特性改善的内切葡聚糖酶的制作方法

特性改善的内切葡聚糖酶的制作方法
【专利摘要】本发明涉及热稳定性内切葡聚糖酶，具体地，涉及包括与SEQ.ID NO.:2具有至少96％的同一性的氨基酸序列的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质，以及属于GH7类并表现出活性热稳定化的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质。
【专利说明】特性改善的内切葡聚糖酶

【背景技术】
[0001] 纤维素是植物材料的主要成分。它是植物结构完整性的基础，并且常常发现于由 纤维素、半纤维素和木质素组成的木质纤维素基质中。采用纤维素的应用利用其结构上的 特性（纤维、纺织品、纸等）或者其碳水化合物性质，产生D-葡萄糖、纤维二糖和/或纤维 素低聚物。
[0002] 木质纤维素很容易获自农业和林业，包括来自谷类、玉米、甘蔗、甜菜、木材等的副 产品流。在不久的将来，对于其木质纤维素含量和产率经过优化的植物（"能源作物"）将 可能作为重要的资源作出贡献。
[0003] 纤维素酶包括在结构上和功能上不同种类的作用于纤维素的糖原水解酶。纤维素 酶发现于细菌、古细菌（archea)、真菌和植物中。其对于在纤维素聚合物或低聚物中存在的 糖苷键具有共同的水解切割活性，在底物特异性、作用方式和包括持续性（processivity)、 pH和温度最适条件的酶参数方面有所不同。大多数纤维素酶作用于两个葡萄糖部分之间 的3-1，4-键。但是，木质纤维素中发现的其他键也可以被水解。纤维素酶可以通过其作 用方式细分成内切酶（endo-enzyme)和外切酶（exo-enzyme)。内切葡聚糖酶向纤维素聚合 物中引入随机切割，从而降低聚合度。外切酶例如纤维二糖水解酶以连续作用方式工作，从 聚合物的还原或非还原端释放出纤维二糖（D-葡萄糖-0 -1，4-D-吡喃葡糖苷）。
[0004] 其中 CAZY 数据库[Cantarel BL, Coutinho PM, Rancurel C, Bernard T, Lombard V, Henrissat B (2009)The Carbohydrate-Active EnZymes database(CAZy) :an expert resource for Glycogenomics.(碳水化合物活性酶数据库（CAZy):糖基因组学专业资源） Nucleic Acids Res 37:D233-238PMID: 18838391]保存有大量已知的葡糖水解酶包括纤维 素降解酶（即纤维素酶）。在该数据库中，根据结构元素将酶分类成不同的GH-种类。若 干GH种类包括内切葡聚糖酶，具体地，类别GH5、GH7、GH9、GH12、GH16、GH45、GH48、GH61和 GH74。尽管一些GH种类中具有高度的多样性，一个GH种类的成员常常具有类似的物理和 酶参数。这使得对于某个GH种类的成员来说可能进行概述，例如底物特异性、pH范围、稳 定性或催化效率。
[0005] 降解纤维素的微生物常常产生和分泌纤维素酶的复杂混合物。例如，在里氏木 霉（Trichoderma reesei)的分泌蛋白质组（secretome)中，7种内切葡聚糖酶已经鉴别 为属于 6 个不同的 GH 种类（Cel5A、Cel7B、Cell2A、Cel45A、Cel61A、Cel61B、Cel74A)。不 同的内切葡聚糖酶表现出一特性范围（Karlsson J, Siika-aho M, Tenkanen M, Tjerneld F. Enzymatic properties of thelow molecular mass endoglucanases Cell2A(EG III) and Cel45A(EG V)ofTrichoderma reesei.