专利名称：硫氧还蛋白-1的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及硫氧还蛋白-1用作检测早产的mRNA分子标记的应用，属于生物技术领域。
背景技术：
早产是常见的妊娠并发症，其娩出的新生儿称早产儿。在整个妊娠期，早产 (<37周孕期)，包括早产胎膜早破和新生儿体重<2500g的发生率大约是8-10%，围产期发病率和死亡率超过 75%。(Saigal S. and Doyle L. W. , An overview of mortality and sequelae of preterm birth from infancy to adulthood. Lancet, 2008. 371: 261-269. Abrahams C. and M. Katz, A perspective on the diagnosis of preterm labor. Journal of Perinatal & Neonatal Nursing, 2002. 16: 1-11. Medina Τ. M. and Hill D. A. , Preterm premature rupture of membranes: diagnosis and management. Am Fam Physician, 2006. 73: 659-664. Menon R. , Spontaneous preterm birth, a clinical dilemma: etiologic, pathophysiologic and genetic heterogeneities and racial disparity. Acta Obstet Gynecol Scand, 2008. 87: 590-600·)。因为早产的胎儿各脏器功能不全，对外界适应力差，而且早产儿死亡数占新生儿总死亡人数的69%-83%，其死亡率比足月儿高11-16倍，幸存的早产儿中8%会出现脑瘫、视听障碍、认知障碍、神经行为障碍等后遗症。因此，明确早产的发生机理对预防早产具有重要意义。探讨一种新的早产相关分子，对明确早产的机理具有重要意义。硫氧还蛋白-1 (thioredoxin-1，TRX-I)又称白细胞介素_1样细胞因子、成人T 细胞白血病衍化因子、早孕因子等。TRX-I具有抗氧化、抗炎症、抗凋亡的作用，能保护细胞，减轻氧化应激和炎症所致的损伤。TRX-I是生物体所必须的基因，如果选择性地敲除小鼠的TRX-I基因，小鼠则早期胚胎致死，不能存活(Matsui M.，Oshima M.，Oshima H.， Takaku K., Maruyama T. , Yodoi J. , and Taketo Μ. Μ. Early embryonic lethality caused by targeted disruption of the mouse thioredoxin gene. Dev. Biol. 1996, 178: 179-185)。TRX-I抑制p38 MAH(和凋亡信号调节激酶1相关的凋亡信号传导途径，具有抗细胞凋亡能力(Saito M.，Nishitohj H.，Fujiij M.，Takedaj K.，Tobiumej K.， Sawadaj Y.，Kawabataj M.，Miyazonoj K.，and Ichijyoj H. Mammalian thioredoxin is a direct inhibitor of apoptosis signal-regulating kinase (ASK) 1. EMBO ，1998，17: 2596-2606； Hashimoto S. , Matsumoto K. , Gon Y. , Furuichi S. , Maruoka S.，Takeshita I.，Hirota K.，Yodoi J.，and Horie Τ. Thioredoxin negatively regulates p38 MAP kinase activation and IL-6 production by tumor necrosis factor-alpha. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999，258: 443—447·)。同时，TRX—1 具有调节与早产密切相关一些促炎症因子的作用如白介素1β，白介素6，白介素8和肿瘤坏死因子 ct (Billiet L，Furman C.，Larigauderie G.，et al. Extracellular human thioredoxin-1 inhibits lipopolysaccharide一induced interleukin-lbeta expressionin human monocyte-derived macrophages. J Biol Chem 2005； 280: 40310-40318. Nakamura H. , Herzenberg L Α., Bai J., et al. Circulating thioredoxin suppresses lipopolysaccharide-induced neutrophil chemotaxis. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98 : 15143-15148.)。目前，TRX-I作为在判断早产的应用尚未见报道。
