专利名称：用于虫媒性脑炎病毒检测的寡核苷酸引物及其检测方法
技术领域：
本发明属于分子生物学方法进行病毒检测领域，具体检测12种脑炎病毒的方法。
背景技术：
东方型马脑脊髓炎病毒、西方型马脑脊髓炎病毒、委内瑞拉型马脑脊髓炎病毒、西尼罗河病毒、高地J病毒、拉科鲁尼亚病毒、辛德毕斯病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、Ockelbo病毒、基孔肯雅热病毒和III型登革热病毒均是通过蚊子(或其他野生动物)转播的脑炎病毒。传统的检测技术和方法主要是针对少量种类的此类病毒进行血清学或者分子生物学的检测，一般不超过5种。检测通量小，检测时间花费时间长。本发明主要基于在病毒特异性引物的两端加上一对外引物，在特异性扩增的基础上，利用外引物进行信号的统一放大，从而实现对12种虫媒病毒的高通量并行检测。东方型马脑脊髓炎病毒、西方型马脑脊髓炎病毒、委内瑞拉型马脑脊髓炎病毒、西尼罗河病毒、高地J病毒、拉科鲁尼亚病毒、辛德毕斯病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、Ockelbo病毒、基孔肯雅热病毒和III型登革热病毒均是通过蚊子传播的病原体，在现代战争中，均可能被恐怖分子利用，加以危害公众的安全。同时，人类食用被这些病毒污染的食品也会形成致命的危害。然而，在现有的报道中尚无一种技术可以同时对如上12种虫媒病毒进行同步的检测和筛查。由此可见，本发明将适用于针对蚊子所携带的病原体的动态研究、生物反恐、食品安全检测等有关的领域。
发明内容
本发明目的是提供一种高通量的、高敏感度和高特异性的针对12种虫媒性脑炎病毒的快速分子生物学检测方法，具体包括12对病毒特异性引物、1对通用放大引物、1对内对照引物以及特殊设计的检测方法。为了实现上述目的本发明采用如下技术方案基于12种病毒的特征性基因序列， 设计针对各种病毒的特异性检测引物、加上一对通用的放大引物，对检测信号进行放大和扩增，通过分析扩增产物的片段长度，实现对12种病毒的快速检测和同步鉴定。用于虫媒性脑炎病毒检测的寡核苷酸引物包括12对病毒特异性引物、1对通用放大引物和1对蚊子内对照引物，核苷酸序列为
拉科鲁尼亚病毒上游引物，SEQ NO. 1 ；拉科鲁尼亚病毒下游引物，SEQ NO. 2 ；高地J病毒上游引物，SEQ NO. 3 ；高地J病毒下游引物，SEQ NO. 4 ；Ockelbo病毒上游引物，SEQ NO. 5 ； Ockelbo病毒下游引物，SEQ NO. 6 ;III型登革热病毒上游引物，SEQ NO. 7 ;III型登革热病毒下游引物，SEQ N0. 8;基孔肯雅热病毒上游引物，SEQ N0. 9 ；基孔肯雅热病毒下游引物， SEQ N0. 10;辛德毕斯病毒上游引物，SEQ NO. 11 ；辛德毕斯病毒下游引物，SEQ N0. 12 ；东部型马脑脊髓炎病毒上游引物，SEQ N0. 13 ；东部型马脑脊髓炎病毒下游引物，SEQ N0. 14 ；西部型马脑脊髓炎病毒上游引物，SEQ N0. 15 ；西部型马脑脊髓炎病毒下游引物，SEQ N0. 16 ； 委内瑞拉马脑脊髓炎病毒上游引物，SEQ N0. 17 ；委内瑞拉马脑脊髓炎病毒下游引物，SEQNO. 18 ；日本脑炎病毒上游引物，SEQ NO. 19 ；日本脑炎病毒下游引物，SEQ NO. 20 ；西尼罗河病毒上游引物，SEQ NO. 21 ；西尼罗河病毒下游引物，SEQ NO. 22 ；圣路易斯脑炎病毒上游引物，SEQ NO. 23 ；圣路易斯脑炎病毒下游引物，SEQ NO. 24 ；通用放大引物上游，SEQ NO. 25 ；通用放大引物下游，SEQ NO. 26 ；蚊子内对照引物上游，SEQ NO. 27 ；蚊子内对照引物下游，SEQ
