一种内切葡聚糖酶及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供的新型内切葡聚糖酶来源于草酸青霉，构建的黑曲霉工程菌能高效表达该酶，摇瓶发酵酶活可达900U/mL；本发明获得的重组内切葡聚糖酶的最适作用pH为4.0，最适温度为45℃，在pH5.0-7.0范围内酶活损失不高于5%，可广泛应用于纺织加工【技术领域】。在针织面料、梭织面料的除毛染色方面，应用本发明的重组内切葡聚糖酶具有除毛干净，对织物强力损失小的特点，有利于其推广应用。
【专利说明】一种内切葡聚糖酶及其应用
[0001]【技术领域】
本发明属于微生物工程【技术领域】，具体涉及一种内切葡聚糖酶及其应用。
【背景技术】
[0002]纤维素酶是一类能够降解纤维素，使之生成纤维二糖、葡萄糖等一系列酶的总称，按各酶功能的不同可以分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶。纤维素被它降解后可转化为人类急需的能源、食物、化工原料，对于人类社会解决食物短缺和能源危机具有重大的现实意义。
[0003]纤维素广泛存在于自然界的生物体中，细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。一般用于生产的纤维素酶来自于真菌，比较典型的是木霉属、曲霉属和青霉属。
[0004]纤维素酶成本高以及酶活力低已经成为制约纤维素酶广泛应用的两大瓶颈，因此构建高效表达的基因工程菌是降低纤维素酶成本、提高产量的有效手段。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一种新型内切葡聚糖酶及其在纺织领域的应用。本发明通过构建含有草酸青霉oxalicum)的内切葡聚糖酶基因的表达质粒,转化入黑曲霉中，获得高效重组表达内切葡聚糖酶的黑曲霉工程菌株，从而弥补现有技术的不足。
[0006]本发明一方面涉及一种内切葡聚糖酶，包括:
Ca)其氨基酸序列为SEQ ID NO:1的内切葡聚糖酶；
(b)在(a)中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有内切葡聚糖酶活性的酶。
[0007]编码上述内切葡聚糖酶的基因，其一种编码核苷酸序列为SEQ ID NO: 2。
[0008]本发明另一方面涉及上述内切葡聚糖酶在纺织领域中的应用。
[0009]本发明提供的新型内切葡聚糖酶来源于草酸青霉，构建的黑曲霉工程菌能高效表达该酶，摇瓶发酵酶活可达900U/mL ;本发明获得的重组内切葡聚糖酶的最适作用pH为
4.0，最适温度为45°C，在pH5.0-7.0范围内酶活损失不高于5%，可广泛应用于纺织加工【技术领域】。在针织面料、梭织面料的除毛染色方面，应用本发明的重组内切葡聚糖酶具有除毛干净，对织物强力损失小的特点，有利于其推广应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为黑曲霉EG-1发酵上清液SDS-PAGE电泳检测分析图，其中泳道I为对照组，泳道2为黑曲霉EG-1发酵上清液，箭头所指处即为重组表达的内切葡聚糖酶。
【具体实施方式】
[0011]本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed.(Sambrook, 2001)和 CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，这并不意味着将本发明限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂，因为它们可以改变。
[0012]除非在本文中另作限定，本文所用的全部技术术语和科学术语具有本发明所属领域的普通计数人员通常所理解的相同含义。DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY, 3nd Ed.(Singleton et al., 2006)和 COLLINS DICTIONARY BIOLOGY (Hale etal.，2003)为技术人员提供了本发明中所使用的许多术语的一般性解释。
[0013]下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。
[0014]实施例1内切葡聚糖酶基因的克隆
1.1草酸青霉总DNA的提取
将草酸青霉(ora/icw?)过夜培养,取适量菌体置于离心管中，13000 rpm离心 5 min，弃上清；加入 400 μ I 抽提缓冲液(100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 250 mMNaCl, 1%SDS);然后加IOOmg石英砂或玻璃珠，在珠打仪剧烈振荡2min左右；65°C水浴20min后，加入200 μ I 10Μ NH4AC,冰浴IOmin ;13000rpm离心lOmin，取上清；加入2倍体积的无水乙醇，_20°C放置30min ； 13000 rpm离心lOmin，弃上清；用70%乙醇洗涤2次；晾干，加入水溶解，于_20°C保存。利用OMEGA公司的E.Z.N.A.Fungal RNA Kit制备草酸青霉的mRNA，其制备过程参照试剂盒的操作手册。
[0015] 1.2基因克隆
