专利名称：从犬粪便中检测多房棘球绦虫病原的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测试剂盒及这种试剂盒的用途，确切讲本发明涉及一种用于检测犬粪是否存在房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis)病原的检测试剂盒和该试剂盒的用途。
背景技术：
多房棘球绦虫的成虫主要寄生于犬、狼、狐狸等犬科动物的小肠中，虫卵随粪便排出体外，感染人和多种啮齿动物，并寄生于其肝脏等器官，引起泡型棘球蚴病。人的多房棘球蚴病危害严重，病死率极高，又称“虫癌”，严重威胁我国西部广大牧民的生命与健康。因此，建立一种快速有效的多房棘球绦虫感染犬粪DNA的检测试剂盒对预防、控制和治疗该病具有重要的意义。然而，已有的检测方法如常规的病原学检测法(槟榔碱导泻法和剖检法)、粪 DNA-PCR 检测法和粪抗原 ELISA 检测法(Dinkel A, et al. Detection of Echinococcus multilocularis in the definitive host :coprodiagnosis by PCR as an alternative to Necropsy[J],J Clin Microbiol,1998,36 (7) :1871-1876. ；Eckert J. Predictive values and quality control of techniques for the diagnosis of Echinococcus multilocularis in definitive hosts. Acta Trop, 2003,85 (2) : 157-163.)都存在一定的缺点，敏感性和特异性都较低，其中常规检测法还具有感染人和周围环境的危险。
发明内容
本发明提供一种可克服现有技术不足，从犬粪便中检测多房棘球绦虫病原的试剂盒，以及用这种试剂盒配制相应试剂的方法和检测方法。本发明的从犬粪中检测多房棘球绦虫病原的试剂盒中包括有四个特异性引物，这四个特异引物分别是上游外部引物F3 :5' -gTgTgTTgCTATATTgCTTgT-3‘ (SEQ N2 1)；下游外部引物B3:5' -AACTTTAACAACATACACCTAgT-3‘ (SEQ Ns 2)；上游内部引物FIP :5' -T TAACCAACCAATAACAACCCAgTgAATTCgTggTgTTAgTTATTTggTTAgg-3 ‘ (SEQ Mj ；3)和下游内部引物 BIP 5 ‘ -ATgTgACgTTTggTgTggTAgTTAgAATTCAAgAACCACCAAAATAATgTCT-3 ‘ (SEQ Na 4)。为方便使用，本发明的从犬粪中检测多房棘球绦虫的试剂盒中还可有LAMP反应液、引物混合物、Bst DNA聚合酶、标准阳性模板以及显色剂。利用本发明的试剂盒可配制用于检测犬粪便中多房棘球绦虫病原的试剂。本发明的从犬粪便中检测多房棘球绦虫病原的试剂盒的使用方法是从犬粪便中提取DNA，分别配制LAMP反应液和引物混合液，将所得到的犬粪便DNA与LAMP反应液、引物混合液和Bst DNA聚合酶混合后进行LAMP扩增反应，在反应产物中入显色剂或对反应产物进行电泳，根据反应产物是否显色或在电泳中是否有梯度条带确定被检样品是否有多房棘球绦虫病原。
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本发明是一种新型的DNA扩增技术——环介导的恒温扩增技术(Loop-mediated isotheral amplification method，LAMP)。此方法比PCR更特异、敏感、快速、简单，且受粪 DNA中PCR抑制因子影响较小，简单的仪器如恒温水浴锅即可完成反应。到目前为止，尚无应用此方法在犬粪便中检测多房棘球绦虫病原的报道。本发明为一种快速检测犬粪便中多房棘球绦虫病原体的方法，敏感性高于PCR方法，同时不需要复杂的操作系统，在普通的实验室就可进行；具有操作简单、敏感性高、特异性强、快速等特点，因此存在潜在的实验研究和极具潜力的临床应用价值。
