专利名称：鉴别发虫草的特征性核苷酸序列及其探针和方法
技术领域：
本发明属于利用分子生物学方法检测中药材真伪的技术领域，具体涉及用于鉴别发虫草(Ophiocordyc印S crinalis)的特征性核苷酸序列以及核酸分子探针和鉴别发虫草的方法。
背景技术：
发虫草(Ophiocordyc印s crinalis)是属于广义虫草属(Cordyceps s. 1.)的一种虫生真菌，该属真菌还包括冬虫夏草(Ophiocordyc印s sinensis)和蛹虫草(Cordyceps militaris)。野生冬虫夏草是中国传统中药，具有保肺肾、补精髓、化痰止劳咳的作用，能够调节免疫功能，增强人体抵抗力。目前由于大量的采挖已经造成野生资源不足，价格大幅上张。目前，仍然无法实现冬虫夏草子实体的人工栽培，而其菌丝体培养也需要低温长期发酵，成本过高。发虫草与冬虫夏草在亲缘关系上极为接近，与其具有相似的功能，具有开发为虫草新产品的价值。因此可以快速而准确的鉴别发虫草子实体以及相关制品真伪的方法和技术对于发虫草生产相关企业以及相关检验机构将具有重要的意义。DNA是生物储存遗传信息的物质，每个生物物种乃至个体均具有独特的特征性核苷酸序列，可以作为该生物物种或个体区别于其他物种或个体的标志。DNA是细胞生物的基本组成部分，作为遗传信息的载体，具有一定的稳定性，不会受表型的影响而改变，是用来鉴别物种、个体的可靠依据。通过生物信息学的分析可以找到不同物种或个体的特征性核苷酸序列，利用分子生物学的手段对该序列进行探测即可快速、准确的对物种或个体进行鉴别。发明人已申请并获授权两项鉴别尖头虫草及蜂头虫草的核苷酸特征性序列的专利， 目前未见与发虫草相关的核苷酸特征性序列的专利。
发明内容
本发明的第一个目的是提供来源于发虫草(Ophiocordyc印s crinalis)核糖体 rRNA内转录间隔区以及5.8S rRNA基因，用于鉴别发虫草的特征性核苷酸序列，其序列如 SEQ ID NO. 1 所示。本发明提供的利用分子生物学手段鉴别发虫草的特征性核苷酸序列来源于发虫草核糖体rRNA内转录间隔区以及5. 8S rRNA基因(核糖体rRNA内转录间隔区以及5. 8S rRNA基因合并简称ITS区)，其序列如SEQ ID NO. 1所示，所在位置以及特征见图1，该序列包含发虫草的ITSl、5. 8S rDNA以及ITS2的序列。该序列可通过实施例1所述的方法获得，亦可通过人工合成的方法在商业化的DNA合成仪器上按照发明人提供的核苷酸序列合成。本发明以上述发虫草的特征性核苷酸序列(如SEQ ID NO. 1所示)为模板而设计得到全长序列或不少于16个核苷酸组成的寡核苷酸序列，以及在上述全长序列或寡核苷酸序列的基础上经修饰、加工、变化而获得核苷酸序列，也包括在上述全长序列或寡核苷酸序列的基础上在5’端添加或改变10个核苷酸以下或改变原有核苷酸序列数量小于10%以及3’端6个核苷酸改变不足1个核苷酸的核苷酸序列作为发虫草鉴定的专一性核苷酸分子探针。上述序列可通过DNA自动合成仪等DNA合成装置按照设计好的顺序合成而获得， 并可以通过酶、同位素、生物素、化学荧光素、荧光剂等方式进行标记。因此本发明的第二个目的是提供一种针对上述ITS区的如SEQ ID NO. 1所示的序列的发虫草专一性核苷酸分子探针，其特征在于，该发虫草专一性核苷酸分子探针包括 Probe I :5，-GACCCAGACCCCGCTGTC-3，(序列如 SEQ ID NO. 2 所示)和 Probe II 5‘ -CATTTCGCTGCGTTCTTCATCG-3‘(序列如SEQ ID NO. 3所示)。进一步优选，所述的发虫草专一性核苷酸分子探针还包括 Probe III :5’ -TCAGCGTCCG CAAGCAGAAATGAATCA-3，(序列如SEQ ID NO. 4所示)。该序列经荧光标记后可作为Taqman探针用以鉴定发虫草。Probe I> Probe II, Probe III的具体位置见图2，这些序列样适用于上述修饰、加工与变化、添加酶切位点、改变部分核苷酸序列以及标记等操作。