专利名称：用非离子表面活性剂渗透萃取发酵微生物胞内产物的方法
技术领域：
本发明涉及一种萃取发酵微生物胞内产物的方法，具体是一种用非离子表面活性剂渗透萃取发酵微生物胞内产物的方法。
背景技术：
微生物发酵胞内产物通常在细胞内积累高产物浓度而导致产物抑制，主要解决方式是通过提高微生物的细胞密度以提高产物浓度。另一方面，胞内产物积累使得下游分离与纯化过程中必须采用细胞破碎、溶剂提取等手段，增加了过程的复杂性和操作成本。采用在水-有机溶剂两相系统中发酵以改变细胞膜的渗透性可以将细胞内的产物释放到胞外环境，但有机溶剂对细胞膜的生物相容性和有机溶剂对胞内产物的萃取能力之间的存在矛盾。因此，利用有机溶剂的渗透萃取发酵技术难以实现。非离子表面活性剂在水溶液中形成胶束溶液。在一定温度下，非离子表面活性剂胶束溶液自动发生相分离而形成表面活性剂浓缩相和表面活性剂稀溶液相。这一两相系统称为浊点系统。非离子表面活性剂溶液或者非离子表面活性剂溶液形成的浊点系统在萃取分离中的应用有很多报道。经对现有技术文献比对，应用浊点系统技术在萃取微生物发酵胞外产物以解除产物对微生物的抑制已有相关报道[王志龙，戴泽文。浊点系统中萃取微生物发酵。酶与微生物技术，2010，46 :407-418。Wang Z，Dai Z. Extractive microbial fermentation in cloud point system. Enzyme Microbial Technology,2010, 46 :407-418],但应用非离子表面活性剂溶液及其形成的浊点系统在微生物发酵过程中改变细胞膜的渗透性以释放胞内产物同时萃取产物的所谓渗透萃取发酵技术还没有报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种萃取发酵微生物胞内产物的方法，利用非离子表面活性剂的水溶液及其形成的浊点系统，在微生物发酵胞内产物时将胞内产物渗透到细胞外发酵液且同时萃取细胞外发酵液中产物。为解决上述问题，本发明所述的萃取发酵微生物胞内产物的方法，具体是微生物发酵胞内产物时，以添加每升发酵液0. 2-128g的非离子表面活性剂浓度形成的非离子表面活性剂胶束溶液或其形成的浊点系统作为微生物的发酵介质，采用非离子表面活性剂胶束溶液或其形成的浊点系统作为微生物发酵胞内产物的发酵介质的目的是为了将细胞内的产物渗透到细胞外环境，从而提高微生物发酵的产物水平和调节微生物次级代谢产物的组成。同时通过萃取产物实现目标产物的浓缩和部分纯化以简化下游的分离纯化过程。即实现微生物胞内产物的渗透萃取发酵。本发明中，采用非离子表面活性剂胶束溶液或其形成的浊点系统实现微生物胞内产物的渗透萃取发酵的关键在于改变细胞的渗透性同时维持微生物的生命活力。本发明涉及的非离子表面活性剂包括高分子聚合物，聚合物非离子表面活性剂以及通常应用的小分子非离子表面活性剂等。
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本发明的渗透萃取微生物发酵技术特别适合于微生物胞内产物的发酵。如细胞内酶的发酵、细胞内油脂、色素等有机小分子的发酵等。具体地，以红曲霉菌发酵生产胞内色素作为具体实例。优选的，本发明利用非离子表面活性剂胶束溶液或其形成的浊点系统在微生物红曲霉菌发酵生产红曲色素中将胞内产物释放到细胞外，同时萃取细胞发酵液中的红曲色