NO. 28 ο用于虫媒性脑炎病毒检测的检测方法包括反转录扩增、聚合酶链式反应扩增反应和产物的检测三部分；
其中，所述反转录反应液含Ix反转录缓冲液(50 mmol/L Tris-Hcl, 75mmol/L KCl, 1· 5 5. Ommol/L MgCl2, lOmmol/L DTT, pH8. 3(25°C )) ,0. 5 mmol/L dNTP (含 A、G、C、 T), 20U RNA酶抑制剂，1 2U逆转录酶，0. 1 0. 5 μ mol/L下游嵌套引物，100 500 ng样品RNA，按参数40 55°C，15 60 min, 85°C，5 min进行反应。反应完毕后，进行后续反应。所述聚合酶链式反应扩增反应的检测反应液含有Ix反应缓冲液(500 mmol/ L KCl,100 mmol/L Tris-HCl, 1% Triton X-100)，2· 0 5·0 mmol/L MgCl2, 200 400 μ mol/L dNTP (含A、G、C、Τ)，2 3U耐热DNA聚合酶，12对病毒特异性引物的浓度均为0. 1 0.3 “11101/1，蚊子内对照引物0.1 0.31111101/1，通用放大引物上游和通用放大引物下游的浓度均为0.4 1.2 μ mol/L，2. 5 5% DMS0，0. 2 0. 5 mol/L甜菜碱2 5μ L cDNAo反应条件为预变性95°C 5 min ;5 10个循环的预扩增94°C，30s ;45°C 55°C , 35s; 72°C 60s 120s; 35 40个循环94°C，40s，55°C 62°C，40s，65°C 72°C， 2min 5 min ；补充延伸:72°C，10 min。产物的检测用电泳系统对聚合酶链式反应扩增得到的产物进行分离和检测；根据所述产物的片段长度确定病毒类型。各种引物的序列为
拉科鲁尼亚病毒上游引物，SEQ NO. 1的序列为 5 ‘ -GCGTGTAGAGACTCACCCCGTATCACCTGTATCTTGAATTATG-3‘。拉科鲁尼亚病毒下游引物，SEQ N0. 2的序列为；
5 ‘ -ACTGCATCCAAAGGCTCGCAGTTGTACAACTATAGCAGAATCTT-3‘。高地J病毒上游引物，SEQ N0. 3的序列为；
5 ‘ -GCGTGTAGAGACTCACCCCGTATAGACGCAGGTTGAAGAT-3‘。高地J病毒下游引物，SEQ N0. 4的序列为；
5 ‘ -ACTGCATCCAAAGGCTCGCAGTTGAGTGAGGATAGCATACGA-3‘。0CKELB0病毒上游引物，SEQ N0. 5的序列为；
5 ‘ -GCGTGTAGAGACTCACCCCGTACCACCTGCAGCCGATAACACCTC-3‘。0CKELB0病毒下游引物，SEQ N0. 6的序列为；
5 ‘ -ACTGCATCCAAAGGCTCGCAGTTGGTGGAATTGGCTCTTCCTGCGTTT-3‘。III型登革热病毒上游引物，SEQ N0. 7的序列为；
5 ‘ -GCGTGTAGAGACTCACCCCGTACAGTGGAGTGGAAGGAGAA-3‘。III型登革热病毒下游引物，SEQ N0. 8的序列为；5 ‘-ACTGCATCCAAAGGCTCGCAGTTATTACCGTGCCTGTTGGA-3‘。基孔肯雅热病毒上游引物，SEQ NO. 9的序列为；
