专利名称：用于实蝇种类鉴定的方法及其专用pcr前体系的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于实蝇种类鉴定的方法及其专用PCR前体系。
背景技术：
实蝇属于双翅目(Diptera)实蝇科(I^phritidae)，全世界广泛分布，多发生在热带和亚热带地区，约有500属4500种。150余种实蝇具有严重的经济危害性，以卵和幼虫或蛹随寄主果实、包装物和运输工具等远距离人为传播扩散，危害果树和蔬菜等经济植物，倍受各国植检和农业部门的关注。实蝇的种类鉴定主要依据成虫的形态学特征，虽具有快速、简便和成本低的特点， 但同时也存在一些局限性。特别是在区分实蝇近似种方面，要求标本具有完整的形态结构， 并需要鉴定人员具有丰富的分类经验和技能。此外，对于实蝇幼虫的种类鉴定相当困难，且在多数情况下不可能实现，但在我国口岸截获的多为实蝇的卵和幼虫，将幼虫饲养到成虫再进行种类鉴定需要较长时间，直接影响到口岸检疫的运行速度和检疫质量。DNA条形码技术是通过对一个标准目的基因的DNA序列进行分析从而进行物种鉴定的技术。2003年，加拿大圭尔夫大学的分类学家Paul Hebert等通过对动物界，包括脊椎动物和无脊椎动物11门13320个物种的COI基因的比较分析得出除腔肠动物Cnidaria 外，98%的物种的COI序列差异在种内小于2%，种间平均达到11. 3%。据此，Hebert提出用位于线粒体COI基因5’端58-705区域长度为648bp的片段作为条形编码的基因，为全球生物编码。目前，线粒体DNA已成为动物DNA条形码研究的首选对象，已有很多成功使用COI基因的报道。迄今为止，COI基因被证明适用于包括腹足类(gastropods)、弹尾目 (springtails)、蝴蝶、鸟类、蜉蝣类、蜘蛛、甲壳动物(Crustacea)以及最近研究的硅藻类 (diatomea)和原生动物(Protista)的分类鉴定。尤其在昆虫种类的鉴定上，相对于传统的形态学方法，DNA条形码具有对昆虫各生命阶段(非成虫态和成虫态)和形态结构保存不完整的昆虫标本进行准确的物种鉴定这一明显优势。一个标准DNA条形码数据库的建立，可使更多的无分类学专业知识的人对某个物种进行准确鉴定。目前，由国际条形码协会构建的生物条形码数据库(BOLD)中已收录了大量生物类群的COI条形码信息，并部分对外公开，可免费下载获得。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于实蝇种类鉴定的方法及其专用PCR前体系。本发明提供了一种辅助鉴定实蝇的种类的方法，包括如下步骤(1)将待测实蝇的基因组DNA加入PCR前体系中，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述PCR前体系由水和溶质组成；所述溶质在所述前体系中的浓度如下体积百分含量为 12% 的 IOXTaq buffer (Mg2+ free) U. 5mM MgCl2、0. ImM dNTP、0. 0006mM 上游引物 (LC01490)、0· 0006mM下游引物(HC02198)和0. 02U/ μ 1 TaqDNA聚合酶；所述上游引物的核苷酸序列如序列表的序列1所示；所述下游引物的核苷酸序列如序列表的序列2所示；
(2)将所述PCR扩增产物进行测序，通过与现有序列进行比对鉴定所述待测实蝇的种类。所述PCR 扩增的程序具体可为94°C 3min ；94°C lmin、50°C lmin、72°C lmin，39 个循环；72 °C IOmin。每50 μ 1所述PCR前体系具体可通过如下方法制备将6 μ 1 IOXTaq buffer (Mg2+free)、3 μ 1 25mM MgCl2 溶液(商购)、2 μ 1 2. 5mM dNTP、3 μ 1 0. OlmM 所述上游引物、3 μ 1 0. OlmM所述下游引物、0. 4 μ 1 2. 5U/ μ 1 TaqDNA聚合酶和32. 6 μ 1 ddH20混