ο本发明涉及的非离子表面活性剂包括聚氧乙烯类聚合物、甲氧基聚氧乙烯类聚合物、聚氧乙烯-聚氧丙烯类嵌段聚合物、小分子非离子表面活性剂等四类。其中，聚氧乙烯多聚物为(如市售的商业渠道得到PEG 4000, PEG 10000等)； 甲氧基聚氧乙烯类聚合物MPEG 5000 (Sigma)；共多聚物L64(浙江皇马化学品公司)、 F68 (Sigma))。非离子表面活性剂为(山梨醇类(如span 20, Tween 80(上海试剂公司)； 脂肪醇聚氧乙烯醚类(Brij 30、(Fluka) ；Triton X 系列(如 Triton X-45, Triton X-114， Triton X-IOO(Fluka) ；Teritgol 系列(如 Tergitol TMN-3 (Fulka))等。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果本发明通过在微生物发酵液中添加非离子表面活性剂，表面活性剂改变了细胞膜的渗透性。一方面，微生物细胞膜内的目标产物(浓度为Cb)能够选择性地渗透到细胞外环境(浓度为Cp)。这解除了细胞内产物的抑制作用，将显著提高目标产物在发酵过程中的有效体积，从而显著提高目标产物的产量， 同时调节了微生物次级产物代谢。例如添加非离子表面活性剂使红曲色素中黄色素组成分率明显增加。另一方面，细胞外发酵液中目标产物在非离子表面活性剂胶束溶液或其浊点系统中加溶在表面活性剂胶束中(浓度为Ce)，这一萃取过程浓缩了目标产物，进一步解除了产物的抑制，简化了下游分离过程。这一过程的实现关键在于所选择的非离子表面活性剂能够影响细胞膜的渗透性而不至于影响微生物细胞的生长、合成次级代谢产物等生命过程，即维持微生物在表面活性剂胶束溶液及其所形成的浊点系统中的生物相容性。
图1为渗透萃取发酵的原理图；
具体实施例方式以下实例将对本发明作进一步说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。本实施例涉及微生物菌种Monascus anka为公开的已有菌种，可以通过中国工业微生物菌种保藏中心获得(保藏编号CICC 5013)，也可以通过商家购买获得。该微生物菌株通过常规的固态发酵或深层液态发酵可以获得微生物次级代谢产物红曲色素。红曲色素其主要组成成分为黄色素、橙色素和黄色素，是疏水性化合物，主要分布在微生物细胞内。 红曲色素在我国已经有上千年的应用历史，是天然的食品色素添加剂。采用现代发酵技术具有重要的工业化价值。如图1所示，为本发明渗透萃取发酵的原理图。其中，种子斜面培养为PDA培养基(1L水中土豆汁200g，葡萄糖20g，琼脂15_20g)在30度条件下培养2天。种子活化培养基为(1L水中玉米粉 30g，NaN0s3g, KH2P044g, FeSO4 · 7H200. Olg)，在 30度、110转/分的摇床中培养2天。发酵培养基为(1L水中玉米粉 70g，KH2P045g, CaCl2O. lg，FeSO4 · 7H200. Olg)，调节 pH到4，在30度、110转/分的摇床中培养，6-8天。产物红曲色素包括红色素、橙色素和黄色素等主要组分。对应细胞内产物浓度和细胞外产物浓度分别在520nm、470nm和410nm处用分光光度法测定。细胞外产物浓度通过离心后适当稀释直接测定。细胞内产物浓度采用等发酵液体积的乙醇浸泡细胞1小时离心后适当稀释上清液测定色素的吸光度。黄色素、橙色素、红色素的色素浓度分别表示为410， 470和510纳米下的光密度值。实施例1在聚合物PEG 4000添加量为0. 4g/100ml的条件下按常规条件反应7天得到细胞外黄色素，橙色素，红色素的光密度分别为10，6和9。实施例2在聚合物PEG 10000添加量为0. 4g/100ml,的条件下按常规条件反应7天得到细胞外黄色素，橙色素，红色素的光密度分别为10，7和8。实施例3在聚合物MPEG 5000添加量为0. 4g/100ml的条件下按常规条件反应7天得到细胞外黄色素，橙色素，红色素的光密度分别为5，4和5。实施例4在聚合物非离子表面活性剂F68添加量为0. 