专利名称：低甲基化基因poteh的应用方法
技术领域：
本发明涉及低甲基化基因POTEH在制备脑胶质瘤病人预后预测试剂中的应用。
背景技术：
目前的研究将表观遗传学定义为DNA序列不发生改变的可遗传性的基因表达变化。表观遗传调控机制包括DNA甲基化、组蛋白修饰及microRNAs。至今，大量的研究发现表观遗传机制在多种肿瘤(包括胶质瘤)的发生发展中发挥着重要作用。现有的研究显示， 全基因组低甲基化在胶质瘤母细胞瘤中发生率约为80%，而且单拷贝基因与重复序列在胶质瘤中也能发生低甲基化。胶质瘤是人类最常见且恶性程度非常高的中枢神经肿瘤，随着医疗水平的不断提高，许多肿瘤病人的5年或10生存率明显提高，但是胶质瘤病人的预后仍未得到明显改善， 其5年生存率低于25%，而胶质瘤母细胞瘤的病人总生存时间平均为12. 3个月。目前，对脑胶质瘤的预后判定没有参考标准，也没有特异性的指标，远远不能适应对人脑胶质瘤进行预后判定的需求。因此，对人脑胶质瘤进行预后判定，以便选择最佳治疗方案，显著提高患者生存率，成为科学研究亟待解决的重要课题。POTEH 基因(POTE ankyrin domain family, member H)定位于染色体 22qll. 1， GeneBank 登录号NM_001136213，又称 A26C3 (ANKRD26_like family C member 3)，是 POTE 家族成员，包含7个ANK重复序列。多项研究表明，POTE家族表达仅限于少数组织，如前列腺、睾丸、卵巢及胎盘等。但是该家族成员在乳腺癌、前列腺癌及多种恶性肿瘤中高表达。 申请人:用免疫组织化学法检测POTEH蛋白在正常脑组织及脑胶质瘤组织中的表达，结果显示POTEH在胶质瘤中表达增加(ρ < 0. 05，图1)，高级别胶质瘤组织(III级、IV级)中 POTEH的表达较低级别(I级、II级)增加，差异有统计学意义(p = 0. 008)。亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)证实，POTEH在胶质瘤中发生低甲基化(ρ < 0. 001)。然后用SPSS 13. 0软件对POTEH蛋白表达与POTEH基因低甲基化进行相关性分析，结果表明两者间存在相关性 (P < 0. 05)，说明表观遗传学可能参与了 POTEH基因的表达调控。利用亚硫酸氢盐测序PCR法(BSP)分析所获得的肿瘤特异性甲基化状态，是甲基化分析的金标准，它能明确所测区域每一个CG位点的甲基化状态。
发明内容
本发明的目的是提供一种低甲基化基因POTEH的应用方法，对于脑胶质瘤的预后预测具有重要意义。低甲基化基因POTEH用于制备脑胶质瘤诊断、预测、检测或筛查制剂；特别是用于制备脑胶质瘤诊断、预测、检测或筛查的试剂盒。如用于制备亚硫酸氢盐直接测序法预测脑胶质瘤的制剂；所述的制剂中包括 根据POTEH基因启动子区CpG岛设计的，采用亚硫酸氢盐直接测序法的引物序列为F 5' TGATATTTGTGGTTTTAAGATTTATGTAG 3‘，
R 5' ATTACAAACCAACCAAACCATTAC 3‘。一种用于人脑胶质瘤预后预测的POTEH基因启动子区甲基化检测试剂盒，包括以下引物F 5' TGATATTTGTGGTTTTAAGATTTATGTAG 3‘，R 5' ATTACAAACCAACCAAACCATTAC 3‘。申请人:发现POTEH基因在脑胶质瘤组织中表达上调(图1)。POTEH转录起始位点上游_8Mbp至-353bp为一典型的CpG岛(图2)，该CpG岛中CG位点在正常的脑组织中均处于高甲基化状态，而在POTEH表达上调的脑胶质瘤组织中其甲基化程度降低(部分结果见图3)。POTEH低甲基化的胶质瘤病人总生存率明显低于高甲基化的病人(图4)，提示 POTEH基因是胶质瘤中的低甲基化基因，是预测胶质瘤预后的分子标志。本发明为脑胶质瘤预后预测提供了强有力的分子生物学基础，具有深远的临床意义和推广性。
图1 POTEH蛋白在正常脑组织及不同病理分级胶质瘤中的表达；A 正常脑组织；B 胶质瘤WHO I级；C 胶质瘤WHO II级；D 胶质瘤WHO III级； E 胶质瘤WHO IV级；图2 POTEH基因启动子的活性区域_8Mbp至_353bp为一典型的CpG岛；浅蓝色区域为CpG岛，横坐标下红色竖线表示CG位点；图3 BSP检测正常脑组织和胶质瘤组织中POTEH基因启动子区甲基化状态；图中所示为部分结果，N2 第2例正常脑组织；N6 第6例正常脑组织；T9 第9例胶质瘤组织；T12 第12例胶质瘤组织；T18 第18例胶质瘤组织；TM 第对例胶质瘤组织。 〇表示非甲基化位点， 表示甲基化位点，每一行表示一个克隆中所有CG位点的甲基化状态，计算5个克隆中的非甲基化位点比率进行比较。结果表明，正常脑组织中POTEH基因启动子区CpG岛为高甲基化状态，而胶质瘤组织中该CpG岛发生低甲基化；图4 POTEH启动子低甲基化与胶质瘤病人预后的关系。绿色曲线表示POTEH基因启动子甲基化的胶质瘤病人的生存状况及时间，蓝色曲线表示POTEH基因启动子发生低甲基化的胶质瘤病人的生存状况及时间。用SPSS 13.0软件进行Kaplan-Meier检验，差异有统计学意义(p = 0. 034)，说明POTEH低甲基化的病人预后较高甲基化的病人差。