以1.1中提取的草酸青霉基因组总DNA为模板，设计引物进行PCR扩增。PCR扩增条件为 95。。4min ；94°C 30S ；55°C 40S，72°C Imin 30 个循环；72°C，7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。
[0016]将回收的扩增产物分别连接到pMD18-T载体，获得克隆载体pMD_EG2，送至北京华大基因研究中心进行测序分析，获得的核苷酸序列为SEQ ID N0:2，用blast分析表明扩增片段为草酸青霉的内切葡聚糖酶基因，其编码氨基酸序列为为SEQ ID N0:1，为一新的等位基因。
[0017]实施例2黑曲霉工程菌的构建
2.1表达载体构建
将1.2中得到的PCR产物进行Xba I单酶切。同样，对黑曲霉表达质粒pGAMD也进行Xba I单酶切。利用PCR纯化试剂盒回收酶切产物。用T4连接酶把酶切产物即克隆基因和表达载体22°C连接过夜。最后，把连接产物导入大肠杆菌DH5a ;然后通过PCR验证连接正确与否，最后将相应的阳性克隆表达质粒命名为pGAMD-EGl。
[0018]2.2原生质体制备
接种黑曲霉菌丝于PDA平板上生长4天；切取直径约3cm的菌落置于约IOOmL CMAC 2%麦芽提取物、2%葡萄糖，0.1%细菌蛋白胨)的液体培养基中，30°C，200 rpm振荡培养过夜；多层纱布过滤收集菌丝；将菌丝置于盛有20 mL裂解酶液(Sigma L1412)酶解2_3小时；取出酶解液，加入0.8M MgSO4溶液，轻轻摇晃，倒于三层灭菌擦镜纸过滤，收集滤液，3000rpm,离心10 min ;弃上清，加10 mL 1.2M山梨醇悬浮，然后3000 rpm,离心10 min ;加适量山梨醇悬浮分装(200 μ?7管，IO8个/mL)。
[0019]2.3转化与验证取IOPg pGAMD-EGl DNA加入到200μ?原生质体中，接着加入50μ? 25%PEG轻轻混匀，室温静置20 min;然后加2mL 25%PEG，轻轻混匀，室温静置5min，把原生质体加到50 mL左右熔化后冷却至45-55°C的上层半固体培养基(0.059%乙酰胺，0.152%KH2P04,0.34%CsCl，
0.052%KC1，1%葡萄糖，21.85%山梨醇，0.35%琼脂糖)，轻轻混匀后倒入下层基础培养基平板(0.059% 乙酰胺，0.152%KH2P04，0.34%CsC1,0.052%KC1,1% 葡萄糖，1% 琼脂粉)，30°C黑暗培养数天至转化子长出。验证阳性转化子。将获得的一株工程菌命名为黑曲霉EG-1{Aspergillus niger EG-1)。
[0020]实施例3发酵与酶活测定
3.1摇瓶表达 将黑曲霉工程菌EG-1接种于50mL黑曲霉发酵培养基(1.2 % NaN03，0.05 % KC1，
0.15% KH2PO4,0.205% MgSO4.7Η20，0.35% NaH2PO4.Η20，7% 柠檬酸钠，4.5% 胰蛋白大豆肉汤，微量元素lmL，4.1%葡萄糖)，30°C培养4-5天，离心取上清，进行SDS-PAGE检测分析。结果如图1所示，在50kDa处有一蛋白条带，即为重组表达的内切葡聚糖酶，重组蛋白大小与预测的一致。
[0021]实施例4酶学性质分析
4.1最适作用pH值
用 pH 值分别为 2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0 的缓冲液
进行稀释测定，在温度45°C条件下测定酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果显示:本发明的重组表达内切葡聚糖酶的最适作用PH4.0。
[0022]4.2最适作用温度
分别在 30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、6(rC、65°C、7(rC，ρΗ5.0 的条件下测定酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果显示:本发明的重组表达内切葡聚糖酶的最适作用温度为45°C。
[0023]实施例4内切葡聚糖酶在针织面料、梭织面料的除毛染色方面的应用 处理原料:针织面料、梭织面料；
酶的用量:0.1-3.0g/L ；
处理条件:35-55°C，处理时间为30-150分钟，pH范围为4.0-9.5 ；
适用的浴比范围:1:5-1:30 ;
设备类型:溢流染色机，卷染机，水洗机等；
本发明获得的重组内切葡聚糖酶具有除毛干净，对织物强力损失小的特点，有利于推广应用。
【权利要求】
1.一种内切葡聚糖酶，其特征在于: (a)其氨基酸序列为SEQID NO:1的内切葡聚糖酶； (b)在(a)中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有内切葡聚糖酶活性的酶。
2.用于编码权利要求1所述内切葡聚糖酶的基因，其一种核苷酸序列为SEQID NO:2。
3.权利要求1所述内切葡聚糖`酶在纺织领域中的应用。
【文档编号】C12R1/80GK103725660SQ201310647566
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年12月4日 优先权日:2013年12月4日
【发明者】李佩佩, 张青, 王华明, 黄亦钧 申请人:青岛蔚蓝生物集团有限公司