5 ‘-GCGTGTAGAGACTCACCCCGTACGTACGTGCCGGCGACCATT-3‘。基孔肯雅热病毒下游引物，SEQ NO. 10的序列为；
5 ‘-ACTGCATCCAAAGGCTCGCAGTTGCTTGGGCGACCACGGGAAT-3‘。辛德毕斯病毒上游引物，SEQ NO. 11的序列为；
5 ‘-GCGTGTAGAGACTCACCCCGTAACATCAGCCTCCAATTAGATAC-3‘。辛德毕斯病毒下游引物，SEQ NO. 12的序列为；
5 ‘-ACTGCATCCAAAGGCTCGCAGTTCTCCTGGTGCTGACTCTT-3‘。东部型马脑脊髓炎病毒上游引物，SEQ NO. 13的序列为； 5 ‘-GCGTGTAGAGACTCACCCCGTACAGTGGGTAGAGAGAAAT-3‘。东部型马脑脊髓炎病毒下游引物，SEQ N0. 14的序列为； 5 ‘-ACTGCATCCAAAGGCTCGCAGTTTTGTTGTCAATCAGGTAAG-3‘。西部型马脑脊髓炎病毒上游引物，SEQ N0. 15的序列为； 5 ‘-GCGTGTAGAGACTCACCCCGTACATTACCGATGACTTCAC-3‘。西部型马脑脊髓炎病毒下游引物，SEQ N0. 16的序列为； 5 ‘-ACTGCATCCAAAGGCTCGCAGTTTTCTCCATACTGTCTTCC-3‘。委内瑞拉马脑脊髓炎病毒上游引物，SEQ N0. 17的序列为； 5 ‘-GCGTGTAGAGACTCACCCCGTAAAGTGTCACTCCATACATCTC-3‘。委内瑞拉马脑脊髓炎病毒下游引物，SEQ N0. 18的序列为； 5 ‘-ACTGCATCCAAAGGCTCGCAGTTGCTCTACTCCGTGTTCTG-3‘。日本脑炎病毒上游引物，SEQ N0. 19的序列为；
5 ‘-GCGTGTAGAGACTCACCCCGTATAGTGGGAGTGAAGAGGGTAG-3‘。日本脑炎病毒下游引物，SEQ N0. 20的序列为；
5 ‘-ACTGCATCCAAAGGCTCGCAGTTGGGCTAATGCTGTAAACTTGAAG-3‘。西尼罗河病毒上游引物，SEQ N0. 21的序列为；
5 ‘-GCGTGTAGAGACTCACCCCGTACATAACATTCACAACGACATCAA-3‘。西尼罗河病毒下游引物，SEQ N0. 22的序列为；
5 ‘-ACTGCATCCAAAGGCTCGCAGTTCCTATTCCGACCATCAACAG-3‘。圣路易斯脑炎病毒上游引物，SEQ N0. 23的序列为；
5 ‘-GCGTGTAGAGACTCACCCCGTAAATCGTGGAAGTAGACAGA-3‘。圣路易斯脑炎病毒下游引物，SEQ N0. 24的序列为；
5 ‘-ACTGCATCCAAAGGCTCGCAGTTAGCCTAAGTCAACAACCT-3‘。通用放大引物上游，SEQ N0. 25的序列为； 5 ‘-GCGTGTAGAGACTCACCCCGTA-3‘。通用放大引物下游，SEQ N0. 26的序列为； 5 ‘-ACTGCATCCAAAGGCTCGCAGTT-3‘。蚊子内对照弓丨物上游，SEQ N0. 27的序列为；
5 ‘-GCGTGTAGAGACTCACCCCGTATTCAAATATCTGCCCTATCAA-3‘。
蚊子内对照弓丨物下游，SEQ NO. 28的序列为