4g/100ml的条件下按常规条件反应 7天得到细胞外黄色素，橙色素，红色素的光密度分别为5，4和6。实施例5在聚合物非离子表面活性剂L64添加量为0. 4g/100ml的条件下按常规条件反应 7天得到细胞外黄色素，橙色素，红色素的光密度分别为6，5和5. 5。实施例6在非离子表面活性剂Tween 80添加量为0. 4g/100ml的条件下按常规条件反应7 天得到细胞外黄色素，橙色素，红色素的光密度分别为5，5和4。实施例7在非离子表面活性剂Span 20添加量为0. 4g/100ml的条件下按常规条件反应7 天得到细胞外黄色素，橙色素，红色素的光密度分别为4，3和4。实施例8在非离子表面活性剂Triton X-100添加量为0. 4g/100ml的条件下按常规条件反应7天得到细胞外黄色素，橙色素，红色素的光密度分别为16，8和15。实施例9在非离子表面活性剂Triton X-114添加量为0. 4g/100ml的条件下按常规条件反应7天得到细胞外黄色素，橙色素，红色素的光密度分别为3，2和3。实施例10在非离子表面活性剂Triton X_45添加量为0. 4g/100ml的条件下按常规条件反应7天得到细胞外黄色素，橙色素，红色素的光密度分别为4，3和4。实施例11在非离子表面活性剂TMN-3添加量为0. 4g/100ml的条件下按常规条件反应7天得到细胞外黄色素，橙色素，红色素的光密度分别为3，2和3。实施例12在非离子表面活性剂Brij 30添加量为0. 4g/100ml的条件下按常规条件反应7 天得到细胞外黄色素，橙色素，红色素的光密度分别为0，0和0。实施例13在非离子表面活性剂Triton X-100添加量为0. 4g/100ml的条件下按常规条件反应6天得到细胞外黄色素，橙色素，红色素的光密度分别为12，6和11。实施例14在非离子表面活性剂Triton X-100添加量为0. 4g/100ml的条件下按常规条件反应8天得到细胞外黄色素，橙色素，红色素的光密度分别为17，9和16。实施例15在非离子表面活性剂Triton X-100添加量为0. 4g/100ml的条件下按常规条件反应9天得到细胞外黄色素，橙色素，红色素的光密度分别为18，9和17。实施例16在非离子表面活性剂Triton X-100添加量为0. 2g/100ml的条件下按常规条件反应7天得到细胞外黄色素，橙色素，红色素的光密度分别为14，6和12。实施例17在非离子表面活性剂Triton X-100添加量为0. 8g/100ml的条件下按常规条件反应7天得到细胞外黄色素，橙色素，红色素的光密度分别为27，16和18。实施例18在非离子表面活性剂Triton X-100添加量为1. 6g/100ml的条件下按常规条件反应7天得到细胞外黄色素，橙色素，红色素的光密度分别为38，21和22。实施例19在非离子表面活性剂Triton X-100添加量为3. 2g/100ml的条件下按常规条件反应7天得到细胞外黄色素，橙色素，红色素的光密度分别为49，23和M。实施例20在非离子表面活性剂Triton X-100添加量为6. 4g/100ml的条件下按常规条件反应7天得到细胞外黄色素，橙色素，红色素的光密度分别为48，21和22。实施例21在非离子表面活性剂Triton X-100添加量为12. 8g/100ml的条件下按常规条件反应7天得到细胞外黄色素，橙色素，红色素的光密度分别为37，17和18。实施例22在非离子表面活性剂Triton X-100和Triton X_45以复配比例为4 6且添加量为4g/100ml的条件下按常规条件反应7天得到细胞外黄色素，橙色素，红色素的光密度分别为53，25和26。该细胞外溶液系统在发酵温度下发生相分离而形成浊点系统，其中表面活性剂浓缩相的黄色素，橙色素，红色素的光密度分别为108，42和35，而表面活性剂稀