本发明提供的上述发虫草专一性核苷酸分子探针Probe I和ftx)be II具有极高的专一性，可以与发虫草发生专一性的反应而不与其他种类的虫草或其他真菌发生反应。 利用上述探针通过PCR的方法或核酸杂交的方法可以快速的对发虫草及相关制品进行检测。本发明的第三个目的是提供一种用于鉴别发虫草的试剂盒，其特征在于，包括发虫草专一性核苷酸分子探针Probe 1:5’ -GACCCAGACCCCGCTGTC-3，和 Probe 11 5，-CATTTCGCTGCGTTCTTCATCG-3，和 PCR 常规反应试剂。所述的用于鉴别发虫草的试剂盒，优选还含有虫草属核糖体rRNA内转录间隔区通用引物 CorF :5，-CGTTGGTGAACCAGCGGAGGGAT-3，和 CorR 5’ -TTGCCGCTTCACTCGCCGTTACT-3’。以此引物对的扩增产物作为阳性对照。所述的用于鉴别发虫草的试剂盒，优选还含有ftx)be III :5’ -TCAGCGTCCG CAAGCAGAAATGAATCA-3’。ftx)be III经过荧光标记后，可以作为iTaqman探针，利用荧光定量 PCR仪可实时的检测样品中是否存在发虫草。本发明的第四个目的是提供一种用于鉴别发虫草的方法，其特征在于，是以发虫草专一性核苷酸分子探针Probe 1:5’ -GACCCAGACCCCGCTGTC-3，和 Probe 11 5’ -CATTTCGCTGCGTTCTTCATCG-3’作为引物，利用PCR的方法或者核酸杂交的方法或荧光定量PCR的方法鉴定发虫草。所述的用荧光定量PCR的方法鉴定发虫草，优选以ftObe III :5’ -TCAGCGTCCG CAAGCAGAAATGAATCA-3，标记荧光后，作为 Taqman 探针。所述的PCR的方法鉴定发虫草，优选以虫草属核糖体rRNA内转录间隔区通用弓I 物 CorF 5' -CGTTGGTGAACCAGCGGAGGGAT-3，(如 SEQ ID N0. 5 所示)禾口 CorR 5，-TTGCCGCTTCACTCGCCGTTACT-3，(如SEQ ID N0. 6所示)的扩增产物作为阳性对照。荧光定量PCR法采用前面所述的发虫草专一性的核酸分子探针ftObe I及ftObe II作为扩增引物，Probe III标记荧光后作为Taqman探针，利用荧光定量PCR仪可实时的检测样品中是否存在发虫草。具体步骤和过程按照常规分子生物学方法进行。核酸分子杂交法采用前面所述的发虫草专一性的核酸分子探针，通过核酸分子杂交的方式(例如Southern杂交或点杂交)对发虫草及相关制品进行鉴定。具体步骤和过程按照常规的分子生物学方法进行。其中，发虫草及相关制品可以直接进行检测也可以先进行DNA的提取与扩增后再进行检测。PCR方法采用前面所述的发虫草专一性的核酸分子探针ftObe I及ftObe II作为一组PCR引物，以如前所述虫草菌ITS区通用引物CorF及CorR作为阳性对照组的PCR引物，分别利用上述两组引物按照常规的PCR方法扩增待测样品，两者均能扩增到特异性DNA 片段的样品即为发虫草，其中利用I及II获得的DNA片断长为109bp，利用 CorF及CorR获得的DNA片断长为530bp左右。仅虫草菌ITS通用引物CorF及CorR能够得到特异性片段而本发明提供的发虫草专一性的核酸分子探针组成的PCR引物I及 Probe II不能扩增到特异性DNA片段的样品则不是发虫草样品。其中，PCR反应可以利用本发明所述的试剂盒中的试剂或按照常规的分子生物学方法提取的发虫草样品总DNA作为模板，也可以直接挑取少量的发虫草样品加入PCR反应体系作为模板。本发明的发虫草专一性核苷酸分子探针Probe I和ftx)be II具有极高的专一性，可以与发虫草发生专一性的反应而不与其他种类的虫草或其他真菌发生反应。利用上述探针通过PCR的方法或核酸杂交或荧光定量PCR的方法可以快速的对发虫草及相关制品进行检测。本发明由于有采用DNA序列作为检测标记，因此可以准确、快速的检测未知样品是否为或含有发虫草，其中样品可以为子实体、其粉碎加工产品及包含有发虫草的中成药制剂、保健品。采用PCR方法检测时，所需样品量极少，方法简单，半天内可完成检测。
