专利名称：Hiv-1b亚型耐药突变株及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种HIV-IB亚型耐药突变株及其构建方法和应用。
背景技术：
人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)是引起人类获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)的病原体，自 1981 年美国首次诊断出艾滋病以来，艾滋病在全球范围内迅速传播。中国艾滋病的流行已有25年，截止2010年10月底，中国已累计报告艾滋病病毒感染者和艾滋病患者37万余例，其中艾滋病病人已逾13万之多，仅死亡病例就已超过6. 8万。在国家“四免一关怀”政策的支持下，我国从2003年开始在全国范围内逐步实施免费的艾滋病抗病毒治疗，到2010年底治疗人数已超过7万人。临床观察表明，抗病毒治疗对减轻病情、提高病人生活质量、延长生命具有很好的作用。但抗病毒治疗也是一把“双刃剑”，在为病人带来福音的同时也为进一步的治疗带来了困难——HIV耐药性的出现与流行成了制约抗病毒治疗的瓶颈。HIV-I抑制剂主要是针对蛋白酶和逆转录酶设计而成，目的是阻断HIV-I的复制和包装。尽管目前已经确定了大量HIV耐药突变位点，但是仍然不断有新型耐药突变位点被发现和鉴定，原因是(1)以往对耐药突变位点的研究主要集中于药物与病毒靶标的结合区，近年来发现，药物压力对病毒的影响是长期的、整体的，在药物结合区以外也有耐药相关突变位点；( 病毒长期处于药物压力下，宿主/病毒/药物长期相互作用，病毒将出现比初期受到药物压力时更多耐药相关突变；C3)不同亚型HIV-I毒株在相同的药物压力下可能出现不同的耐药突变或突变型。新型耐药突变位点的发现及鉴定对抗病毒治疗以及了解耐药机制都具有至关重要的意义。中国于2003年在既往有偿采浆感染HIV的艾滋病人群中首推使用6种国产仿制抗病毒药物(Zidovudine，简称AZT或ZDV，中文名称为齐多夫定；Dideoxyinosine，简称ddl，中文名称为去羟肌苷Jtavudine，简称d4T，中文名称为司他夫定；Lamivudine，简称3TC，中文名称为拉米夫定；Nevirapine，简称NVP，中文名称为奈韦拉平；Efavirenz，简称EFV,中文名称为依非韦仑)组成的AZT/ddl/NVP、AZT/3TC/NVP等6种治疗方案，之后在全国范围内全面推广。我国的抗病毒治疗模式存在以下特点(1)目前的抗病毒治疗主要使用国产仿制药，尽管药物的主要成分与国外的药物相同，但生产工艺的细小差别也可能影响药物的效果，例如在有些地区发现毒副作用可能较大，这可能直接影响药物的吸收以及血药浓度，对耐药性产生有重要影响；( 抗病毒治疗模式是以农村为主的依托乡村医生的治疗，服药的治疗和保障方式均有特点；C3)在河南等地区，由于对抗病毒治疗认识上的不足和缺乏必要的临床药物服用监督，药物依从性不能达到一个理想的水平，而依从性是影响耐药发生的一个至关重要的因素，在一些地区耐药发生已经到了相当严重的地步。虽然艾滋病病毒在我国流行呈多样性，但在我国以既往献/输血感染HIV的边远农村地区，HIV-IB亚型毒株依然占主导地位。抗病毒治疗时间长及上述抗病毒模式的特点，提示在HIV-IB亚型毒株中可能会存在有尚未被认知的新型耐药突变。
发明内容
本发明的目的是提供一种HIV-IB亚型耐药突变株及其构建方法和应用。本发明提供了一种构建HIV-IB亚型耐药突变株的方法，是将HIV-IB亚型野生株的逆转录酶自N末端第369位氨基酸残基由苏氨酸(T)突变为缬氨酸(V)，获得HIV-IB亚型耐药突变株(HIV-1B亚型T369V突变株)。所述HIV-IB亚型野生株的逆转录酶的氨基酸序列如序列表的序列1所示。所述将HIV-IB亚型野生株的逆转录酶自N末端第369位氨基酸残基由苏氨酸突变为缬氨酸具体是通过将HIV-IB亚型野生株的逆转录酶的编码基因自5’末端第1105位核苷酸由a突变为g，第1106位核苷酸由c突变为t实现的；所述HIV-IB亚型野生株的逆转录酶的编码基因如序列表的序列2所示。所述HIV-IB亚型耐药突变株对药物的耐受能力高于所述HIV-IB亚型野生株；所述药物为AZT(Zidovudine，又称齐多夫定)、EFV(Efavirenz ；又称依非韦仑)和NVP(Nevirapine，又称奈韦拉平)中的至少一种。所述将HIV-IB亚型野生株的逆转录酶自N末端第369位氨基酸残基由苏氨酸突变为缬氨酸的方法具体包括如下步骤(1)将pNL4. 3质粒中的所述HIV-IB亚型野生株的逆转录酶的编码基因自5’末端第1105位核苷酸由a突变为g，第1106位核苷酸由c突变为t，获得重组质粒pNL4. 3_T369V ；(2)将重组质粒pNL4. 