(里氏木霉的低分子量内切葡聚糖酶Cell2A(EG III)和 Cel45A(EG V)的酶特性）J Biotechnol.20020ct 9;99(l):63-78.PubMed PMID: 12 ；Karlsson J, Momcilovic D, ffittgren B, Schiilein M, Tjerneld F, Brinkmalm G. Enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose hydrolyzed by the endoglucanasesCel5A, Cel7B, and Cel45A from Humicola insolens and Cel7B, Cell2A and Cel45Acore from Trichoderma reesei.(通过来自特异腐质霉的内切葡聚糖酶 Cel5A、Cel7B和Cel45A和来自里氏木霉的Cel7B、Cell2A进而Cel45Acore水解的羧甲基 纤维素的酶降解）Biopolymers. 2002Jan ;63(1) : 32-40. PubMed PMID: 11754346.)。人们认 为两种主要的内切葡聚糖酶EGI(Cel7B，GH7)和EGII(Cel5A)是其活性最强的酶。
[0006] 纤维素分解酶的协同活性使得可以有效地破坏复杂底物（B. Henrissat, H. Driguez, C. Viet&M. Schiilein:Synergism of Cellulases from Trichoderma reesei in the Degradation of Cellulose (在纤维素降解中来自里氏木霉的纤维素酶的协同作用）； Nature Biotechnology 3, 722-726 (1985) doi: 10. 1038/nbt0885-722)，并且阻止了在水解 效率需要同时保持在最高水平时一结构种类的组分被来自二重的酶所置换（不同EG的不 等价性）。被另一 GH种类的酶简单置换不总是可能的。通常来说，与GH7家族的内切葡聚 糖酶相比较，来自GH5家族的内切葡聚糖酶成员（包括来自嗜热菌的EG)表现出更高的热 稳定性；然而，热稳定性GH7家族蛋白质的应用常常因其高水解速率而具有优势。
[0007] 报道了许多内切葡聚糖酶的应用，一部分复杂酶混合物报道为单一的酶活性。纤 维素酶对于制造纤维素衍生的生物燃料来说非常重要。在切割之后，任选地，进行化学和/ 或物理处理，将木质纤维素与纤维素酶一起孵育，以释放出糖单体，对其进行进一步处理。 需要对处理条件进行调适，以使水解速率、产率和/或稳定性最优化。在这些处理中，较高 的温度常常是优选的，但这需要热稳定性更高的酶。同时糖化和水解（SSF)处理要求在发 酵条件下有活性的纤维素分解酶。联合生物处理（CBP)进一步要求酶特性的组合，以便在 单一步骤中完成酶产生、糖化和发酵。
[0008] 内切葡聚糖酶的其他应用仅致力于纤维素纤维的部分水解或修饰（纤维修饰、生 物抛光、生物石磨（Stoning)等）。因此，所用的内切葡聚糖酶需要在升高的温度、极端（例 如碱性、酸性）pH和化学条件（例如，洗衣、清洁剂、蛋白酶、溶剂等）下工作和/或稳定。对 于这些应用，纤维损伤必须得以最小化。内切葡聚糖酶还可以在制浆过程中（纸浆和纸的 制造）有助于从纤维材料中分离出非纤维素部分，或者改善工艺物料流的流变学。洗涤剂 稳定性和蛋白酶耐性可以视作是酶结构稳定性增加的结果，这也是与热稳定增加有关的特 性。内切葡聚糖酶还可以在食品和饲料加工（啤酒厂、葡糖酒制造、自滤饼回收油、烘焙、面 团制备）中加以应用。灭菌或巴氏杀菌常常要求更高的温度。对于缩短处理时间来说，内 切葡聚糖酶的操作稳定性是有利的。
[0009] 来自木霉（Trichoderma)属的真菌（无性型肉座菌（anamorph Hypocrea))的内 切葡聚糖酶I蛋白质（Cel7B)表现出高度的同一性，被视作是嗜中温的。来自GH家族7的 内切葡聚糖酶中最稳定的成员据报道是来自特异腐质霉（Cel7B)和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum)(egl)的天然酶（US5912157)。根据该报道，EGI在60°C以上不表现活性。因 此，在该领域对于提供热稳定性更高的来自GH家族7的内切葡聚糖酶存在需求。