图1是核糖体rRNA基因结构示意图，其中标示为ITS区的范围为本发明涉及的 DNA序列，即核糖体rRNA内转录间隔区ITSl和ITS2以及5. 8S rRNA基因；图2是本发明所述的发虫草特征性核苷酸序列全序列以及用于鉴定发虫草的两个发虫草专一性核苷酸分子探针ftObe I.Probe II及ftx)be III的位置图，该图显示ITS区正链序列，左侧为5’端，右侧为3’端，其中加粗及下划线部分分别为ftObe I(77bp-94bp， 位于正链上)、ProbeII (163bp_185bp，位于负链上)及Probe III (103bp_129bp，位于正链上)；图3是实施例3中的PCR反应结果示意图，其中1，2为蛹虫草；3，4为戴氏虫草； 5，6为冬虫夏草；7，8为蜂头虫草；9，10为球孢白僵菌，11，12为连州虫草；13，14为发虫草， M为DNA分子量标准；图4是实施例4中的PCR反应结果示意图，其中1，2为蛹虫草；3，4为戴氏虫草； 5，6为冬虫夏草；7，8为蜂头虫草；9，10为球孢白僵菌，11，12为连州虫草；13，14为发虫草， M为DNA分子量标准。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例1 发虫草rRNA内转录间隔区以及5. 8S rRNA基因(ITS区的序列)的制备取发虫草样品0. 1-0. 5g，液氮中研磨成粉，加入300 μ 1尿素提取液(SDS 1.5%, 尿素 7mol/L, Tris-HCl ρΗ8· 00. 05mol/L, NaCl 0. 5mol/L)，移入 1. 5ml 微型离心管中，在液氮中冷却，迅速移到65°C融化。反复冻融3 5次后，加入等体积的酚氯仿异戊醇05 24 1)，震荡，13000r/min离心lOmin，上清移入新管中加入等体积氯仿异戊醇04 1)，震荡，13000r/min离心lOmin，上清移入新管中加入微量foiase A，37°C保温30min，加入3倍体积无水乙醇，3M NaAc (pH5. 2)，_20°C放置至少30min后，13000rpm 离心15min，回收DNA沉淀，用70%乙醇和无水乙醇洗涤，抽干或风干，每管加入50ul TE (1 OOmmo 1/L Tris-Cl, 10mmol/L EDTA，ρΗ8· 0)回溶，获得总 DNA。取0.2ml PCR管一支，加入20ul PCR反应液(包括IOxPCR缓冲液2ul，引物CorF、 CorR各40ng，2mmol/L dNTP lul，Taq酶1个单位，加超纯水至20ul)，加入0. 5ul发虫草总 DNA提取液，闭紧管盖，置于PCR仪上按以下程序进行PCR反应94°C预变性:3min，然后93°C 变性lmin，55°C复性lmin，72°C延伸2min，共30个循环，最后72°C延伸lOmin。反应完成后利用商业化的纯化试剂盒进行产物的纯化并直接在DNA测序仪上测序。获得核苷酸序列除去18S rRNA基因以及观3 rRNA基因序列后所得到的序列即为发虫草rRNA内转录间隔区以及5. 8S rRNA基因的序列，其序列如SEQ ID NO. 1所示。实施例2 发虫草专一性探针(引物):Probe I，Probe II及ProbeIII的制备将发虫草的ITS区序列与其他虫草菌的同源序列进行比较，获得最适于鉴别发虫草寡核苷酸片段组成与排列顺序，即ftObe I, Probe II及ftx)be III，如图2所示，Probe I位置为77bp-94bp，位于正链上；Probe II位置为163bp_185bp，位于负链上；Probe III 位置为103bp-129bp，位于正链上。