专利名称：从犬粪便中检测细粒棘球绦虫病原的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测试剂盒及这种试剂盒的用途，确切讲本发明涉及一种用于检测犬粪是否存在细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)病原的检测试剂盒和该试剂盒的用途。
背景技术：
细粒棘球绦虫的幼虫——细粒棘球蚴可感染多种动物(包括人)，可引起危害人类健康并阻碍畜牧业发展的人畜共患寄生虫病，即细粒棘球蚴病，又称囊型棘球蚴病或囊型包虫病。目前细粒棘球绦虫存在10个基因型，即Gl G10。在我国主要存在Gl和G6两型，其中Gl型分布最广，危害最为严重。犬科动物是细粒棘球绦虫的终末宿主，成虫寄生于其小肠内，虫卵随粪便排出，污染食物、饮水和周围环境，构成主要传染源。所以及时、准确地检测流行区终末宿主棘球绦虫的感染情况和对感染动物进行强制驱虫，对控制棘球蚴病的流行、综合防控措施实施和防治效果的评价等都具有十分重要的意义。在我国西北部地区，流浪犬或未实施定期驱虫等措施的犬感染最为严重，是最主要的传染源。目前，对细粒棘球绦虫感染犬的检测方法有常规检测法(槟榔碱导泻法和剖检法)、粪DNA-PCR检测法和粪抗原-ELISA检测法(Boufana BS, et al. Evaluation of Three PCR assays for the identification of the sheep strain (Genotypel) of Echinococcus granulosus in canid feces and parasite tissues[J]. Am J Trop Med Hyg,2008,78(5) 777-783 ；Pierangeli NB, et al. Usefulness and validation of a coproantigen test for dog echinococcosis screening in the consolidation phase of hydatid control in Neuquen, Argentina [J], Parasitol Iht, 2010, 59 (3) =3M-399.)。但这些方法都存在一定的缺点，敏感性和特异性都较低，其中常规检测法还具有感染人和周围环境的危险。
发明内容
本发明提供一种可克服现有技术不足，从犬粪便中检测细粒棘球绦虫病原的试剂盒，以及用这种试剂盒配制相应试剂的方法和检测方法。本发明的从犬粪便中检测细粒棘球绦虫病原的试剂盒中包括有四个特异引物，这四个特异引物分别是上游外部引物F3 :5' -TGGTTTTAGGTATTTGATTAGGT-3 ‘ (SEQ Na 1)； 下游外部引物 B3:5' -ACCACTACATACCAACACC-3 (SEQ Na 2)；上游内部引物FIP :5' -TAACC CAMCGTTACCACATCAAAAGAATTCTAGATTTTTGTCTACTATGGGTTGT-3 ‘ (SEQ Ns ；3)；下游内部引物 BIP 5' -ATACTGGTCATTATTTCGGCGGGAATTCCAAACAAAACAATCAACTTCAAC-3' (SEQ Ns 4)。为方便使用，本发明的试剂盒中还有LAMP反应液、引物混合物、Bst DNA聚合酶、 标准阳性模板以及显色剂。利用本发明的检测试剂盒可以配制检测犬粪便中细粒棘球绦虫病原的试剂。本发明是一种环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isotheral amplificationmethod, LAMP)，这是一种类似于PCR的核酸分子检测技术，但比PCR更特异、敏感、快速、简单，且受粪DNA中PCR抑制因子影响较小，简单的仪器如恒温水浴锅即可完成反应。然而到目前为止，尚无应用此方法在犬粪便中检测细粒棘球绦虫病原的报道。本发明为一种快速检测犬粪便中细粒棘球绦虫病原体的方法，敏感性高于PCR方法，同时不需要复杂的操作系统，在普通的实验室就可进行；具有操作简单、敏感性高、特异性强、快速等特点，因此存在潜在的实验研究和极具潜力的临床应用价值。