[0010] 据报道，一些内切葡聚糖酶可以在较高的温度下被热灭活Oorninguez JM, Acebal C, Jimenez J, de la Mata I, Macarron R, Castillon MP. Mechanisms of thermoinactivation of endoglucanase I from Trichoderma reesei QM 9414.(来 自里氏木霉QM 9414的内切葡聚糖酶I的热灭活机制）Biochem J. 19920ct 15;287(Pt 2) :583-8.)。所述研究的作者还尝试了对热灭活的内切葡聚糖酶的再活化，但这要求 涉及8M尿素和其他试剂的苛刻条件。描述为生产性再折叠（productive refolding) 的效应在内切葡聚糖酶以外的其他蛋白质中得以表现[Zhang N, Suen WC, Windsor W,Xiao L，Madison V，Zaks A. Improving tolerance of Candida antarctica lipase B towards irreversible thermal inactivation through directed evolution.(通过 定向进化提高南极假丝酵母脂肪酶对于不可逆热灭活的耐受性）Protein Eng. 2003Aug ; 16 (8) : 599-605.]，但是据
【发明者】所知，其在内切葡聚糖酶特别是GH7内切葡聚糖酶中并未 表现出。在本领域中据信热灭活的内切葡聚糖酶在纤维素的工业分解中几乎没有用处。另 一方面，对于内切葡聚糖酶特别是真菌来源的酶，提高的热稳定性常常是所需的。目前，仅 仅报道有GH12和GH45内切葡聚糖酶的一些改进。已经报道有来自GH5和GH48结构折叠 的热稳定性内切葡聚糖酶。所述内切葡聚糖酶在其动力学性质和底物优先方面大大不同于 GH7类的内切葡聚糖酶。
[0011] 总之，对于具有优异温度特性的持续内切葡聚糖酶特别是GH7家族的酶存在需 求。而且，由其表达宿主实现良好的生产力将是合乎需求的。许多工业关联过程在苛刻的 条件和升高的温度下进行这一事实进一步支持了该需求。本发明要解决的问题是提供改良 的内切葡聚糖酶，特别是热性能提高的内切葡聚糖酶。本发明致力并解决的其他问题从以 下部分来看将是显而易见的。


【发明内容】

[0012] 本发明涉及热稳定性内切葡聚糖酶蛋白质（多肽）。解决方案提供如下：
[0013] 1. 一种具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质，其属于GH7类，并表现出活性热稳定化。
[0014] 2. -种具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质，其包括与SEQ. ID N0. : 2具有至少96%、 优选至少97%、更优选至少98%、再更优选至少99%、例如至少99. 5%的同一性的氨基酸 序列。
[0015] 优选地，本发明的内切葡聚糖酶蛋白质在60°C下表现出大于95%的残余活性。
[0016] 本发明的其他方面是编码所述多肽的核酸，以及包含在生物体中的载体骨架中的 包括这些多核苷酸的表达构建体。本发明的另一方面是本发明的蛋白质用于处理木质纤维 素和纤维素材料的应用。具体地，木质纤维素进料在联合的、部分联合的或非联合的处理中 的糖化，或者在食品、饲料、纤维素纤维或清洁应用中的处理。
[0017] 本发明还涉及用于产生本发明的蛋白质的生产/表达生物体，并涉及出于蛋白质 生产目的的这些生物体的培养方法。生物体选自包括微生物（真菌、细菌或古细菌）或植 物的生物体。

【专利附图】

【附图说明】
[0018] 图1 :SDS_凝胶显示了分泌到上清液中的Seq. ID N0 8-Seq. ID N0 2变体蛋白质 的表达。所表达蛋白质的条带在75至lOOkDa之间是可见的。
[0019] 图2 :里氏木霉表达质粒。在TrCBHI启动子的控制下将成熟内切葡聚糖酶基因的 DNA编码序列融合克隆至TrCBHI信号肽序列。Swal/Sbfl可切除表达盒含有用于转化体选 择的潮霉素抗性盒。
