专利名称：一种重组耐热的β-1,4内切纤维素酶的纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种生物酶的纯化方法，特别涉及一种重组耐热纤维素酶的纯化方法。
背景技术：
纤维素是地球上含量最丰富的多糖，也是最丰富的有机可再生资源。纤维素酶是分解纤维素的一类酶，根据功能的不同，分为外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β -葡萄糖苷酶，它能将纤维素分解成为葡萄糖，一种机理是:内切葡聚糖酶首先将纤维素的非结晶区切开，产生大量的非还原端，作为纤维二糖水解酶底物，依次从非还原端切下纤维二糖，被葡萄糖苷酶水解成葡萄糖。目前工业上使用的纤维素酶大多来源于真菌发酵产物，只能在中温条件下发挥作用，限制了酶的应用，而耐热纤维素酶因具有极好的高温反应活性和稳定性，在能源、化工、食品和医药等行业展现出越来越广阔的应用潜力。来源于Euryarchaeota门热球菌目的热球菌高度嗜热，产生的耐热纤维素酶，由于具有较高的酶活力和热稳定性，日益被人们所关注，成为纤维素酶基础研究和开发新型纤维素酶制剂的热点。许多研究者构建表达了来自热球菌的耐热纤维素酶，例如国际专利PCT/DK98/00039,论文Kengen 1993和Bauer 1999，表达的耐热纤维酶的反应最适温度都在90°C以上，但是存在工艺步骤多、表达量低、纯度差、比活低、难以放大用于生产的情况。2004 年学者 Yasuhiro Kashima(Extremophiles.9:37-43)从 Pyrococcushorikoshii古细菌中克隆了 β_1，4内切纤维素酶基因，去除其C端的411 459位氨基酸，获得了改构的耐热β_1，4内切纤维素酶(ΡΗ1171)，分子量约为45000，使蛋白表达量提高了 60倍，且活性不损失。 但其纯化步骤包括破菌、85°C热处理30分钟、Q阴离子交换层析、Phenyl疏水层析、S-200凝胶过滤层析等，步骤繁琐，比活较低，而且其使用的S-200凝胶过滤层析限制了放大应用。在PCT/DK98/00039专利报道中，利用芽孢杆菌表达了耐热β _1，4内切纤维素酶，纯化步骤包括:调pH、阴离子、阳离子两种絮凝剂沉淀菌体、滤纸过滤、DEAE阴离子交换层析、Butyl疏水层析等，步骤繁琐，收率较低，仅为50 60%，并且局限于实验室水平，难以放大。因此，建立一种简便、快捷、低成本、可放大的耐热β_1，4内切纤维素酶的纯化方
法，具有非常重要的意义。
发明内容
鉴于此，我们构建表达了耐热β_1，4内切纤维素酶(ΡΗ1171)蛋白，本发明的目的是提供了一种ΡΗ1171的纯化方法，具有纯度高、比活高、收率高、生产成本低、有利于工业化生产的特点。本发明采用以下的技术方案:
一种重组耐热的β -1,4内切纤维素酶的纯化方法，由以下步骤组成:I)破菌发酵获得表达重组耐热β_1，4内切纤维素酶的菌体，离心后向菌体沉淀加入破菌缓冲液，使菌体和破菌缓冲液的比例为1: 5 20，搅拌10 20分钟使之混合均匀，通过超声或高压均质的方法裂解菌体；其中破菌缓冲液为20 50mM Tris-HCl, pH7.5
8.5,0.1 5mMEDTA、0.5 IM NaCl,5 10%甘油、溶菌酶 0.5 2mg/ml、5 IOmM 咪唑、
0.02 ImM PMSF ;破菌缓冲液中的EDTA和甘油经试验证实对活性稳定十分重要，确保菌体在破菌、热处理过程中活性损失减少，咪唑的添加是避免金属螯合层析过度吸附含色氨酸、半胱氨酸和少量组氨酸的非组氨酸标签的杂蛋白。菌体和破菌液的比例选择是为了方便超声或高压均质机高效破碎菌体，破菌过程中需要适度降温，避免超过30°C，防止酶活的损失。破菌时间以菌液不再粘稠、流动性良好为准；2)热处理将破菌处理后的溶液放入水浴中保温搅拌，温度为70 85°C，搅拌速度控制在100 200rpm，处理时间为15 40分钟；3)离心将热处理后的溶液放入离心机中离心，离心力10000 20000 X g，时间10 20分钟，取上清液，加入I 2M MgCl2至浓度IOmM 20mM,经0.45 μ m的滤膜过滤；在上述步骤中发酵菌体破碎后直接进行热处理，使细胞碎片和杂蛋白大量沉淀，较低离心力IOOOOg左右即可充分分离沉淀，获得澄清的蛋白粗纯液。