口 O所述PCR扩增产物具体可为708bp。所述方法中，所述与现有序列进行比对具体可采用实蝇条形码鉴定系统进行。 实蝇条形码鉴定系统(TBIS)已于2011年1月M日进行著作权登记，著作权编号为 2011SRBJ0406。每50 μ 1所述PCR前体系中具体可加入2 μ 1基因组DNA。所述基因组DNA具体可为从所述待测实蝇成虫的足中提取的基因组DNA、也可为从实蝇幼虫、实蝇蛹或实蝇卵中提取的基因组DNA。当从实蝇成虫的足中提取所述基因组 DNA时，不影响所述实蝇成虫的形态特征，可以结合所述实蝇成虫的形态特征对所述方法中的鉴定结果进行确认。具体可采用试剂盒进行所述基因组DNA的提取。所述试剂盒具体可为北京天根 (TIANGEN)生物技术公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)。应用所述试剂盒对实蝇成虫进行所述基因组DNA的提取的具体步骤如下1、取单只实蝇，取下一侧的后足，用无水乙醇漂洗后，放在滤纸上晾干；2、将所述后足放入离心管中，加入液氮，研磨成粉末；3、将200 μ 1 GA液加入到步骤2的离心管中，离心15秒；4、将15 μ 1蛋白酶K加入到步骤3的离心管中，56°C水浴3小时，离心15秒；5、将200 μ 1 GB液加入到步骤4的离心管中，70°C水浴10分钟，离心30秒；6、在步骤5的离心管中加入200 μ 1无水乙醇，振荡15秒，离心1分钟，全部转入吸附柱CB3中，离心30秒；7、将500 μ 1 GD液加入到步骤6的吸附柱CB3中，12000rpm/s离心30秒，弃除洗脱液；8、将700 μ 1漂洗液PW加入到步骤7的吸附柱CB3中，12000rpm/s离心30秒，弃除洗脱液；9、将500 μ 1漂洗液Pff加入到步骤8的吸附柱CB3中，12000rpm/s离心30秒，弃除洗脱液；10、将步骤9的吸附柱CB3以12000rpm/s离心2分钟，打开吸附柱CB3的盖子，室
温放置5分钟；11、将步骤10的吸附柱CB3放入新的离心管中，向吸附柱CB3中间悬空滴加 20 μ ITE缓冲液，放置2-5分钟后，12000rpm/s离心2分钟；12、将步骤11离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2分钟，12000rpm/s 离心2分钟，基因组DNA被洗脱到离心管中，-20°C保存。
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本发明还保护一种PCR前体系，由水和溶质组成；所述溶质在所述前体系中的浓度如下体积百分含量为 12% 的 IOXiTaq buffer (Mg2+ free) U. 5mM MgCl2、0. ImM dNTP、 0. 0006mM 上游引物(LC01490)、0· 0006mM 下游引物(HC02198)和 0. 02U/μ 1 TaqDNA 聚合酶；所述上游引物的核苷酸序列如序列表的序列1所示；所述下游引物的核苷酸序列如序列表的序列2所示。 所述PCR前体系可用于辅助鉴定实蝇的种类。以上任一所述的实蝇具体可为南亚果实蝇或瓜实蝇。目前，实蝇DNA的提取方法主要将成虫的胸、腹部或整头成虫研磨后，以CTAB法或 DNA提取试剂盒法进行实蝇成虫的基因组DNA提取。由于破坏掉供试样品，无法再次通过观察样品的形态特征对分子鉴定结果进行核对和检验，从而使得分子鉴定结果的可靠性降低。在本发明的方法中，取实蝇成虫样品的单足作为基因组DNA提取的原始样本，可以最大限度地保持供试样品的形态完整性，在分子鉴定实验完成后，可继续观察实蝇成虫的形态特征对分子鉴定结果加以检验，从而保证了实蝇成虫分子鉴定结果的可靠性。本发明具有如下优点(1)实现对实蝇样品各生命阶段(成虫、幼虫、蛹和卵)，样品材料完整性差、不同地理来源的种类鉴定。(2)单足提取成虫样品的DNA可以最大限度地保持供试样品的形态完整性，在分子鉴定实验完成后，可继续观察实蝇成虫的形态特征对分子鉴定结果加以检验，从而保证了实蝇成虫分子鉴定结果的可靠性。C3)标准化操作及技术的通用性强。通过简单的技术培训，可使无分类学专业知识人员实现对全球180余种果蔬类经济性实蝇种类的快速、准确的鉴定。