[0020] 图3 :与天然GH7蛋白质[2]相比较表现出温度稳定性增强的内切葡聚糖酶变体 ([6]和[3])以及温度稳定性及活性热稳定化增强的变体[1]、[4]、[5]、[7]、[8]、[9]和 [10]。
[0021] 图4:在Tecan Infinite M200酶标仪上将200 ill份的碱性4-甲基伞形酮溶液校 正至荧光读数。通过将440mg 4-甲基伞形酮（Sigma Aldrich Cat. Nr. 69580)溶解在250ml 的0. 5M碳酸钠溶液中，制备lOmM溶液。在0. 5M碳酸钠中制备连续溶液。在360nm/454nm 下以增益50测量荧光强度。
[0022] 图 5 :与 Seq. ID NO:4 相比较，Seq. ID NO: 13 的热稳定化。
[0023] 图6:在70°C下测定Seq. ID NO: 14相比较于Seq. ID NO:4的半衰期（实施例7)。

【具体实施方式】
[0024] 定义
[0025] "热稳定性"是用于描述根据本发明的具有内切葡聚糖酶活性的特定蛋白质的固 有特性的术语。
[0026] "活性热稳定化"是用于描述根据本发明的具有内切葡聚糖酶活性的特定蛋白质 的固有特性的术语。
[0027]热稳定性和/或活性热稳定化的测定：热稳定性和活性热稳定化测定如下。
[0028] 1)如实施例2中所述，在毕赤酵母（Pichia pastoris)中表达酶。任选地对酶进 行提纯。
[0029] 2)调节酶的浓度。
[0030] 通过将提纯的酶或毕赤酵母培养物上清液在醋酸钠缓冲液（50mM，pH 5)中稀释 至可适用的工作浓度，制成浓度适当的酶溶液。对于可适用工作浓度的确定，在醋酸钠缓 冲液中制备上述步骤1中）得到的酶的连续稀释液，如实施例4中所述，在温度梯度下对 10 Pi等份进行测试。可适用的工作浓度定义为以下浓度：其导致在Tecan Infinite M200 酶标仪上在增益50下荧光信号在5, 000至15, 000之间，或者是在如实施例4中所述孵育 之后5.4 yM至19 yM 4-甲基伞形酮的等同浓度。
[0031] 3)如实施例4中所述，测定底物转化能力，其不同之处在于，将10 yl等份的培养 物上清液用10 u 1等份如步骤2)中定义的可适用工作浓度的酶溶液代替。
[0032] 4)通过将所有的相对荧光单位（rfu)读数除以温度梯度内的最大rfu读数对测量 结果进行归一化，得到在各个测试温度下测定的各蛋白质的相对底物转化率。
[0033] 5)将相对底物转化率对测定的反应温度进行作图。
[0034] 6)如（a)中所述测定温度稳定性，或者如下文（b)中所述测定活性热稳定化。
[0035] a.测定温度稳定性：如果相对底物转化率在60°C下为0. 5或更高，优选0. 7或更 高，更优选〇. 9或更高，例如0. 95或更高，蛋白质则被表征为温度稳定的。
[0036] 测定活性热稳定化：对步骤5)中得到的图进行分析，在相对底物转化率上存在有 平稳期，其低于最大水平（1)但至少高达〇. 15。
[0037] 平稳期定义为相对底物转化率的水平在至少5°C的温度范围内，优选70至 75°C (即，在所述温度范围内围绕平均值+/_0. 1内），基本上不变化。
[0038] b.不表现出活性热稳定化的变体相对底物转化率为0至低于0. 15,通常为大约 〇. 1。无意拘泥于任何特定理论，据信测得的相对底物转化率通常为大约〇. 1 (而不是〇. 〇， 如在给定温度下对于无活性的酶所预计）是因为热循环仪中和/或样品混合物的处理过程 中有限的温度斜坡所致。
[0039] 热特性是通常用来指酶在更高温度（例如，60°C或更高）下的特性的术语。该术 语可以包括上述的"温度稳定性"和上述"活性热稳定化"中的一个或二者。