根据ftx)be I,Probe II及ftx)be III的核苷酸排列和组成可以在商业化的DNA合成仪上通过化学合成的方法合成ftObe I (如SEQ ID NO. 2所示)，Probe II (如 SEQ ID NO. 3 所示)及 Probe III (如 SEQ ID NO. 4 所示)，即可用作专一性PCR引物。再此基础上，可以利用常规的分子生物学方法利用酶、同位素、生物素、化学荧光素、荧光剂等对I^robe I及II进行标记，即可用做杂交用探针。将ftx)be III 根据Taqman探针法进行荧光及淬灭基团的标记即可利用其作为Taqman探针进行荧光定量 PCR。实施例3:鉴定发虫草的正对照试验本试验用以确定DNA样品符合PCR要求可获得特异性PCR产物。方法1 总DNA提取参照实施例1进行，对不同的样品(蛹虫草，戴氏虫草，冬虫夏草，蜂头虫草，球孢白僵菌，连州虫草，发虫草)分别提取DNA，再进行PCR扩增。各个样品的PCR反应体系为:20ul PCR反应液(包括IOxPCR缓冲液2ul，引物CorF、CorR各40ng, 2mmol/L dNTP lul, Taq酶1个单位，加超纯水至20ul)，加入0. 5ul各个样品的总DNA提取液，闭紧管盖，置于PCR仪上按以下程序进行PCR反应94°C预变性3min，然后93°C变性 lmin，55°C复性lmin，72°C延伸2min，共30个循环，最后72°C延伸IOmin0扩增的产物在 2%的含有DNA染料的琼脂糖凝胶上进行电泳，在适当的紫外光源下查看以及拍照。方法2 用牙签直接挑取适量的各个样品(粉碎子实体、粉碎的相关制品)(蛹虫草，戴氏虫草，冬虫夏草，蜂头虫草，球孢白僵菌，连州虫草，发虫草)在装20ul超纯水的 0. 2ml PCR管种搅动，并分别稀至0. 1倍以及0.01倍，取2ul上述三个浓度的样品悬浊液加入含有 20ul PCR 反应液(包括 IOxPCR 缓冲液 2ul，引物 CorF、CorR 各 40ng，2mmol/L dNTP lul，Taq酶1个单位，加超纯水至20ul)的0. ^il PCR管中，充分混勻闭紧管盖，全部PCR管置于PCR仪上进行如下PCR反应94°C预变性:3min，然后93°C变性lmin，6(TC复性lmin， 72°C延伸anin，共30个循环，最后72°C延伸lOmin。扩增的产物在2 %的含有DNA着色剂的琼脂糖凝胶上进行电泳，在适当的紫外光源下查看以及拍照。图3为按方法1进行的实验结果，显示七种虫草(1，2为蛹虫草；3，4为戴氏虫草； 5，6为冬虫夏草；7，8为蜂头虫草；9，10为球孢白僵菌，11，12为连州虫草；13，14为发虫草) 均可正常的扩增得到ITS区DNA特异性片段，该结果表明五种待测虫草提取的总DNA符合 PCR扩增的要求，可以用作专一性检测的待测样品。实施例4 发虫草专一性鉴别用以从符合PCR要求的样品中专一性的扩增发虫草，从而鉴别发虫草。方法1 使用实施例3中符合PCR反应要求的样品，以这些样品的总DNA作为模板， 参照实施例1中方法进行PCR扩增，其中引物替换为ftObe I及ftObe II，反应条件为94°C 预变性3min，然后93 °C变性lmin，6(TC复性lmin，72°C延伸2min，共30个循环，最后72 °C 延伸lOmin。扩增的产物在2%的含有DNA染料的琼脂糖凝胶上进行电泳，在适当紫外的光源下查看以及拍照。方法2 使用实施例3中符合PCR反应要求的样品悬浊液如实施例3中方法2所述进行PCR反应，其中引物替换为ftObe I及ftObe II，反应条件为94°C预变性;3min，然后 93°C变性lmin，60°C复性lmin，72°C延伸2min，共30个循环，最后72°C延伸IOmin0扩增的产物在2%的含有DNA染料的琼脂糖凝胶上进行电泳，在适当的紫外光源下查看以及拍照。图4为按方法1进行的实验结果，显示七种虫草(1，2为蛹虫草；3，4为戴氏虫草； 5,6为冬虫夏草；7，8为蜂头虫草；9，10为球孢白僵菌，11，12为连州虫草；13，14为发虫草)，其中只有发虫草被专一性的扩增获得109bp左右的特异性DNA片段，而其他虫草均无特异性DNA片段被扩增，该结果表明，发虫草专一性探针(引物)Probe I及ftx)be II可以从多种虫草中准确的鉴别出发虫草，同时根据实施例3排除了假阴性(不符合PCR扩增条件而造成的阴性结果)的可能。