图1为PCR产物检测电泳结果图2为实蝇种类鉴定流程。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。IOXTaq buffer (Mg2+ free)购自天根生化科技(北京)有限公司，产品目录号 RP101-04。实验样本2009年5月采自于广西南宁兴宁苦瓜菜园中的实蝇成虫。南亚果实蝇(Bactrocera tau)公众可从中国农业大学获得；参考文献李小珍、刘映红、王泽乐，检疫性害虫南亚果实蝇生物学及控制技术，植物保护，第32卷第6期 (2006)，141-145。瓜实蝇(Bactrocera cucurbitae)公众可从中国农业大学获得；参考文献欧剑峰、黄鸿、吴华等，瓜实蝇国内研究概况，长江蔬菜，2008. 9专题综述，33-37.。
实施例1、应用PCR前体系辅助鉴定实蝇的种类一、实蝇成虫基因组DNA的提取采用北京天根(TIANGEN)生物技术公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)对实验样本(10只实蝇，依次命名为样本1至样本10)进行基因组DNA的提取，具体步骤如下1、取单只实蝇成虫，取下一侧的后足，在无水乙醇漂洗后，放在滤纸上晾干。2、将所述后足放入离心管中，加入液氮，研磨成粉末状。3、将200 μ 1 GA液加入到步骤2的离心管中，离心15秒。4、将15 μ 1蛋白酶K悬空加入到步骤3的离心管中，56°C水浴3小时，离心15秒。5、将200 μ 1 GB液加入到步骤4的离心管中，70°C水浴10分钟，离心30秒。6、在步骤5的离心管中加入200 μ 1无水乙醇，振荡15秒，离心1分钟，全部转入吸附柱CB3中，离心30秒。7、将500 μ 1⑶液加入到步骤6的吸附柱CB3中，12000rpm/s离心30秒，弃除洗脱液。8、将700 μ 1漂洗液PW加入到步骤7的吸附柱CB3中，12000rpm/s离心30秒，弃除洗脱液。9、将500 μ 1漂洗液Pff加入到步骤8的吸附柱CB3中，12000rpm/s离心30秒，弃除洗脱液。10、将步骤9的吸附柱CB3以12000rpm/s离心2分钟，打开吸附柱CB3盖子，室温
放置5分钟。11、将步骤10的吸附柱CB3放入到干净的离心管中，向吸附柱CB3中间悬空滴加 20 μ 1 TE缓冲液，放置2-5分钟后，12000rpm/s离心2分钟。12、将步骤11离心得到的溶液再加入步骤11的吸附柱CB3中，室温放置2分钟， 12000rpm/s离心2分钟，基因组DNA被洗脱到离心管中，_20°C保存。所述GA液、蛋白酶K、GB液、吸附柱CB3、⑶液和漂洗液PW均为所述试剂盒的组分。二、目标基因片段的PCR扩增以步骤一提取的基因组DNA为模板，用上游引物LC01490和下游引物HC02198组成的引物对(实蝇COI基因通用引物)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。上游引物LC01490(序列表的序列 1) :5，-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3，；下游引物HC02198 (序列表的序列 2) :5，-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3，。