发明内容
本发明目的在于将硫氧还蛋白-1应用于检测早产的mRNA分子标记，TRX-I的 mRNA在正常孕龄分娩胎盘组织和早产胎盘组织中表达存在差异。本发明中所述用作检测早产的分子标记是检测硫氧还蛋白-1在胎盘组织中的 mRNA的表达量。本发明中所述检测硫氧还蛋白-1的mRNA表达量是检测该蛋白在早产胎盘组织中表达水平是否高于正常分娩的胎盘组织。采用Real-time PCR方法，比较TRX-I在正常分娩胎盘组织和早产胎盘组织中表
达差异。基于TRX-I基因与早产的这种相关性，以这TRX作为一个分子标记对其表达量进行检测早产发生的新用途。检测方法包括以下步骤
A、用TRX-I引物和探针检测早产和正常分娩的胎盘组织中TRX-I的mRNA水平；
B、将步骤A测得的正常胎盘组织中和早产胎盘组织中TRX-I的mRNA的表达水平进行比较，得出TRX-I的mRNA在早产胎盘组织中高于正常分娩，提示TRX-I的mRNA的表达升高与早产有关。鉴于到目前为止，还没有硫氧还蛋白-1与早产的相关报道，因此本发明的发现为早产诊断预防和/或治疗提供一条新的途径。
图1是TRX-I在早产胎盘组织和正常分娩胎盘组织中的表达，Real-time PCR分析结果，显示TRX-I在早产胎盘组织中表达明显增加。图中Normal为正常组M例，PTD早产组；35例。
具体实施例方式这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照实验手册或者制造商所建议的条件。实施例中采用的药品为无水乙醇，氯仿，异丙醇，天津市化学试剂三厂；Real Time PCR master MIX，TaKARa公司；反转录试剂盒，Ferments公司；Trizol，北京康为世纪生物科技有限公司，琼脂糖，Sanland-chem International公司。实施例中采用的主要仪器为旋涡混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司生产；BYY-6C双稳定时电泳仪，北京六一仪器有限公司生产J-25离心机，美国贝克曼公司生产；GIS凝胶成像系统，珠海黑马医学仪器有限公司；7300型荧光定量PCR仪，美国ABI公司；PCR仪，美国ABI公司。实施例中所有早产胎盘组织和正常分娩胎盘组织样来源于脐旁1 cm处，大小约1 cmXl cm Xl cm的组织，采用59例样品，其中M例正常分娩组织，年龄在观.70 士 2. 88岁， 孕期在38. 16士 1.40周；35例早产组织，年龄在28. 74士5. 19岁，孕期在34. 17士 1.97周。实施例1 早产胎盘组织及正常分娩胎盘组织中总RNA样品的提取胎盘组织样品样品均来自云南省第一人民医院，所有早产都已得到临床确诊。早产胎盘组织及正常分娩胎盘组织中总RNA样品的提取方法，具体如下
1、手术切除的新鲜组织立即用生理盐水清洗后放入液氮保存隔夜，之后保存于_80°C 冰箱；
2、提取样品总RNA时，称取米粒大小组织块，在冰上用研磨器研磨，加入1ml Trizol, 室温放置 5 min，之后 12000 rpm/min，4°C离心 10 min ；
3、取上清于新印pendorf管中，加入200μ 1氯仿，轻微震荡，混勻，室温放置5 min，之后 12000 rpm /min，4°C离心 10 min ；
4、溶液分层，取最上层的上清液于新印pendorf管中，加入等体积的异丙醇，轻微震荡，混勻，室温放置20 min，之后12000 rpm /min，4°C离心10 min ；
5、弃去液体，加入1ml 75%乙醇，5000 rpm /min，4°C离心5 min ；
6、弃去乙醇，通风干燥约2-3min，根据沉淀量，加入10-20 μ L无菌水溶解，_80°C冰箱保存备用。 实施例2 检测RNA的质量
1、称取1g琼脂糖粉，充分溶解在100 ml的IXTAE中，配制成1%琼脂糖胶，室温下凝固 30 min ；
2、加样2μ 1 RNA,8 μ 1 DEPC/K禾口 2 μ 1 6 X loading buffer 混合；
3、电泳100V, 100 mA，30 40 min ；
4、在凝胶成像系统下，观察RNA情况，一般有3条带即5S、18 s,28 sRNA。实施例3:反转录PCR 1、配制第一步反应溶液