图IA为采用本发明的LAMP扩增及显色结果，其中1为呈浅绿色的阳性粪DNA ；2 为呈浅明黄色的阴性对照。图IB为采用本发明的LAMP扩增及酶切电泳检测结果，其中M :DNA标准分子量 DL1000 ；1 标准阳性粪DNA ；2 灭菌水空白对照。图2为临床样品的检测结果的电泳，其中M:DNA标准分子DL1000 ；1 标准阳性粪 DNA ；2 6 临床样品结果；7 阴性粪DNA ；8 灭菌水空白对照。
具体实施例方式以下给出本发明的一个实施例。在本实施例中，所用的从犬粪便中检测细粒棘球绦虫病原的试剂盒包括有 2XLAMP反应液、由四条引物构成的混合物、Bst DNA聚合酶、标准阳性模板及显色剂，其中的四个特异引物分别是上游外部引物F3 :5' -TGGTTTTAGGTATTTGATTAGGT-3‘ (SEQ Nsl)； 下游外部引物 B3 5' -ACCACTACATACCAACACC-3 (SEQ Na 2)，上游内部引物 FIP 5' -TAACC CAAACGTTACCACATCAAAAGAATTCTAGATTTTTGTCTACTATGGGTTGT-3 ‘ (SEQ Ns ；3)，下游内部引物 BIP 5' -ATACTGGTCATTATTTCGGCGGGAATTCCAAACAAAACAATCAACTTCAAC-3' (SEQ Ns 4)，其中2 X LAMP 反应液包括40mmol/L Tris-HCl (pH 8. 8)，20mmol/L KCl，16mmol/L MgSO4, 20mmol/L (NH4)2SO4jO. 2% (v/v) Tween 20，1· 6mol/L Betaine 和 2· 5mmol/L dNTP ；引物混合物包括40pmol/L上游内部引物FIP，40pmol/L下游内部引物BIP， 5pmol/L上游外部引物F3，5pmol/L下游外部引物B3 ；显色剂为STORGreen I。本发明的具体检测过程如下1对阳性粪DNA样品进行扩增1)制备标准阳性粪DNA:阳性粪便的获得将细粒棘球蚴感染犬，2个月后剖检感染犬分别收集粪便(含有虫卵)和成虫，将粪便于_70°C冻存1周。阳性粪DNA的制备根据粪DNA提取试剂盒说明书提取粪DNA。2)制备2 X LAMP反应液①1.5mol/L Tris-HCl (pH 8.8)的配置称取 91g Tris 置于烧杯中，加入 400mL 去离子水，充分溶解，用HCl调节pH值至8. 8，定容于500mL，备用；②配置2 X LAMP反应液前按表1配方配置90mL混合液表 权利要求
1.从犬粪便中检测细粒棘球绦虫病原的试剂盒，其特征在于试剂盒中包括有四个特异性引物，这四个特异引物分别是SEQ Na USEQ Na 2, SEQ Na 3, SEQ Ns 4。
2.根据权利要求1所述的从犬粪便中检测细粒棘球绦虫病原的试剂盒，其特征在于试剂盒中有LAMP反应液、引物混合物、Bst DNA聚合酶、标准阳性模板以及显色剂。
3.权利要求1或2所述的试剂盒在配制检测犬粪便中细粒棘球绦虫病原的试剂的用途。
4.权利要求1所述的从犬粪便中检测细粒棘球绦虫病原的试剂盒的使用方法，其特征是从犬粪便中提取DNA，分别配制LAMP反应液和引物混合液，将所得到的犬粪便DNA与 LAMP反应液、引物混合液和Bst DNA聚合酶混合后进行LAMP扩增反应，在反应产物中入显色剂或对反应产物进行电泳，根据反应产物是否显色或在电泳中是否产物有梯度条带确定被检样品是否有细粒棘球绦虫病原。
全文摘要
本发明公开一种用于检测犬粪是否存在细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)病原的LAMP检测试剂盒和该试剂盒的用途。本发明的试剂盒中包括有四个特异引物，这四个特异引物分别是上游外部引物SEQ №1；下游外部引物SEQ №2；上游内部引SEQ №3；下游内部引物SEQ №4。为方便使用，本发明的试剂盒中还有LAMP反应液、引物混合物、Bst DNA聚合酶、标准阳性模板以及显色剂。本发明可快速检测出犬粪中是否存在细粒棘球绦虫病原，敏感性高、操作简便、特异性强。
文档编号C12Q1/68GK102363808SQ20111034644
公开日2012年2月29日 申请日期2011年11月7日 优先权日2011年11月7日
发明者倪兴维, 娄忠子, 李宏民, 贾万忠, 闫鸿斌 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所