具体实施例方式以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。实施例1 米用 Promoterscan, Genomatix Promoter Inspector 及 CpGplot 等生物信息学软件对POTEH基因5，端序列进行生物信息学分析，结果表明POTEH基因的启动子区域可能位于_817bp至-315bp处(以起始密码子ATG中A为+1)。Methl primer express 软件和在线软件Methprimer分析POTEH启动子预测区域，结果显示存在一 CpG岛，设计并合成 POTEH 启动子区的甲基化引物，5 ‘ TGATATTTGTGGTTTTAAGATTTATGTAG 3 ‘ (F)， 5' ATTACAAACCAACCAAACCATTAC 3' (R)。对10例正常脑组织进行经亚硫酸盐处理后的基因组测序(BSP)，发现POTEH基因启动子CpG岛中CpG位点在正常的脑组织均处于甲基化状态。同时对不同级别脑胶质瘤组织标本(I级14例，II级48例，III级28例，IV级12 例)96例，进行了 POTEH启动子区甲基化状态的检测，发现81. 3%的脑胶质瘤组织中POTEH 的启动子区发生低甲基化，与正常脑组织比较，差异有统计学意义(P <0.05)，各级胶质瘤的POTEH启动子区甲基化水平没有明显的差异(ρ > 0. 05)。POTEH启动子区低甲基化的病人预后较甲基化病人的差，差异有统计学意义(P = 0. 034)。以上研究结果提示，POTEH基因是一个新发现的脑胶质瘤甲基化基因，是一个胶质瘤预后预测标志。操作步骤(一 )亚硫酸氢盐修饰样品gDNA制备选择已商品化的亚硫酸氢盐修饰试剂盒。( 二)亚硫酸氢盐直接测序PCR (BSP)试剂盒的使用内容该试剂盒包括用于检测POTEH基因启动子区甲基化的PCR引物F 5' TGATATTTGTGGTTTTAAGATTTATGTAG 3‘，R 5' ATTACAAACCAACCAAACCATTAC 3‘。PCR扩增体系(_20°C保存)。原理利用甲基化引物进行PCR扩增POTEH启动子区CpG岛。步骤1取经亚硫酸氢盐修饰后的样品gDNA 4μ 1 (总量约IOOng)，加入含甲基化引物 2 μ 1 的 PCR 扩增体系(50 μ 1)，使用 Takara 公司的 EmeraldAmp PCR Master Mix (含 DNA 聚合酶、缓冲液及dNTP混合物)进行扩增。PCR扩增体系为
EmeraldAmp PCR Master Mix 25μ DNA (25ng/pl)4μ1
甲基化引物(20ηΜ)2μ1
H2O19μ1
总体系50μ12加样后，置PCR仪进行PCR扩增，反应条件如下
95 "C5min
95 °C30s 〕
57°C2min V 38 Cycles
72 °C2min .
72 °CIOmin
4 °C保存(三)琼脂糖电泳，胶回收PCR产物
5
将PCR产物进行1 %的琼脂糖凝胶电泳45min，经溴乙啶染色，紫外光下切胶，产物为39Ibp，胶回收试剂盒回收PCR产物(四)连接胶回收产物至pGEM-T载体使用Promega公司的pGEM-T easy载体体系(货号A1360)
权利要求
1.低甲基化基因POTEH的应用方法，其特征在于，所述的低甲基化基因POTEH用于制备脑胶质瘤诊断、预测、检测或筛查制剂。
2.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述的低甲基化基因POTEH用于制备脑胶质瘤诊断、预测、检测或筛查的试剂盒。
3.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述的低甲基化基因POTEH用于制备亚硫酸氢盐直接测序法预测脑胶质瘤的制剂。
4.根据权利要求1或3所述的应用方法，其特征在于，所述的制剂中包括根据POTEH 基因启动子区CpG岛设计的，采用亚硫酸氢盐直接测序法的引物序列为F 5' TGATATTTGTGGTTTTAAGATTTATGTAG 3‘， R 5' ATTACAAACCAACCAAACCATTAC 3‘。
5.一种用于人脑胶质瘤预后预测的POTEH基因启动子区甲基化检测试剂盒，其特征在于，包括以下引物F 5' TGATATTTGTGGTTTTAAGATTTATGTAG 3‘， R 5' ATTACAAACCAACCAAACCATTAC 3‘。
全文摘要
本发明涉及低甲基化基因POTEH的应用，即用于制备脑胶质瘤诊断、预测、检测或筛查制剂。特别是用于制备亚硫酸氢盐直接测序法预测脑胶质瘤预后的制剂。通过研究证实POTEH在胶质瘤组织中因启动子发生低甲基化而高表达，将检测POTEH基因低甲基化应用于胶质瘤预后预测，为预测胶质瘤病人的预后提供强有力的分子生物学依据，具有深远的临床意义和推广性。
文档编号C12Q1/68GK102363807SQ201110345940
公开日2012年2月29日 申请日期2011年11月4日 优先权日2011年11月4日
发明者余志斌, 刘晓萍, 卞艳慧, 唐海林, 李桂源, 武明花, 王泽友 申请人:中南大学