PCR 前体系(50 μ 1) =IOXTaq buffer (Mg2+ free) 6 μ l、25mM MgCl2 溶液(天根生化科技(北京)有限公司，产品目录号ΓΡ107)3μ 1、2. 5mM dNTP 2 μ 1、0. OlmM上游引物 LCO1490 3μ 1、0. OlmM 下游引物 HC02198 3 μ 1,2. 5U/μ 1 TaqDNA 聚合酶 0. 4 μ 1 和 ddH20 32. 6 μ 1。PCR前体系中，各个成分的浓度如下体积百分含量为12 %的10 X Taqbuffer (Mg2+ free) U. 5mM MgCl2、0. ImM dNTP、上游引物 LC014900. 0006mM、下游引物 HC021980. 0006mM、 0. 02U/y 1 TaqDNA 聚合酶。在PCR前体系(50 μ 1)中加入2 μ 1基因组DNA，即为PCR体系。PCR程序:94°C 3min ；94°C lmin、50°C lmin、72°C lmin，39 个循环；72°C IOmin ；4°C
6保存。三、琼脂糖凝胶电泳将PCR扩增产物进行1. 5%的琼脂糖凝胶电泳(120V电泳30分钟，以D2000Maker 为电泳指示剂)，然后用溴化乙锭染色15分钟，在凝胶成像系统紫外光下观察电泳结果。结果见图1 (泳道1至9依次为样本1至9，泳道11为样本10)。样本1至10均在700bp左右位置现实一条清晰明亮的目标条带。四、PCR产物的测序回收步骤三的PCR扩增产物，进行测序。样本1至样本10的测序结果依次如序列表的序列3至序列12所示(均为708bp)。五、采用实蝇条形码鉴定系统(TBIS)进行序列分析实蝇条形码鉴定系统(TBIS)已于2011年1月M日进行著作权登记，著作权编号为2011SRBJ0406。通过对我国实蝇种类的广泛取样测序和收集已公开的实蝇COI条形码信息，建立了涵盖180余种实蝇的DNA条形码数据库，即实蝇条形码鉴定系统(TBIS)。同时，建立了适用于我国的实蝇检疫鉴定DNA条形码技术体系，并运用该技术体系，完成了对来自中国、泰国、越南和布隆迪实蝇样品的种类鉴定，实际应用效果良好。将序列3至序列12所示DNA输入实蝇条形码鉴定系统(TBIS)中，与已知种类的实蝇条形码序列进行相似度比较分析。样本1与实蝇条形码鉴定系统数据库中的南亚果实蝇相似度最高(相似度达到 99. 84% ；实蝇条形码鉴定系统数据库中同源性最高的序列如序列表的序列13所示)，初步鉴定为南亚果实蝇。样本2与实蝇条形码鉴定系统数据库中的南亚果实蝇相似度最高(相似度达到 99. 84% ；实蝇条形码鉴定系统数据库中同源性最高的序列如序列表的序列14所示)，初步鉴定为南亚果实蝇。样本3与实蝇条形码鉴定系统数据库中的瓜实蝇相似度最高(相似度达到100%; 实蝇条形码鉴定系统数据库中同源性最高的序列如序列表的序列15所示)，初步鉴定为瓜实蝇。样本4与实蝇条形码鉴定系统数据库中的瓜实蝇相似度最高(相似度达到100%; 实蝇条形码鉴定系统数据库中同源性最高的序列如序列表的序列16所示)，初步鉴定为瓜实蝇。样本5与实蝇条形码鉴定系统数据库中的南亚果实蝇相似度最高(相似度达到 99. 84% ；实蝇条形码鉴定系统数据库中同源性最高的序列如序列表的序列17所示)，初步鉴定为南亚果实蝇。样本6与实蝇条形码鉴定系统数据库中的瓜实蝇相似度最高(相似度达到 99. 84% ；实蝇条形码鉴定系统数据库中同源性最高的序列如序列表的序列18所示)，初步鉴定为瓜实蝇。样本7与实蝇条形码鉴定系统数据库中的瓜实蝇相似度最高(相似度达到100%; 实蝇条形码鉴定系统数据库中同源性最高的序列如序列表的序列19所示)，初步鉴定为瓜实蝇。