[0040] 内切葡聚糖酶活性在本发明的上下文中定义如下：通过蛋白质经由极性分子 如水或具有其羟基或巯基或氨基官能性的有机分子的亲核进攻催化加速3-1，4-糖 苷键的断裂。该定义还包括具有经由0-1，4-糖苷键与葡萄糖、纤维二糖或乳糖连接 的非碳水化合物分子的合成分子的断裂。由内切葡聚糖酶催化的示例反应由Brenda Database(http://www. brenda-enzymes. info)列出(Release 2012. 1 (January 2012)； Enzyme data and metabolic information:BRENDA，a resource for research in biology, biochemistry, and medicine Schomburg, I. , Hofmann, 0. , Baensch, C. , Chang, A. ，Schomburg，D. Gene Funct. Dis. 3-4, 109-18 (2000))。
[0041] 残余活性定义为与不经孵育步骤的活性相比较，将酶在指定（升高的）温度下孵 育指定时间之后恢复的酶活性。确定残余活性的方案在实施例4中给出。
[0042] 与SEQ ID N0:2的序列比对：任何第二GH7内切葡聚糖酶序列与亲代序列（SEQ ID N0 2)的成对比对均使用 ClustalW 算法进行（Larkin M. A.，Blackshields G.，Brown N. P. , Chenna R. , McGettigan P. A. , McWilliam H. , Valentin F. , Wallace I. M. , Wilm A.，Lopez R.，Thompson J.D.，Gibson T.J?和Higgins D.G. (2007) ClustalW and ClustalX version 2. Bioinformatics 200723(21):2947-2948)。成对比对将显示出 SEQ ID NO:2 的 位置数。所述的位置数可以用于参照，例如，当提到，例如，在第二GH7内切葡聚糖酶中与 SEQ ID N0:2的第2位对应的残基发生突变。对于蛋白质变体的描述来说，作为氨基酸编号 和蛋白质变体命名的惯例，亲代蛋白质序列SEQ ID N0:2内的氨基酸被称作位置数1或S1 或丝氨酸1。所有氨基酸的编号将根据其在SEQ ID N0:2中给出的亲代序列中相对于该位 置数1的位置。
[0043] 序列同一性：对于序列同一性的确定，使用来自Life Technology Corporation售 出的VectorNTI软件包中的软件AlignX，使用标准设置（空位开放罚分10,空位扩展罚分 0?1)。
[0044] 蛋白质变体是其氨基酸序列与该亲代蛋白质在一个或多个位置处不同的多肽，其 中差别可能在于一个氨基酸残基被另一个取代、单个或若干个氨基酸残基的缺失或者额外 的氨基酸残基或一段氨基酸残基插入到亲代序列中。通过将点突变引入到编码核酸中，可 以在指定的位置处对蛋白质加以修饰。在本文中术语修饰的蛋白质序列总是指由相应地修 饰的核酸在体外或通过适当的表达宿主经由转录和翻译以及任选地翻译后修饰和易位过 程而得到的蛋白质。用于产生这些蛋白质变体的方法是本领域公知的，因而不受限定，其例 子包括随机或定点诱变、定点饱和诱变、基于PCR的片段组装、DNA改组、体外或体内同源重 组以及基于化学DNA合成的基因合成方法。
[0045] 氨基酸、肽、核苷酸和核酸的命名根据IUPAC进行。通常，在本申请文件中氨基酸 根据单字母符号命名。
[0046] 单个氨基酸的交换描述如下：命名原始氨基酸的单字母符号，之后是其位置编号 以及取代的氨基酸的单字母符号，即，1位上的谷氨酰胺变成在该位置上的亮氨酸被称作 "Q1L"。对于单个位置从序列中的缺失，取代的氨基酸的符号被三字母缩写"del"代替，从 而3位上丙氨酸的缺失将被称作"A3del"。插入的额外的氨基酸接受在前位置的编号，其延 伸有相对于其与其插入点的距离依字母顺序的小写字母。因此，在3位之后插入两个色氨 酸被称作"3aW，3bW"。将未翻译密码子TAA、TGA和TAG引入到核酸序列中在氨基酸序列中 指示为"*"，因此在氨基酸序列的4位上引入终止密码子称作"G4*"。多个突变由加号或斜 杠或逗号分开。例如，分别在20和21位上将丙氨酸和谷氨酸替换成甘氨酸和丝氨酸的两 个突变记作"A20G+E21S"或"A20G/E21S" "A20G，E21S"。当指定位置处的氨基酸残基被两 个或更多个可选的氨基酸残基替换时，这些残基以逗号或斜线分开。例如，30位的丙氨酸被 甘氨酸或谷氨酸替换记作"A20G，E "或"A20G/E "，或者"A20G，A20E "。当在本文中识别出适 合修饰的位置而没有指出任何具体的修饰时，应当理解成任何氨基酸残基均可以替换在该 位置处存在的氨基酸残基。因此，例如，当提到20位上的丙氨酸修饰而没有指明时，应当理 解成该氨基酸可以缺失或替换成任何其他的氨基酸残基（即，R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、 M、F、P、S、T、W、Y 和 V 中的任一个）。