热处理后蛋白纯度明显提高，由于目标蛋白的耐热性和破菌缓冲液的甘油、EDTA等保护剂，活性此步损失小于10%。离心上清补加MgCl2的作用是占据EDTA的金属螯合位点，确保样品上样时不会因EDTA剥离Ni离子，导致载量、收率下降；4)金属螯合亲和层析金属螯合层析用缓冲液I平衡色谱柱，用量为3 5CV，上样后冲洗冲洗用量为5 10CV，使UV280吸收降至基线。然后用缓冲液II洗脱杂蛋白，用量为5 10CV，使UV280吸收降至基线。最后用缓冲液III洗脱目的蛋白，收集UV280吸收大于IOOmAu组分，加入固体硫酸铵至饱和度60 70%进行沉淀，呈混悬状态的蛋白产品置于4°C长期保存，活性I年内未见明显衰减。其中缓冲液I为20 50mMTris-HCl，PH7.5 8.5、0.5 IM NaCl、5 10%甘油、5 IOmM 咪唑；缓冲液 II 为 20 50mM Tris-HCl, PH7.5 8.5,0.5 IMNaCl,5 10%甘油、50 70mM 咪唑；缓冲液 III 为 20 50mM Tris-HCl, PH7.5 8.5、
0.5 IM NaCl,5 10%甘油、200 300mM 咪唑。所述破菌步骤中破菌法选择高压均质法，是指将菌体和破菌缓冲液的混合液放入高压均质机，在10 30°c、工作压力为500 800bar时均质2 3遍。所述破菌步骤也可以采用超声法，方法为放入超声设备中，超声5 10秒，停10 20秒，共超声10 20分钟，此超声方法建议体积小于0.5L时使用。所述热处理步骤中，温度为75 80°C，处理时间为20 30分钟。所述金属螯合亲和层析步骤中 介质配基为亚氨基二乙酸(IDA)或次氮基三乙酸(NTA)，优选为亚氨基二乙酸(IDA)。由于NTA的载量相对较低，所以使用IDA更经济，GE公司生产的Ni Sepharose HP、Ni Sepharose FF可重复使用,Ni离子脱落较少,选择性高,广泛用于组氨酸标签蛋白的纯化，其中Ni Sepharose HP填料颗粒平均34 μ m,分辨率略高于Ni Sepharose FF,且流速反压与Ni Sepharose FF无明显差异,对纯度要求较高时使用NiSepharose HP较理想,反之使用Ni Sepharose FF即可，同时可以降低成本。所述金属螯合亲和层析步骤中柱高为5 15cm，柱床过高，柱压明显，影响上样、洗脱流速，过低影响分离效果；上样线性流速为30 120cm/h,优选为60 100cm/h,这样可以确保蛋白与填料的充分吸附；洗脱线性流速为100 300cm/h,优选为100 150cm/h,这样可以确保蛋白与填料充分解吸附，上样、洗脱时色谱柱压力控制在0.4MPa以下，防止色谱柱床压塌；上样量为每ml填料上样菌体蛋白100 300mg (Bradford法检测),优选为100 200mg，上样量过高会降低分辨率，导致目的蛋白穿透，收率降低。本发明与文献中提到的方法相比，具有以下优点:(I)优化了破菌液、Ni柱洗脱缓冲液成分，使纯化过程中蛋白活性基本不变；(2)所用层析方法均可简单线性放大，50ml Ni离子亲和柱即可以进行I批发酵液(5L)的纯化，不使用凝胶层析，工艺放大方便，亲和层析的选择性高，一步纯化后目的蛋白纯度大于90% ；(3)收获蛋白浓度大于10mg/ml，体积小，方便下一步盐析操作，便于大规模生产；(4)酶以盐析沉淀方式在4度长时间保持活性，简化制剂过程，酶活更稳定；(5)工艺简单，用时短(I天)，成本低。
图1是本发明实施例1的PH1171 Ni柱亲和层析色谱
图2是本发明实施例1的PHl 171纯化过程SDS-PAGE电泳图。
具体实施例方式本发明所述纯化菌体来源于:( 一 )古细菌 Pyrococcus horikoshii OT3目的基因获得:1、使用上下游引物从古细菌Pyrococcus horikoshii 0T3基因组中用PCR技术获得目的片段；2、用NdeI及BamHI双酶切目的基因片段及pETlla质粒载体；3、连接载体及目的基因、转入大肠杆菌DH5ci菌株。基因的改构:去掉N-terminal的28个氨基酸残基及C-terminal的42个氨基酸残基,并对SD序列进行密码子偏好性突变，使用以下引物构建亚克隆。表格左边为引物名称，右边为引物序列。