图IA为本发明的LAMP扩增及显色结果，其中1为阳性粪DNA，2为阴性对照。图IB为LAMP扩增及酶切电泳检测结果，其中M为DNA标准分子量DL1000，1为标准阳性粪DNA，2为灭菌水空白对照。图2为临床样品的检测结果的电泳图，其中M为DNA标准分子DL1000，1为标准阳性粪DNA ；2 5分别为临床样品结果，6为阴性粪DNA，7为灭菌水空白对照。
具体实施例方式以下结合实施例说明。在本实施例中，所用的从犬粪便中检测多房棘球绦虫病原的试剂盒包括有 2XLAMP反应液、由四条引物构成的混合物、Bst DNA聚合酶、标准阳性模板及显色剂，其中的四个特异引物分别是上游外部引物F3 :5' -gTgTgTTgCTATATTgCTTgT-3‘ (SEQ Nsl)； 下游外部引物 B3 5 ‘ -AACTTTAACAACATACACCTAgT-3 ‘ (SEQ Na 2)；上游内部引物 FIP 5' -TTAACCAACCAATAACAACCCAgTgAATTCgTggTgTTAgTTATTTggTTAgg-3' (SEQ Ns ；3)和下游内部引物 BIP 5' -ATgTgACgTTTggTgTggTAgTTAgAATTCAAgAACCACCAAAATAATgTCT-3' (SEQ Ns 4)，其中2 X LAMP 反应液包括40mmol/L Tris-HCl (pH 8. 8)，20mmol/L KCl，16mmol/L MgSO4, 20mmol/L (NH4)2SO4jO. 2% (v/v) Tween 20，1· 6mol/L Betaine 和 2· 5mmol/L dNTP ；引物混合物包括40pmol/L上游内部引物FIP，40pmol/L下游内部引物BIP， 5pmol/L上游外部引物F3，5pmol/L下游外部引物B3 ；显色剂为STORGreen I。本发明的具体检测过程如下1对阳性粪DNA样品进行扩增1)多房棘球绦虫感染犬阳性粪DNA的制备阳性粪便的获得将多房棘球蚴感染犬，40天后剖检感染犬分别收集粪便(含有虫卵)和成虫，将粪便于-70°C冻存1周。阳性粪DNA的制备根据粪DNA提取试剂盒说明书提取粪DNA。2) 2 X LAMP反应液的制备①1.5mol/L Tris-HCl (pH 8.8)的配置称取 91g Tris 置于烧杯中，加入 400mL 去离子水，充分溶解，用HCl调节pH值至8. 8，定容于500mL，备用；②配置2 X LAMP反应液前按表1所示配方配置90mL混合液表 1
权利要求
1.从犬粪中检测多房棘球绦虫病原的试剂盒，其特征在于试剂盒中包括有四个特异性引物，这四个特异引物分别是SEQ Na USEQ Na 2, SEQ Na 3, SEQ Ns 4。
2.根据权利要求1所述的从犬粪中检测多房棘球绦虫的试剂盒，其特征在于试剂盒中有LAMP反应液、弓丨物混合物、Bst DNA聚合酶、标准阳性模板以及显色剂。
3.权利要求1或2所述的试剂盒在配制检测犬粪便中检测多房棘球绦虫的试剂的用途。
4.权利要求1所述的从犬粪便中检测多房棘球绦虫病原的试剂盒的使用方法，其特征是从犬粪便中提取DNA，分别配制LAMP反应液和引物混合液，将所得到的犬粪便DNA与 LAMP反应液、引物混合液和Bst DNA聚合酶混合后进行LAMP扩增反应，在反应产物中入显色剂或对反应产物进行电泳，根据反应产物是否显色或在电泳中是否有梯度条带确定被检样品是否有多房棘球绦虫病原。
全文摘要
本发明公开一种用于检测犬粪是否存在房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis)病原的LAMP检测试剂盒和该试剂盒的用途。本发明的从犬粪中检测多房棘球绦虫病原的试剂盒中包括有四个特异性引物，这四个特异引物分别是上游外部引物SEQ №；下游外部引物SEQ №2；上游内部引物SEQ №3和下游内部引物SEQ №4。本发明可以快速检测出犬粪便中是否有多房棘球绦虫病原体，其敏感性高、操作简便、特异性强、快速等特点。
文档编号C12Q1/68GK102433378SQ20111034647
公开日2012年5月2日 申请日期2011年11月7日 优先权日2011年11月7日
发明者倪兴维, 娄忠子, 李宏民, 贾万忠, 闫鸿斌 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所