5 ‘ -ACTGCATCCAAAGGCTCGCAGTTCCGTGTTGGACAAGAATA-3‘。本发明的优点是本发明可以快速地实现对未知样品中是否携带上述12种虫媒性脑炎病毒进行检测和鉴定。检测灵敏度高，特异性强。由于设计的扩增产物均在500 bp以内，所有特异性的病毒可以获得良好的扩增。特别的PCR循环条件所设计的5个循环的特异性预扩增，可以保证所有的目标病毒得到高效的扩增和特异性的扩增。本发明可以应用于出入境口岸、野外战场、乡村圈舍、雨林沼泽等不同环境下的蚊子等吸血昆虫进行高效的检测和病毒鉴定。
图1不同病毒的特异性扩增示例；
1-12种病毒单管同步扩增；2-西部型马脑脊髓炎病毒；3-东部型马脑脊髓炎病毒； 4-拉科鲁尼亚病毒；5-圣路易斯脑炎病毒6-Ockelbo病毒；7-基孔肯雅热病毒；8-委内瑞拉马脑脊髓炎病毒；9-日本脑炎病毒；10-高地J病毒；11-辛德毕斯病毒；12-III型登革热病毒；13-圣路易斯脑炎病毒；14-蚊子内对照；M-DL2000 DNA分子量标记。
具体实施例方式实施例1，样品RNA抽提
采集蚊子等吸血昆虫，加入 800 μ L TriPure Isolation Reagent (Roche, USA)，研磨至透明乳液，加入200 μ L氯仿，震荡60 s，然后于4°C，12000 r/min高速离心15 min，取 500 μ L上清，并加入等体积异丙醇室温静置30 min,同前离心15 min,弃去上清，用70%乙醇洗涤1次。RNA沉淀溶解于20 μ L无RNAse水。实施例2，反转录扩增(RT )反应
在冰上融化RT反应试剂及样品RNA，按下表体系配制反应液。表1.RT反应液配制
权利要求
1.用于虫媒性脑炎病毒检测的寡核苷酸引物，其特征在于包括12对病毒特异性引物、1对通用放大引物和1对蚊子内对照引物，它们的核苷酸序列如下 拉科鲁尼亚病毒上游引物SEQ NO. 1 ； 拉科鲁尼亚病毒下游引物SEQ NO. 2 ； 高地J病毒上游引物=SEQ NO. 3 ； 高地J病毒下游引物=SEQ NO. 4 ； Ockelbo病毒上游引物:SEQ NO. 5 ； Ockelbo病毒下游引物:SEQ NO. 6 ； III型登革热病毒上游引物SEQ NO. 7 ； III型登革热病毒下游引物SEQ NO. 8 ； 基孔肯雅热病毒上游引物SEQ NO. 9 ； 基孔肯雅热病毒下游引物SEQ NO. 10; 辛德毕斯病毒上游引物SEQ NO. 11 ； 辛德毕斯病毒下游引物SEQ NO. 12 ；东部型马脑脊齒直炎病·_上游引物= SEQN0.13东部型马脑脊齒直炎病·_下游引物= SEQNO.14西部型马脑脊齒直炎病·_上游引物= SEQNO.15西部型马脑脊齒直炎病·_下游引物= SEQNO.16委内瑞拉马脑脊髓炎病毒上游引物SEQ NO. 17 ； 委内瑞拉马脑脊髓炎病毒下游引物SEQ NO. 18 ； 日本脑炎病毒上游引物=SEQ NO. 19 ； 日本脑炎病毒下游引物SEQ NO. 20 ； 西尼罗河病毒上游引物SEQ NO. 21 ； 西尼罗河病毒下游引物SEQ NO. 22 ； 圣路易斯脑炎病毒上游引物SEQ N0. 23 ； 圣路易斯脑炎病毒下游引物SEQ N0. 24 ； 通用放大引物上游=SEQ N0. 25 ； 通用放大引物下游=SEQ N0. 26 ； 蚊子内对照引物上游=SEQ N0. 27 ； 蚊子内对照引物下游SEQ NO. 28。