[0047] 术语"类似的突变"或"类似的替换"是指如下氨基酸突变：其中第一突变（关于 亲代序列，例如，如SEQ ID N0:2)中的氨基酸残基再次通过第二突变被取代，并且通过第二 突变引入的氨基酸残基与通过第一突变已引入的氨基酸残基具有类似的性质。在本上下文 中类似是指氨基酸具有类似的化学性质。例如，如果特定位置处的第一突变导致非脂肪族 氨基酸残基（例如Ser)被脂肪族氨基酸残基（例如Leu)替换，在相同位置处通过第二替 换的方式用不同的脂肪族氨基酸替换（例如lie或Val)则被称作类似的突变。其他的化 学性质包括残基大小、疏水性、极性、电荷、PK值等。因此，类似的突变可以包括如下替换， 例如，碱性替换成碱性、酸性替换成酸性、极性替换成极性等。出于结构上的理由，由此衍生 的氨基酸的集合可能是保守的。这些集合可以以维恩图的形式描述（Livingstone CD.和 Barton GJ. (1993)''Protein sequence alignments:a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation〃（蛋白质序列比对：残基保护性分类分析策略） Comput. Appl Biosci. 9:745-756 ;Taylor W. R. (1986) "The classification of amino acid conservation〃（氨基酸保守性分类）J. Theor. Biol. 119 ;205-218)。相似的替换可以根据， 例如，以下的氨基酸分组来进行：疏水的：FWYHKMILVAG ;芳香族：F W Y H ;脂肪 族：I L V ;极性：WYHKREDCSTN ;带电的H K R E D ;带正电：H K R ;带负电：E D。 [0048] 表达构建体在本文中定义为包括所有在宿主细胞中建立所包含的开放阅读框 (0RF)的表达所需的序列元件的DNA序列，其包括用于转录起始（启动子）、终止和调节的 序列、用于翻译起始的位点、用于稳定地复制并整合到宿主基因组中的区域以及可选择的 遗传标记物。开放阅读框任选地由编码目标蛋白质的核酸与其他元件的融合物组成，特 别是分泌信号、纤维素结合结构域、用于提高表达水平或促进从发酵肉汤中提纯或分离的 TAG。因此功能设定可以是已经建立好的，或者通过在宿主细胞中进行排列（整合等）事件 而达到。在优选的实施方式中，表达构建体包括与开放阅读框功能性连接的启动子，然后是 任选的终止序列。优选的启动子是中至高强度启动子，在发酵条件下在所选择的宿主中发 挥功能。为进行说明，给出如下优选启动子的例子：
[0049] ?细菌（例如，大肠杆菌（Escherichia coli)) :lac、tac、trp、tet、T3、T7、CP7、 CP21、araBAD
[0050]?酵母（例如，毕赤酵母属（Pichia)、酵母属（Saccharomyces)) :A0XI、A0XII、 FMDH、GAP、TEF、PFK1、FBA1、PGK1、ADH1、ADH2、TDH3
[0051]真菌（例如，木霉属（Trichoderma)) :CBHI、CBHII、EGI、PGK、BGL、XYL1、XYL2
[0052] 用于异源表达的适当启动子的其他例子在文献中得以报道。表达构建体的其他部 分是引入的核酸和可选择标记物的稳定继承所需的遗传元件，其包括有关抗生素抗性的遗 传元件或补充宿主株的定义的营养缺陷型的遗传元件。
