专利名称：低甲基化基因f10的应用方法
技术领域：
本发明涉及低甲基化基因FlO在制备脑胶质瘤病人预后预测试剂中的应用。
背景技术：
表观遗传机制如启动子高/低甲基化、组蛋白修饰或非编码RNA的表达在肿瘤的形成过程中发挥着非常重要的功能。DNA甲基化状态的改变时肿瘤发生发展的重要标志。具有促瘤功能的基因甲基化水平降低而高表达，从而促进多种肿瘤的发生，其中包括胶质瘤。脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤，虽然采取了综合治疗及一些新的治疗手段，其预后仍不理想。一项2010年的统计显示，在美国75%的胶质瘤患者在确诊后 5年内死亡。而胶质瘤母细胞瘤的预后更差，一项针对320例胶质母细胞瘤病人的生存分析显示总生存时间为12. 3个月，其中91例再次接受手术的病人总生存时间中位数为18. 9 个月，而未再次手术的患者总生存时间中位数为9. 7个月。因此，迫切需要找寻出诊断胶质瘤、判断预后的分子标志物，为提高胶质瘤患者生存率的研究提供依据。FlO 基因(coagulation factor X)定位于染色体 13q34，GeneBank 登录号 NM_000504。FlO基因编码凝血级联中维生素K依赖的凝血因子X(FX)。FX蛋白的双链通过二硫键结合，轻链携带2个EGF样结构域，重链含具有催化功能的结构域，这个结构域与一些有止血功能的丝氨酸蛋白酶在结构上具有同源性。成熟的FX受FDCa剪切而活化(内源性凝血通路)，或者通过FVIIa激活(外源性凝血级联)而成为FXa，继而激活下游通路参与调节凝血功能。目前，有研究者观察了 Ffe在肿瘤细胞迁移中的功能。但是对于FlO基因在胶质瘤中的表达及功能尚未见报道。申请人用免疫组织化学法检测FlO基因编码的蛋白 FX在正常脑组织及脑胶质瘤组织中的表达，结果显示FX在胶质瘤中表达增加(ρ <0. 05, 图1)，而各级别胶质瘤组织中FX的表达无差异(ρ > 0. 05)。亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)证实，FlO基因在胶质瘤中发生低甲基化(ρ <0.01)。然后用SPSS 13.0软件对FX蛋白表达与FlO基因低甲基化进行相关性分析，结果表明两者间存在相关性(ρ <0. 05)，说明表观遗传学可能参与了 FlO基因的表达调控。目前用于检测甲基化状态的方法有亚硫酸氢盐测序PCR法(BSP)、焦磷酸测序、甲基化特异性PCR等，但是利用亚硫酸氢盐测序PCR法分析所获得的肿瘤特异性甲基化状态， 是甲基化分析的金标准，它能明确所测区域每一个CG位点的甲基化状态。
发明内容
本发明的目的是提供一种低甲基化基因FlO的应用方法，对于脑胶质瘤的预后预测具有重要意义。低甲基化基因FlO用于制备脑胶质瘤诊断、预测、检测或筛查制剂；特别是用于制备脑胶质瘤诊断、预测、检测或筛查的试剂盒。如用于制备亚硫酸氢盐直接测序法预测脑胶质瘤的制剂；所述的制剂中包括 根据FlO基因转录起始位点上游CpG岛设计的，采用亚硫酸氢盐直接测序法的引物序列为F 5' TTTATTTTTATGTATTAGGGGGTGAG 3‘，R 5' TACAAACAATCCTAAATCATCAACC 3‘。一种用于人脑胶质瘤预后预测的FlO基因转录起始位点上游CpG岛甲基化检测试剂盒，包括以下引物F 5' TTTATTTTTATGTATTAGGGGGTGAG 3‘，R 5' TACAAACAATCCTAAATCATCAACC 3‘。申请人:发现FlO基因编码的蛋白FX在脑胶质瘤组织中表达上调(图1)。FlO转录起始位点上游存在CpG岛(图2)，该CpG岛中CG位点在正常的脑组织中均处于高甲基化状态，而在FX表达上调的脑胶质瘤组织中其甲基化程度降低(部分结果见图3)。FlO低甲基化的胶质瘤病人总生存率明显低于高甲基化的病人(图4)，提示FlO基因是胶质瘤中的低甲基化基因，是预测胶质瘤预后的分子标志。本发明为脑胶质瘤预后预测提供了强有力的分子生物学基础，具有深远的临床意义和推广性。