样本8与实蝇条形码鉴定系统数据库中的南亚果实蝇相似度最高(相似度达到100% ；实蝇条形码鉴定系统数据库中同源性最高的序列如序列表的序列20所示)，初步鉴定为南亚果实蝇。样本9与实蝇条形码鉴定系统数据库中的南亚果实蝇相似度最高(相似度达到 99. 84% ；实蝇条形码鉴定系统数据库中同源性最高的序列如序列表的序列21所示)，初步鉴定为南亚果实蝇。样本10与实蝇条形码鉴定系统数据库中的南亚果实蝇相似度最高(相似度达到 99. 84% ；实蝇条形码鉴定系统数据库中同源性最高的序列如序列表的序列22所示)，初步鉴定为南亚果实蝇。如为实蝇复合种，需利用DNAMAN构建系统发育树，结合树图，进一步确认供试实蝇成虫样品的种类(流程示意图见图2)。六、鉴定结果验证对取完后足后的实蝇进行形态学特征鉴定，确定其种类，与步骤五的鉴定结果一致。同时，鉴定结果与成虫诱捕结果相吻合，同时也与当地的实蝇优势种及寄主一致。如果待测样本为实蝇的幼虫、蛹或卵时，参照实施例1的方法检测即可。
权利要求
1.一种辅助鉴定实蝇的种类的方法，包括如下步骤(1)将待测实蝇的基因组DNA加入PCR前体系中，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物； 所述PCR前体系由水和溶质组成；所述溶质在所述前体系中的浓度如下体积百分含量为 12%的 IOXTaq bufferU. 5mM MgCl2、0. ImM dNTP、0. 0006mM上游引物、0. 0006mM下游引物和0. 02U/ μ 1 TaqDNA聚合酶；所述上游引物的核苷酸序列如序列表的序列1所示；所述下游引物的核苷酸序列如序列表的序列2所示；(2)将所述PCR扩增产物进行测序，通过与现有序列进行比对鉴定所述待测实蝇的种类。
2.如权利要求1所示的方法，其特征在于所述PCR扩增的程序为94°C3min； 94°C lmin、50°C lmin、72°C lmin，39 个循环；72°C IOmin0
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述与现有序列进行比对是采用实蝇条形码鉴定系统进行的。
4.一种PCR前体系，由水和溶质组成；所述溶质在所述前体系中的浓度如下体积百分含量为 12%的 IOXTaq bufferU. 5mM MgCl2、0. ImM dNTP、0. 0006mM上游引物、0. 0006mM下游引物和0. 02U/y 1 TaqDNA聚合酶；所述上游引物的核苷酸序列如序列表的序列1所示； 所述下游引物的核苷酸序列如序列表的序列2所示。
5.权利要求4所述PCR前体系在辅助鉴定实蝇的种类中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种用于实蝇种类鉴定的方法及其专用PCR前体系。本发明提供的方法，包括如下步骤(1)将待测实蝇的基因组DNA加入PCR前体系中，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；(2)将PCR扩增产物进行测序，通过与现有序列进行比对鉴定测实蝇的种类。PCR前体系由水和溶质组成；溶质浓度如下体积百分含量为12％的10×Taq buffer、1.5mM MgCl2、0.1mM dNTP、0.0006mM序列1所示的上游引物、0.0006mM序列2所示的下游引物和0.02U/μl TaqDNA聚合酶。本发明具有如下优点(1)实现对实蝇样品各生命阶段，样品材料完整性差、不同地理来源的种类鉴定；(2)可以最大限度地保持供试样品的形态完整性；(3)标准化操作及技术的通用性强。
文档编号C12Q1/68GK102367480SQ20111034767
公开日2012年3月7日 申请日期2011年11月7日 优先权日2011年11月7日
发明者伍祎, 刘佳琪, 姜帆, 李志红, 杨定, 柳丽君, 梁亮, 陈英才 申请人:中国农业大学