[0053] 本发明所有核酸的序列，或编码本发明的多肽/蛋白质的核酸的序列，均可以朝 向在选择的表达宿主中最优的密码子使用加以调节。对于特定表达宿主来说具有优化/ 最优的密码子选择的核酸也是本发明的一部分。生产宿主在本文中与表达宿主同义使用， 其是指在培养时产生本发明的蛋白质的生物体。在一实施方式中，本发明的蛋白质并不是 由生产宿主分泌；但是，在优选的实施方式中，其被分泌至周围的培养基中。这样的微生物 优选地选自细菌、古细菌、酵母、真菌和/或植物界的范畴。一优选的表达宿主是毕赤酵母 (Pichia pastoris)〇
[0054] "细菌"在本文中是指原核生物。在优选的实施方式中，细菌是真细菌，再更 优选地其选自埃希氏杆菌属（Escherichia)、芽孢杆菌属（Bacillus)、克雷伯氏杆菌 属（Klebsiella)、链霉菌属（Streptomyces)、乳球菌属（Lactococcus)和乳酸菌属 (Lactobacillus)，特别是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtil is)、地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)、角军淀粉芽抱杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)、巨大芽抱 杆菌（Bacillus megaterium)、植生克雷伯菌（Klebsiella planticola)、变铅青链霉菌 (Streptomyces lividans)、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis)、短乳杆菌（Lactobacillus brevis)〇
[0055] "酵母"在本文中是指所有在其生命周期中表现出单细胞营养态的低等真核生 物。其具体地包括酵母菌（Saccharomycetes)类生物体，特别是酵母属（Saccharomyces)、 管囊酵母属（Pachysolen)、毕赤酵母属（Pichia)、假丝酵母属（Candida)、耶氏酵 母属（Yarrowina)、Debaromyces属、克鲁维酵母属（Klyveromyces)、接合酵母属 (Zygosaccharomyces)〇
[0056] "丝状真菌"或"真菌"在本文中是指所有在其生命周期中在至少一状态下 表现出菌丝生长的低等真核生物。其具体包括子囊菌门和担子菌门的生物体，特别是 木霉属（Trichoderma)、踩节菌属（Talaromyces)、曲霉属（Aspergillus)、青霉菌属 (Penicillium)、金抱子菌属（Chrysosporium)、革菌属（Phanerochaete)、热子囊菌属 (Thermoascus)、伞菌属（Agaricus)、Pleutrus 属、耙齿菌属（Irpex)的生物体。
[0057] "植物"在本文中是指所有属于植物界的真核生物。在优选的实施方式中，表 达宿主选自以下属的植物：玉蜀黍属（Zea)、小麦属（Triticum)、大麦属（Hordeum)、黑 麦属（Secale)、芒草属（Miscanthus)、甘鹿属（Saccharum)、爺属（Solanum)、甘薯属 (Ipomea)、木薯（Manihot)、向日葵属（Helianthus)、山茶属（Camellia)、Aspalathus、按属 (Eucalyptus)、甜菜属（Beta)、山毛棒属（Fagus)、松科（Pinaceae)、样木科（Betulaceae)、 锦奏科（Malvaceae)、柏科（Cupressaceae)、舊薇科（Rosaceae)、掠桐科（Arecaceae)的成 员。
[0058]酶制剂是指任何含有酶作为部分的液体或固体组合物。其他组分优选包括水、多 元醇、糖、洗涤剂、缓冲剂、还原剂、无机盐、固体载体、防腐剂，特别是具有抗菌或抗真菌活 性的防腐剂，染料、芳香剂和/或香料。
[0059] 内切葡聚糖酶的用途，例如，特别是本发明的内切葡聚糖酶的用途（非限定性例 子）：用于产生单糖、二糖或寡糖的木质纤维素进料的水解；制造纸浆和纸；用于纤维、纱线 或粗斜纹棉布的改良或通用处理的纺织品应用；工业清洁应用或家庭护理应用；在食品和 饲料领域中营养素的释放、制造率提高或改善面团特性。