权利要求
1.一种用于鉴别发虫草(Ophiocordyc印S crinalis)的特征性核苷酸序列，其特征在于，其序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一种用于鉴别发虫草的发虫草专一性核苷酸分子探针，其特征在于，该发虫草专一性核苷酸分子探针包括 Probe 1:5，-GACCCAGACCCCGCTGTC-3，和 Probe II 5’ -CATTTCGCTGCGTTCTTCATCG-3’。
3.根据权利要求2所述的发虫草专一性核苷酸分子探针，其特征在于，所述的发虫草专一性核苷酸分子探针还包括 Probe III :5’ -TCAGCGTCCG CAAGCAGAAATGAATCA-3’。
4.一种用于鉴别发虫草的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的发虫草专一性核苷酸分子探针Probe I :5，-GACCCAGACCCCGCTGTC-3，和 Probe II 5，-CATTTCGCTGCGTTCTTCATCG-3，和 PCR 常规反应试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还含有虫草属核糖体 rRNA 内转录间隔区通用引物 CorF :5，-CGTTGGTGAACCAGCGGAGGGAT-3，和 CorR 5， -TTGCCGCTTCACTCGCCGTTACT-3，。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还含有III5'-TCAGC GTCCGCAAGCAGAAATGAATCA-3，。
7.一种用于鉴别发虫草的方法，其特征在于，是以权利要求2所述的发虫草专一性核苷酸分子探针Probe I :5，-GACCCAGACCCCGCTGTC-3，和 Probe II 5’ -CATTTCGCTGCGTTCTTCATCG-3’作为引物，利用PCR的方法或者核酸杂交的方法或荧光定量PCR的方法鉴定发虫草。
8.根据权利要求7所述的用于鉴别发虫草的方法，其特征在于，所述的用荧光定量PCR 的方法鉴定发虫草，是以Probe III :5，-TCAGCGTCCG CAAGCAGAAATGAATCA-3，标记荧光基团后作为iTaqman探针再进行荧光定量PCR。
9.根据权利要求7所述的用于鉴别发虫草的方法，其特征在于，所述的用 PCR的方法鉴定发虫草，还以虫草属核糖体rRNA内转录间隔区通用引物CorF 5，-CGTTGGTGAACCAGCGGAGGGAT-3，和 CorR :5，-TTGCCGCTTCACTCGCCGTTACT-3，的扩增产物作为阳性对照。
全文摘要
本发明公开了一种鉴别发虫草的特征性核苷酸序列及其探针和方法。所述的用于鉴定发虫草(Ophiocordyceps crinalis)的特征性核苷酸序列来自发虫草核糖体rRNA内转录间隔区，其序列如SEQ ID NO.1所示。以此特征性核苷酸序列为基础上设计的核酸分子探针Probe I(如SEQ ID NO.2所示)和Probe II(如SEQ ID NO.3所示)，以及包含该核酸分子探针的鉴定试剂盒，以及利用该探针通过PCR、核酸杂交或荧光定量PCR鉴别发虫草的方法。利用本发明，可以方便、快速、准确的进行发虫草及相关的制品的快速鉴定，本发明使用分子生物学手段排除了鉴定中的人为影响、鉴定结果客观准确，鉴定时间短，半天即可完成。
文档编号C12Q1/68GK102337347SQ20111034659
公开日2012年2月1日 申请日期2011年11月4日 优先权日2011年11月4日
发明者李浩华, 潘清灵, 王磊, 章卫民, 陈玉蝉 申请人:广东省微生物研究所