试管内，42 °C保温。10 min后取出，迅速向各试管加入2 mLDNS显色液，并向0号试管中补加1 mL粗酶液。将各试管充分摇勻后在沸水浴中加热5 min,取出后迅速以流水冷却。冷却后用蒸馏水定容至25 mL,以0号试管中的溶液为空白对照，在MO nm波长下测定吸光度。酶活计算
将在42 ！条件下单位时间(1 min)内水解底物产生1 μ mol还原糖所需粗酶液量定义为一个酶活单位(U/mL)。酶活力计算公式见下式
酶活力(編)二二二_
180'/(J Xfr
式中k——表示葡萄糖标准曲线的斜率；
η——表示稀释倍数；
1000——表示mg转换成μ g ；
180——表示葡萄糖标准分子量；
t——表示反应时间(min)；
V——表示参与反应的粗酶液体积(mL)。(4)发酵条件优化
培养时间对产酶的影响发酵液在37 120 r/min的摇床中培养。每隔1 测定一
6次酶活。取产酶活性最高的培养时间作为最适培养时间。结果见图2。培养基初始pH对产酶的影响设定发酵液初始pH为2、4、6、8、10，在37 °C，120 r/min的摇床中培养。在最适培养时间于温度为42 °C，pH为4的条件下测定酶活。取产酶活性最高的初始PH作为最适初始pH。培养温度对产酶的影响设定发酵液初始pH为最适初始pH，分别于27 °C、32 V、 37 °C>42 °C>47 °C下，在120 r/min的摇床中培养。在最适培养时间于温度为42 °C，pH 为4的条件下测定酶活。取产酶活性最高的培养温度为最适培养温度。结果见图3。(5)酶学性质研究
以最适产酶条件下制备的粗酶液为原料。反应pH对酶活的影响分别使用pH为2、4、6、8、10的缓冲液，在42 ！反应条件下测定酶活。取测得酶活最高的PH为最适反应pH。结果见图4。反应温度对酶活的影响使用pH为最适反应pH的缓冲液，分别在27 °C、32 V、 37 °C、42 °C、47 ！反应条件下测定酶活。取测得酶活最高的温度为反应最适温度。结果见图5。上述实验的结果表明，本发明所述纤维素酶产生菌株P5分泌的纤维素酶具有适应温度范围广、耐一定酸碱性的特点。
权利要求
1.一株纤维素酶产生菌株P5，其特征在于所述菌株在中国普通微生物保藏管理中心的保藏号为CGMCC NO. 5356 ；分类命名为Pa/Jioea a/K^aiis，菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO. 1 所述。
2.如权利要求1所述的一株纤维素酶产生菌株P5的制备方法是，其特征在于(1)从腐烂植物枝叶表面及附近的土壤中分离样品，样品加入50mLLB培养基中，在250 mL锥形瓶中，以160 rpm转速于37° C培养M h涂布于LB固体平板上，获得菌株；所述 LB液体培养基组分为每IL蒸馏水中含有蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl IOg ；所述LB固体平板组分为每IL蒸馏水中含有蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl IOg琼脂粉12g ；(2)将菌落接种到产纤维素酶菌株筛选培养基，于培养温箱中培养2-4d，筛选纤维素酶的产生菌，所用的培养基为每IL培养基中含有羧甲基纤维素钠10 g，蛋白胨10g，酵母粉5 g, KH2PO4 1 g，MgSO4 0.2 g, NaCl 10 g，葡萄糖2 g，琼脂粉12 g，以蒸馏水补足体积至IL ；(3)将0.5%的刚果红倒入接种培养后的产纤维素酶菌株筛选培养基中染色5 min，倒掉刚果红后，使用5%的NaCl溶液浸泡脱色lh，筛选获得产纤维素酶菌株。
3.如权利要求1所述一株纤维素酶产生菌株P5的16SrDNA序列获得方法是对菌株16S rDNA基因克隆和序列分析；用于克隆细菌16S rDNA基因的通用上游引物序列为 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,通用下游引物序列为GGTTACCTTGTTACGAC TT。
4.如权利要求1所述纤维素酶产生菌株P5的应用，其特征在于所述纤维素酶产生菌株P5应用于生产纤维素酶。
全文摘要
本发明公开了一种新型维素酶产生菌株P5。该菌株在中国普通微生物保藏管理中心的保藏号为CGMCCNO.5356;菌株的16SrDNA序列如 SEQIDNO.1所述。用含有羧甲基纤维素钠的产纤维素酶菌株筛选培养基和基因工程技术手段，从土壤中筛选并鉴定本发明的纤维素酶产生菌株P5，经菌株分泌型纤维素酶特性分析表明，该菌分泌的纤维素酶具有适应温度范围广、耐一定酸碱性的特点，该菌及其分泌的纤维素酶将在生物能源、洗衣纺织、食品加工、发酵生产等多个行业中具有应用潜力。
文档编号C12N9/42GK102433271SQ20111034807
公开日2012年5月2日 申请日期2011年11月7日 优先权日2011年11月7日
发明者侯进慧, 刘全德, 蔡侃, 陈宏伟, 高兆建, 高明侠 申请人:徐州工程学院