2.权利要求1所述引物用于虫媒性脑炎病毒检测的检测方法，其特征在于包括反转录扩增、聚合酶链式反应扩增反应和产物的检测三个步骤；其中，所述反转录反应液含lx反转录缓冲液，0.5 mmol/L dNTP, 20U RNA酶抑制剂， 1 2U逆转录酶，12对病毒特异性下游引物的浓度均为0. 1 0. 5 μ mol/L, 100 500 ng样品RNA，按参数40 55°C，15 60 min, 85°C , 5 min进行反应；所述聚合酶链式反应扩增反应的检测反应液含有lx反应缓冲液，2. 0 5. 0 mmol/ L MgCl2, 200 400 μ mol/L dNTP, 2 3U耐热DNA聚合酶，12对病毒特异性引物的浓度均为0. 1 0. 3 μ mol/L，蚊子内对照引物上游和下游0. 1 0. 3 μ mol/L，通用放大引物上游和通用放大引物下游的浓度均为0. 4 1. 2 μ mol/L, 2. 5 5% DMS0，0. 2 0. 5mol/L 甜菜碱，2 5 μ L cDNA 反应条件为预变性95°C 5 min ；5 10个循环的预扩增94°C，30s ；45°C 55°C， 35s; 72 °C 60s 120s; 35 40 个循环94 °C，40s，55 °C 62 °C，40s，65 °C 72 °C，2 min 5 min ；补充延伸:72°C，10 min ；产物的检测用电泳系统对聚合酶链式反应扩增反应得到的产物进行分离和检测；根据所述产物的片段长度确定病毒类型。
3.根据权利要求2所述用于虫媒性脑炎病毒检测的检测方法，其特征在于所述 Ix 反转录缓冲液包含50 mmol/L Tris-Hcl, 75mmol/L KCl, L 5 5. Ommo 1/L MgCl2, lOmmol/L DTT。
4.根据权利要求2所述用于虫媒性脑炎病毒检测的检测方法，其特征在于所述Ix 反应缓冲液包含:500 mmol/L KCl, 100 mmol/L Tris-HCl, 1% Triton X-IOO0
5.根据权利要求2所述用于虫媒性脑炎病毒检测的检测方法，其特征在于所述产物的片段长度分别是拉科鲁尼亚病毒375 385 bp;东部型马脑脊髓炎病毒 352 362 bp ；高地J病毒3；35 ;345bp;Ockelbo 病毒315 325 bp;III型登革热病毒295 305 bp;西部型马脑脊髓炎病毒 282 四2 bp ；委内瑞拉马脑脊髓炎病毒 255 沈5 bp;辛德毕斯病毒235 M5 bp ；基孔肯雅热病毒215 225 bp;圣路易斯脑炎病毒194 204 bp ；西尼罗河病毒163 173 bp;日本脑炎病毒147 157 bp;蚊子内对照395 405 bp。
6.权利要求1所述的引物用于虫媒性脑炎病毒检测试剂盒制备的用途。
全文摘要
本发明涉及用于虫媒性脑炎病毒检测的寡核苷酸引物包括12对病毒特异性引物、1对通用放大引物和1对蚊子内对照引物，在检测的步骤中需要先对被测对象进行RT扩增反应再进行PCR扩增反应，放大被检测信号。利用电泳系统对扩增产物进行检测，通过分析扩增产物的片段长度，实现对12种病毒的快速检测和同步鉴定。本发明可以快速地实现对未知样品中是否携带上述12种虫媒性脑炎病毒进行检测和鉴定。检测灵敏度高，特异性强。本发明可以应用于出入境口岸、野外战场、圈舍、雨林、沼泽等不同环境下的蚊子等吸血昆虫进行高效的检测和病毒鉴定。
文档编号C12N15/11GK102399905SQ201110345440
公开日2012年4月4日 申请日期2011年11月4日 优先权日2011年11月4日
发明者李正国, 李贤良, 杨俊 , 王国民, 王昱, 肖进文 申请人:重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心, 重庆大学