3_T369V转染哺乳动物细胞，培养细胞并收获上清液。所述哺乳动物细胞具体可为细胞。所述培养的方法具体可为37°C培养18-4他。以上任一所述方法获得的HIV-IB亚型耐药突变株也属于本发明的保护范围。所述HIV-IB亚型耐药突变株可用于筛选抗艾滋病药物。本发明还保护一种重组质粒，为将pNL4. 3质粒中的HIV-IB亚型野生株的逆转录酶的编码基因自5’末端第1105位核苷酸由a突变为g，第1106位核苷酸由c突变为t，获得的重组质粒PNL4. 3_T369V ；所述HIV-IB亚型野生株的逆转录酶的编码基因如序列表的序列2所示。本发明还保护T369V突变在促进HIV-IB亚型野生株的耐药性中的应用；所述T369V突变为HIV-IB亚型野生株的逆转录酶自N末端第369位氨基酸残基由苏氨酸(T)突变为缬氨酸(V)。所述逆转录酶的氨基酸序列如序列表的序列1所示。本发明对于抗HIV药物的筛选具有重大价值，进而对艾滋病的治疗具有深远影响。
图1为重组质粒pNL4. 3_T369V的Hind III酶切鉴定图；泳道6 重组质粒pNL4. 3_T369V ；泳道10 分子量Marker ；其它泳道与本专利无关。图2为HIV-IB亚型T369V突变株感染MT_2细胞后的CPE效应(普通光学显微镜下的数码照片，物镜放大倍数为IOX，目镜放大倍数为10X)；箭头指示的为合胞体。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。pMD-18 T 载体TaKaRa 公司。AZT (Zidovudine) =SIGMA0 EFV(Efavirenz)上海迪赛诺公司。NVP(Nevirapine)上海迪赛诺公司。Phusion Site-directed MutagenesisKit 购自 New England Biolabs, Product Code :F541，用于 DNA 序列的定点突变。Lipofectamine 2000 购自 Invitrogen，Cat No :11668_019。实施例1、耐药突变位点的发现比较抗病毒治疗失败患者与未治疗患者蛋白全长基因的序列，在逆转录酶区的560个密码子中，2组人群中共计有6个位点的7个突变，其中一个突变为T369V。HIV-IB亚型的逆转录酶的氨基酸序列如序列表的序列1所示，其编码序列如序列表的序列2所示。从蛋白层面来说，T369V突变即将HIV-IB亚型野生株的逆转录酶(序列表的序列1所示)自N末端第369位氨基酸残基由苏氨酸(T)突变为缬氨酸(V)。从基因层面来说，T369V突变可为将HIV-IB亚型野生株的逆转录酶的编码基因(序列表的序列2所示)自5’末端第1105位核苷酸由a突变为g，第1106位核苷酸由c突变为t。实施例2、HIV-IB亚型耐药突变株(HIV-1B亚型T369V突变株)的构建pNL4. 3质粒公众可以从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得；参考文献Wang CiMitsuya YiGharizadeh B, Ronaghi Μ, Shafer RW. Characterizationof mutation spectra with ultra-deep pyrosequencing-application to HIV-I drugresistance. Genome Res. 2007 ； 17 (8) :1195-201. ；Hoffmann CiMinkah N,Leipzig J,WangGiArens MQ，Tebas PiBushman FD. NA bar coding and pyrosequencing to identify rareHIV drug resistance mutations. Nucleic Acids Res. 2007 ；35 (13) :e91. ；pNL4.3 质粒含有HIV-IB亚型野生株的全基因组序列，转染细胞并表达可以得到HIV-IB亚型野生株。细胞购自中国医学科学院基础医学研究所。ΜΤ-2细胞公众可以从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得；参考文献Coakley Ε, Reeves JD,Huang W,Mangas-Ruiz Μ,Maurer I,Harskamp AM, etal. Comparision of the HIV-I tropism profiles in clinical samples by the Trofileand MT-2 cell assays. Antimicrob Agents Chemother 2009 ；53 (11) :4686-93.。一、构建具有定点突变的重组质粒1、设计用于定点突变的引物如下T369V_F 5' -GATGTGAAACAATTAGTAGAGGCAGTACAAA-3'；T369V_R 5’ -ATTAGTGTGGGCACCCTTCATTC-3 ’。2、以pNL4. 3质粒为模板，用PLA-7和Vif_3组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(约2258bp)。PLA-7 :5，-CTTTGGATGGGTTATGAACT-3，(针对 pNL4. 3 的位置 3231-3250)；Vif-3 :5，-TCGCTGTCTTCGCTTCTTCCTGCCAT-3，(针对 pNL4. 3 的位置 5994-6019)。