[0060] 发明详沭
[0061] 本发明涉及具有优异特性的GH7内切葡聚糖酶。更具体地，本发明涉及热稳定的 内切葡聚糖酶蛋白质（多肽）。解决方案提供如下：
[0062] 1.一种具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质，其属于GH7类，并表现出活性热稳定化。
[0063] 2. -种具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质，其包括与SEQ. ID N0. : 2具有至少96%、 优选至少97%、更优选至少98%、再更优选至少99%、例如至少99. 5%的同一性的氨基酸 序列。
[0064] 以下对这两个实施方式加以详述。
[0065] 温度稳定性如上文定义。测定温度稳定性的例子在实施例4中给出。GH7类的内 切葡聚糖酶列于表1中（EC 3. 2. 1. 4)。除了在特定权利要求中通过特定序列同一性限制排 除以外，本发明涉及GH7类所有内切葡聚糖酶的变体，其中包括表1所示者的变体。
[0066] 表1:已知的GH7类内切葡聚糖酶。
[0067]

【权利要求】
1. 一种具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质，其包括与SEQ. ID NO. :2具有至少96%、优选 至少97 %、更优选至少98 %、再更优选至少99 %、例如至少99. 5 %的同一性的氨基酸序列。
2. 根据权利要求1所述的蛋白质，其中所述蛋白质在温度60°C下在孵育进行1小时时 表现出至少90%的残余底物转化能力。
3. -种具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质，其属于GH7类，并表现出活性热稳定化。
4. 根据权利要求3所述的蛋白质，其与SEQ. ID NO. :2具有至少70%、优选至少90%、 更优选至少95 %、更优选至少96 %、更优选至少97 %、更优选至少98 %、再更优选至少 99%、例如至少99. 5%的同一性。
5. 根据权利要求1、3或4中任一项所述的蛋白质，其与SEQ ID N0:5 ;SEQ ID N0:6 ;SEQ ID N0:7 ；SEQ ID N0:8 ；SEQ ID N0:9 ；SEQ ID NO: 10 ；SEQ ID NO: 11 ；SEQ ID NO: 12 ；SEQ ID NO: 13 ;SEQ ID NO: 14 ;SEQ ID NO: 2中的任一个是等同的；或者其相对于SEQ ID NO: 2具有 至少一处突变。
6. 根据权利要求5所述的多肽，其中所述至少一处突变是选自表2中所示的可选变化 中的优选的、更优选的突变。
7. 根据权利要求5所述的多肽，其中所述至少一处突变是选自表3中所示的可选变化 中的优选的、更优选的突变。
8. 根据权利要求5所述的多肽，其中所述至少一处突变是选自表4中所示的可选变化 中的优选的、更优选的突变。
9. 一种核酸，其编码前述权利要求中任一项所述的蛋白质。
10. -种表达载体，其包括权利要求9所述的核酸。
11. 一种微生物，其含有权利要求10所述的载体构建体。
12. -种混合物，其含有根据权利要求1-8中任一项所述的蛋白质和一种或更多种其 他的酶，其优选选自纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶中的一种或更多种。
13. 根据权利要求1-8中任一项所述的蛋白质或根据权利要求12所述的混合物的用 途。
14. 根据权利要求13所述的用途，其用于木质纤维素的糖化。
【文档编号】C12N9/42GK104271738SQ201380023399
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2013年4月30日 优先权日:2012年5月2日
【发明者】C·赖辛格, J·克拉伦, I·翁特施特拉塞尔, A·米特罗维奇, K·弗利克尔, G·格布哈特 申请人:科莱恩产品（德国）有限公司