6相中黄色素，橙色素，红色素的光密度分别为8，3和5。实施例23在不添加非离子表面活性剂的条件下，常规水溶液的对照系统中按常规条件发酵 7天得到细胞外黄色素，橙色素，红色素的光密度分别为8，6和10。对比实施例19，20和21 等的实验结果，添加非离子表面活性剂不但使胞外红曲色素的产量明显增加，而且明显提高了红曲色素中黄色素的分率。以上是本发明优选实施例的描述，应当理解的是，本发明的实施并不局限于上述的情形，本发明特别适合于细胞内产物的发酵过程，如细胞内微生物酶的生产、细胞内有机小分子物质的生产以及细胞内油脂类化合物的生产等，可以有效地解除胞内产物抑制，提高微生物发酵产物的浓度和调节微生物发酵次级代谢产物的组成。从而提高了微生物发酵的体积产率和提高了胞内产物发酵、产物释放等过程的效率。尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
权利要求
1.一种用非离子表面活性剂渗透萃取发酵微生物胞内产物的方法，其特征在于微生物发酵胞内产物时，以添加非离子表面活性剂浓度形成的非离子表面活性剂胶束溶液或其形成的浊点系统作为微生物的发酵介质，将细胞内的产物渗透到细胞外环境，提高微生物发酵的产物水平，同时实现微生物胞内产物的渗透萃取发酵。
2.根据权利要求1所述的采用非离子表面活性剂渗透萃取发酵微生物胞内产物的方法，其特征在于所述的胞内产物的渗透萃取发酵，包括利用非离子表面活性剂胶束溶液或其形成的浊点系统将微生物红曲霉菌发酵生产红曲色素的胞内产物释放到细胞外，同时萃取微生物发酵液中的红曲色素。
3.根据权利要求1或2所述的用非离子表面活性剂渗透萃取发酵微生物胞内产物的方法，其特征在于所述非离子表面活性剂包括高分子聚合物，聚合物非离子表面活性剂以及小分子非离子表面活性剂中一种或者多种。
4.根据权利要求3所述的用非离子表面活性剂渗透萃取发酵微生物胞内产物的方法， 其特征在于所述非离子表面活性剂包括聚氧乙烯多聚物、甲氧基聚氧乙烯类聚合物、共多聚物L64、F68，以及山梨醇类、脂肪醇聚氧乙烯醚类、Triton X系列、Teritgol系列中一种或多种。
5.根据权利要求4所述的用非离子表面活性剂渗透萃取发酵微生物胞内产物的方法， 其特征在于所述非离子表面活性剂浓度的范围在0. 2-128g/L发酵液。
6.根据权利要求1或2所述的用非离子表面活性剂渗透萃取发酵微生物胞内产物的方法，其特征在于所述非离子表面活性剂提高微生物发酵的产物浓度，同时调节微生物次级代谢产物的组成。
7.根据权利要求6所述的用非离子表面活性剂渗透萃取发酵微生物胞内产物的方法， 其特征在于所述非离子表面活性剂提高了胞外红曲色素的浓度和提高了红曲色素中黄色素的分率。
全文摘要
本发明公开了一种用非离子表面活性剂渗透萃取发酵微生物胞内产物的方法，具体是微生物发酵胞内产物时，以添加非离子表面活性剂浓度形成的非离子表面活性剂胶束溶液或其形成的浊点系统作为微生物的发酵介质，将细胞内的产物渗透到细胞外环境，提高微生物发酵的产物水平，同时实现微生物胞内产物的渗透萃取发酵。本发明特别适合于细胞内产物的发酵过程，如细胞内微生物酶的生产、细胞内有机小分子物质的生产以及细胞内油脂类化合物的生产等，有效地解除了胞内产物抑制，提高了微生物发酵产物的浓度和调节了微生物发酵次级代谢产物的组成。从而提高了微生物发酵的体积产率和提高了胞内产物发酵、产物释放等过程的效率。
文档编号C12P1/02GK102443605SQ20111034641
公开日2012年5月9日 申请日期2011年11月4日 优先权日2011年11月4日
发明者王志龙, 胡志强 申请人:上海交通大学