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(PCR扩增的目的片段包括pNL4. 3质粒中的HIV-IB亚型野生株的逆转录酶的编码基因区域，并且在该区域以外具有Age I和EcoR I酶切位点)。3、将步骤2的PCR扩增产物与pMD-18 T载体连接，得到重组质粒甲。4、以重组质粒甲为模板，用T369V_F和T369V_R组成的引物对进行PCR扩增，并在T4 DNA连接酶的作用下得到重组质粒乙(因为是对环状DNA进行扩增，T369V_F和T369V_R分别扩增环状DNA的正义链和反义链，PCR扩增结束后，扩增产物在T4 DNA连接酶的作用下形成新的环形DNA，即重组质粒乙；重组质粒甲和重组质粒乙的区别仅在于将重组质粒甲中携带的HIV-IB亚型野生株逆转录酶编码基因自5’末端第1105位核苷酸由a突变为g，第1106位核苷酸由c突变为t)。5、用限制性内切酶Age I和EcoR I双酶切步骤4的重组质粒乙，回收酶切产物(约 2258bp)。6、用限制性内切酶Age I和EcoR I双酶切pNL4. 3质粒，回收载体骨架(约12. 2kb)。7、将步骤5的酶切产物和步骤6的载体骨架连接，得到重组质粒丙(又称重组质粒pNL4. 3_T369V)。利用限制性内切酶Hind III对重组质粒pNL4. 3_T369V进行单酶切鉴定，见图1，显示有5个条带，与预期相符。二、构建HIV-IB亚型T369V突变株1、用DMEM培养基(含100 μ g/ml青霉素和100U/ml链霉素)重悬细胞，得到4 X IO5个细胞/ml的细胞悬液。2、将细胞悬液加入6孔培养板，每孔anl，在(X)2培养箱中37°C培养M小时，然后弃除上清，用PBS缓冲液洗涤两次。3、借助Lipofectamine 2000 (按说明书操作)，将重组质粒pNL4. 3_T369V转染步骤2的细胞，每孔转染4微克重组质粒，在(X)2培养箱中37°C培养36小时，收集上清，将上清进行 P24 抗原测定(P24 试剂盒Vironostika@HIV-l Antigen Microelisa system，生产商=BiomeriEUX，产地法国)，结果为阳性，该上清即为即为HIV-IB亚型T369V突变株病毒液，分装后-80°C保存。三、HIV-IB亚型野生株的获得将pNL4. 3质粒代替重组质粒pNL4. 3_T369V，其它同步骤二，获得HIV-IB亚型野生株病毒液。四、突变病毒株的鉴定将步骤二得到HIV-IB亚型T369V突变株病毒液感染MT_2细胞，每5X IO4个细胞感染10微升病毒液(病毒液每毫升含1122TCID5(1的病毒剂量)，在(X)2培养箱中37°C培养，培养5天后的照片见图2。可以观察到，MT-2细胞产生了很大的合胞体，具有明显的CPE(cytopathic effect)反应，证明HIV-1B亚型T369V突变株是具有感染性的。分别将步骤二得到的HIV-IB亚型T369V突变株病毒液和步骤三得到的HIV-IB亚型野生株病毒液提取基因组DNA并进行测序，结果表明，与HIV-IB亚型野生株相比，HIV-IB亚型T369V突变株的差异仅在于两个核苷酸(将序列表的序列2所示的HIV-IB亚型野生株逆转录酶编码基因自5’末端第1105位核苷酸由a突变为g，第1106位核苷酸由c突变为t)，引起一个氨基酸突变(将序列表的序列1所示的HIV-IB亚型野生株的逆转录酶自N末端第369位氨基酸残基由苏氨酸突变为缬氨酸)。实施例3、HIV-IB亚型耐药突变株的耐药性鉴定1、在细胞培养板中加入10微升药物溶液(药物溶液由药物和水组成；分别采用AZT、EFV和NVP三种药物；每种药物设置6个梯度浓度AZT为2000nM 2. 74nM，稀释度为3° ；EFV为IOOnM 0. 14nM,稀释度为3° ；NVP为6000nM 8. 23nM,稀释度为3° 3_6 ；每个药物的每个浓度设置三个复孔)。2、用PBS缓冲液调整实施例2的步骤二得到的HIV-IB亚型T369V突变株病毒液(或实施例2的步骤三得到的HIV-IB亚型野生株病毒液)的浓度，得到病毒稀释液。