取任意一个RNA样品为阴性对照，配制反应液，操作如下
试剂剂量
DEPC /K9 μ 1
Oligo dT1 μ 1
RNA样品2μ1
总量12 μ 1
配制DEPC水和Oligo dT总量为(9+1)Χ (59+1+0. 5)，配完后，在PCR仪上70°C孵育 5 min。2、配制第二步反应溶液试剂剂量第一步反应溶液12 μ 1 5 X buffer 4μ 1 dNTP 2 μ 1RNase inhibitor1 μ 1
总量19 μ 1
说明样品有59个，那么配制5Xbuffer、dNTP和RNase inhibitor总量为:(4+2+1)X (59+1+0. 5)，配完后，在PCR仪上37°C孵育5 min。3、除阴性对照外，其余第二步反应液中各加入1 μ 1的反转录酶，并按照下面条件进行反转录
42 "C 60 min 70 "C10 min
4 0C+ ⑴
反应完成后，cDNA样品在-20°C冰箱保存。实施例4:实时定量 PCR (Real-Time PCR)
1、设计引物和探针；
根据目的基因TRX-I和管家基因GAPDH (内参)的序列，利用I^rimer express2. 0生物软件，结合Taqman探针及引物设计规则进行设计，引物和探针均由上海生物工程技术服务有限公司合成，引物及探针序列如下 用于TRX-I基因扩增的引物如下 Forward 5' -AAGCC TTGGA CGCTG CAG-3‘ Reverse 5' -CATCC TGACA GTCAT CCACA TCTAC T-3' 荧光探针5' -FAM-TGATC AAGCC TTTCT TTCAT TCCCT CTC-3‘ 用于GAPDH基因扩增的引物如下 Forward 5' -CAAGG CTGAG AACGG GAAG-3‘ Reverse 5' -GGTGA AGACG CCAGT GGACT-3‘ 荧光探针5' -FAM-ATCCC ATCAC CATCT TCCAG GAGCG-3‘
2、标准曲线的绘制；
任取cDNA样品(除阴性)，作梯度稀释，绘制标准曲线，将标准样品稀释成1、1/4、1/16、
1/64、1/256 —组样品。
3、配制扩增反应液
试剂剂量
cDNA 模板1 μ 1
Realtime PCR Master Mix12. 5 μ 1
TRX-I forward 引物0. 5 μ 1
TRX-I reverse 弓丨物0. 5 μ 1
TRX-I的荧光探针0. 25 μ 1
ddH2010.25 μ 1
总量25 μ 1
说明样品有 24+35，那么配制 Realtime PCR Master Mix GAPDH forward, GAPDH Reverse 和 dd H20 的总量为:(12. 5+0. 5+0. 5+0. 25+ 10. 25) X (59+0. 5) PCR反应条件如下 95 V2 min4、数据处理
查看标准曲线的R2值，R2值越接近于1越好，一般要达到0. 99以上。记录下每个实验的Qty值，最终结果为相对TRX-I mRNA的量。数据用GraphPad Prism 4软件分析作图，其中p<0. 05代表与正常对照组之间的差异。综上所述，本发明筛选了早产胎盘组织和正常分娩胎盘组织中表达差异的分子， 用实时定量PCR实验证实，在早产胎盘组织TRX-I比正常分娩胎盘组织中明表达显地增高， 表明TRX-I与早产的发生发展有密切的相关性，因此，以早产胎盘组织及正常分娩胎盘组织作为检测对象，对TRX-I的mRNA表达量进行检测，用于检测早产，TRX-I可以作为早产的检测的相关分子标志。
权利要求
1.一种硫氧还蛋白-1用作检测早产的mRNA分子标记的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于用作检测早产的分子标记是检测硫氧还蛋白-1在胎盘组织中的mRNA的表达量。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于检测硫氧还蛋白-1的mRNA表达量是检测该蛋白在早产胎盘组织中表达水平是否高于正常分娩的胎盘组织。
全文摘要
本发明公开了硫氧还蛋白-1的应用，用作检测早产的mRNA分子标记，通过Real-timePCR实验检测正常分娩和早产的胎盘组织中硫氧还蛋白-1的mRNA表达水平，本发明揭示了早产胎盘组织中硫氧还蛋白-1的mRNA表达水平较正常分娩的明显增高，在正常分娩和早产的胎盘组织中通过硫氧还蛋白-1检测mRNA分子标记的差异，有助于作为诊断早产发生的可能因素，对预防早产的发生有临床意义。
文档编号C12Q1/68GK102382887SQ20111034525
公开日2012年3月21日 申请日期2011年11月4日 优先权日2011年11月4日
发明者宋军营, 白洁, 董旭东 申请人:昆明理工大学