权利要求
1.一种重组耐热的β-1，4内切纤维素酶的纯化方法，其特征在于:由以下步骤组成: 1)破菌 发酵获得表达重组耐热β-1，4内切纤维素酶的菌体，离心后向菌体沉淀加入破菌缓冲液，使菌体和破菌缓冲液的比例为1: 5 20，搅拌10 20分钟使之混合均匀，通过超声或高压均质的方法裂解菌体，使之破碎； 2)热处理 将破菌处理后的溶液放入水浴中保温搅拌，温度为70 85°C，搅拌速度控制在100 200rpm，处理时间为15 40分钟； 3)离心 将热处理后的溶液放入离心机中离心，离心力10000 20000 X g，时间10 20分钟，取上清液，加入I 2M MgCl2至终浓度为IOmM 20mM，经0.45 μ m的滤膜过滤； 4)金属螯合亲和层析 金属螯合层析首先用缓冲液I平衡色谱柱，用量为3 5CV，上样后冲洗，用量为5 10CV，使UV280吸收降至基线，然后用缓冲液II洗脱杂蛋白，用量为5 10CV，使UV280吸收降至基线，最后用缓冲液III洗脱目的蛋白，收集UV280吸收大于IOOmAu组分，加入固体硫酸铵至饱和浓度60 70%进行沉淀，得到呈混悬状态的蛋白产品置于4°C长期保存； 其中破菌缓冲液为 20 50mM Tris-HCl，pH7.5 8.5、0.1 5mMEDTA、0.5 IM NaCl、5 10%甘油、溶菌酶0.5 2mg/ml、5 IOmM咪唑、0.02 ImM PMSF ;缓冲液I为20 50mM Tris-HCl,pH7.5 8.5、0.5 IM NaCl、5 10%甘油、5 IOmM 咪唑；缓冲液 II 为20 50mM Tris-HCl, pH7.5 8.5、0.5 IM NaCl、5 10%甘油、50 70mM 咪唑；缓冲液 III 为 20 50mM Tris-HCl,pH7.5 8.5、0.5 IM NaCU5 10%甘油、200 300mM咪唑。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于:所述破菌步骤中破菌法选自高压均质法。
3.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于:所述均质法是指将菌体和破菌缓冲液的混合液放入高压均质机中，控温10 30°C、工作压力为500 800bar，均质2 3遍。
4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于:所述热处理步骤中，温度为75 80 °C，处理时间为20 30分钟。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于:所述金属螯合亲和层析步骤中介质配基为亚氨基二乙酸(IDA)或次氮基三乙酸(NTA)。
6.根据权利要求6所述的纯化方法，其特征在于:所述金属螯合亲和层析步骤中介质配基为亚氨基二乙酸(IDA)。
7.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于:所述金属螯合亲和层析步骤中柱高为5 15cm，上样线性流速为30 120cm/h，洗脱线性流速为100 300cm/h，上样量为每ml填料上样菌体蛋白100 300mg。
8.根据权利要求8所述的纯化方法，其特征在于:所述金属螯合亲和层析步骤中上样线性流速为60 lOOcm/h，洗脱线性流速为100 150cm/h，上样量为每ml填料上样菌体蛋白100 200mg。
全文摘要
本发明提供了一种重组耐热的β-1，4内切纤维素酶的纯化方法，主要步骤为破菌、热处理、离心、金属螯合亲和层析、盐析。本发明具有纯度高、比活高、收率高、生产成本低、有利于工业化生产的特点。
文档编号C12N9/42GK103088004SQ20111034716
公开日2013年5月8日 申请日期2011年11月7日 优先权日2011年11月7日
发明者郑春阳, 聂立影, 原素英, 王燕, 徐彬 申请人:天津强微特生物科技有限公司