3、在步骤1的细胞培养板中每孔加入20 μ 1步骤2的病毒稀释液，然后每孔加入70 μ 1 ΜΤ-2细胞悬液(ΜΤ-2细胞悬液中的细胞浓度为7 X IO4个细胞/ml)，感染性倍数(multiplicity of infection)MOI = 0. 003366TCID5(I，37°C、5% CO2 培养 2 天；第 3 天，每孔补加50 μ 1 RPMI-1640培养基(含10% FBS)，继续培养2天；第5天观察CPE，统计不同浓度下CPE出现的比例(CPE，% )。4、计算50%细胞出现CPE时的药物浓度，即IC5tl值。HIV-IB亚型T369V突变株针对AZT的IC50值为318. IOnM,针对EFV的IC50值为36. 92ηΜ，针对 NVP 的 IC5tl 值为 2661. ΟΟηΜ。HIV-IB亚型野生株针对AZT的IC50值为112. 50ηΜ，针对EFV的IC50值为8. IlnM,针对 NVP 的 IC5tl 值为 230. 40ηΜ。5、计算突变病毒株对于各个药物的耐药倍数。耐药倍数=HIV-IB亚型T369V突变株的IC5(1/HIV_1B亚型野生株的IC5(1。HIV-IB亚型T369V突变株针对AZT的耐药倍数为2. 83。HIV-IB亚型T369V突变株针对EFV的耐药倍数为4. 55。HIV-IB亚型T369V突变株针对NVP的耐药倍数为11. 5。
权利要求
1.一种构建HIV-IB亚型耐药突变株的方法，是将HIV-IB亚型野生株的逆转录酶自N末端第369位氨基酸残基由苏氨酸突变为缬氨酸，获得HIV-IB亚型耐药突变株。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述逆转录酶的氨基酸序列如序列表的序列1所示。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述将HIV-IB亚型野生株的逆转录酶自N末端第369位氨基酸残基由苏氨酸突变为缬氨酸是通过所述将HIV-IB亚型野生株的逆转录酶的编码基因自5’末端第1105位核苷酸由a突变为g，第1106位核苷酸由c突变为t实现的；所述HIV-IB亚型野生株的逆转录酶的编码基因如序列表的序列2所示。
4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于所述HIV-IB亚型耐药突变株对药物的耐受能力高于所述HIV-IB亚型野生株；所述药物为AZT、EFV和NVP中的至少一种。
5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述将HIV-IB亚型野生株的逆转录酶自N末端第369位氨基酸残基由苏氨酸突变为缬氨酸的方法包括如下步骤(1)将pNL4.3质粒中的所述HIV-IB亚型野生株的逆转录酶的编码基因自5’末端第1105位核苷酸由a突变为g，第1106位核苷酸由c突变为t，获得重组质粒pNL4. 3_T369V ；(2)将重组质粒pNL4.3_T369V转染哺乳动物细胞，培养细胞并收获上清液。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞为细胞；所述培养 的方法为37°C培养18-4 1。
7.权利要求1至6中任一所述方法获得的HIV-IB亚型耐药突变株。
8.权利要求7所述HIV-IB亚型耐药突变株在筛选抗艾滋病药物中的应用。
9.一种重组质粒，为将pNL4. 3质粒中的HIV-IB亚型野生株的逆转录酶的编码基因自5’末端第1105位核苷酸由a突变为g，第1106位核苷酸由c突变为t，获得的重组质粒pNL4. 3_T369V ；所述HIV-IB亚型野生株的逆转录酶的编码基因如序列表的序列2所示。
10.T369V突变在促进HIV-IB亚型野生株的耐药性中的应用；所述T369V突变为HIV-IB亚型野生株的逆转录酶自N末端第369位氨基酸残基由苏氨酸突变为缬氨酸；所述逆转录酶的氨基酸序列如序列表的序列1所示。
全文摘要
本发明公开了一种HIV-1B亚型耐药突变株及其构建方法和应用。本发明提供的的方法，是将HIV-1B亚型野生株的逆转录酶自N末端第369位氨基酸残基由苏氨酸突变为缬氨酸，获得HIV-1B亚型耐药突变株。本发明对于抗HIV药物的筛选具有重大价值，进而对艾滋病的治疗具有深远影响。
文档编号C12Q1/70GK102392039SQ20111034490
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月4日 优先权日2011年11月4日
发明者刘思扬, 刘永健, 庄道民, 李天一, 李敬云, 李林, 李韩平, 王晓林, 耿庆茂, 郭伟, 鲍作义 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所