图IFX蛋白在正常脑组织及不同病理分级胶质瘤中的表达；A 正常脑组织；B 胶质瘤WHO I级；C 胶质瘤WHO II级；D 胶质瘤WHO III级； E 胶质瘤WHO IV级；图2F10基因转录起始位点上游_4490bp至_4110bp为一 CpG岛；浅蓝色区域为CpG岛，横坐标下红色竖线表示CG位点；图!3BSP检测正常脑组织和胶质瘤组织中FlO基因启动子区甲基化状态；图中所示为部分结果，N2 第2例正常脑组织；N4 第4例正常脑组织；N6 第6例正常脑组织；Tll 第9例胶质瘤组织；T16 第12例胶质瘤组织；T23 第23例胶质瘤组织。 〇表示非甲基化位点， 表示甲基化位点，每一行表示一个克隆中所有CG位点的甲基化状态，计算5个克隆中的非甲基化位点比率进行比较。结果表明，正常脑组织中FlO基因转录起始位点上游CpG岛为高甲基化状态，而胶质瘤组织中该区域发生低甲基化；图4F10基因低甲基化与胶质瘤病人预后的关系。绿色曲线表示FlO基因甲基化的胶质瘤病人的生存状况及时间，蓝色曲线表示 FlO基因低甲基化的胶质瘤病人的生存状况及时间。用SPSS 13.0软件进行Kaplan-Meier 检验，差异有统计学意义(P = 0. 00 ，说明FlO基因低甲基化的病人预后较高甲基化的病人差。
具体实施例方式以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。实施例1 Methl primer express软件和在线软件Methprimer分析FlO转录起始位点上游5000bp区域，结果显示在这一区域存在CpG岛，设计并合成FlO基因转录起始位点上游CpG岛的甲基化引物，F :5 ‘ TTTATTTTTATGTATTAGGGGGTGAG 3 ‘ , R 5' TACAAACAATCCTAAATCATCAACC 3'。对10例正常脑组织进行经亚硫酸盐处理后的基因组测序(BSP)，发现FlO基因转录起始位点上游CpG岛在正常的脑组织均处于甲基化状态。 同时对不同级别脑胶质瘤组织标本(I级14例，II级48例，III级28例，IV级12例)96 例，进行了 FlO基因甲基化状态的检测，发现82. 3%的脑胶质瘤组织中FlO基因发生低甲基化，与正常脑组织比较，差异有统计学意义(P < 0.05)，各级胶质瘤的FlO基因甲基化水平没有明显的差异(ρ >0.05)。FlO基因低甲基化的病人预后较甲基化病人的差，差异有统计学意义(？ = 0.00幻。以上研究结果提示，FlO基因是一个新发现的脑胶质瘤甲基化基因，是一个胶质瘤预后预测标志。操作步骤(一 )亚硫酸氢盐修饰样品gDNA制备选择已商品化的亚硫酸氢盐修饰试剂盒。( 二)亚硫酸氢盐直接测序PCR (BSP)试剂盒的使用内容该试剂盒包括用于检测FlO基因甲基化的PCR引物F 5' TTTATTTTTATGTATTAGGGGGTGAG 3‘，R 5' TACAAACAATCCTAAATCATCAACC 3‘。PCR扩增体系(_20°C保存)。原理利用甲基化引物进行PCR扩增FlO基因转录起始位点上游CpG岛。步骤1取经亚硫酸氢盐修饰后的样品gDNA 4μ 1(总量约lOOng)，加入含甲基化引物 2 μ 1 的 PCR 扩增体系(5O μ 1)，使用 Takara 公司的 EmeraldAmpTM PCR Master Mix (含 DNA 聚合酶、缓冲液及dNTP混合物)进行扩增。PCR扩增体系为
权利要求
1.低甲基化基因FlO的应用方法，其特征在于，所述的低甲基化基因FlO用于制备脑胶质瘤诊断、预测、检测或筛查制剂。
2.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述的低甲基化基因FlO用于制备脑胶质瘤诊断、预测、检测或筛查的试剂盒。
3.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述的低甲基化基因FlO用于制备亚硫酸氢盐直接测序法预测脑胶质瘤的制剂。
4.根据权利要求1或3所述的应用方法，其特征在于，所述的制剂中包括根据FlO基因转录起始位点上游CpG岛设计的，采用亚硫酸氢盐直接测序法的引物序列为F 5' TTTATTTTTATGTATTAGGGGGTGAG 3‘， R 5' TACAAACAATCCTAAATCATCAACC 3‘。
5.一种用于人脑胶质瘤预后预测的FlO基因转录起始位点上游甲基化检测试剂盒，其特征在于，包括以下引物F 5' TTTATTTTTATGTATTAGGGGGTGAG 3‘， R 5' TACAAACAATCCTAAATCATCAACC 3‘。
全文摘要
本发明涉及低甲基化基因F10的应用，即用于制备脑胶质瘤诊断、预测、检测或筛查制剂。特别是用于制备亚硫酸氢盐直接测序法预测脑胶质瘤预后的制剂。通过研究证实F10在胶质瘤组织中因发生低甲基化而高表达，将检测F10基因低甲基化应用于胶质瘤预后预测，为预测胶质瘤病人的预后提供强有力的分子生物学依据，具有深远的临床意义和推广性。
文档编号C12Q1/68GK102337346SQ20111034654
公开日2012年2月1日 申请日期2011年11月4日 优先权日2011年11月4日
发明者余志斌, 刘晓萍, 卞艳慧, 唐海林, 李桂源, 武明花, 王泽友 申请人:中南大学