一种植物中期染色体表观基因组核型的分析方法
【专利摘要】本发明涉及一种植物中期染色体表观基因组核型的分析方法。通过制备植物中期染色体，进行免疫染色实验，采用三维反卷积图像复原技术得到的三维表观基因组核型。消除了离散的荧光信号，弱化了它们在带间的分布，展示了清晰的表观免疫带纹，可以分析植物不同表观修饰标记的信号模式以及染色质结构和功能，为进一步阐明表观遗传调控在细胞分裂分化和生长发育中的作用奠定基础。
【专利说明】—种植物中期染色体表观基因组核型的分析方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种植物中期染色体表观基因组核型的分析方法，属于分子细胞遗传学领域。
技术背景
[0002] 绘制各类真核生物的表观基因组图谱的工作正在进行，这通常包括各种修饰的组蛋白、非组蛋白或DNA甲基化在基因组上的分布，并将这些修饰与基因组功能相联系。表观基因组的全基因组分析可以在分子水平上通过染色质免疫沉淀偶联DNA测序技术(Chromatin immunopreci tat ion-sequencing, ChlP-seq)或结合 DNA 微阵列技术(ChlP-chip)得到揭示。但真核生物基因组中含有大量的重复序列会阻碍基因组测序分析，并且这种技术不能辨别处在细胞周期不同阶段的细胞，这样获得的数据代表一些基因不同表达模式的细胞群体或处于不同细胞周期的细胞群体所产生的平均值。这种细胞间的异质性必然会限制关联染色质功能与组蛋白修饰的精确性，而且这些技术只能应用于已经测序或者已经有芯片开发的物种。
[0003]现在这些问题可通过免疫染色技术来检测单细胞水平的表观修饰的分布情况来解决。在有丝分裂中期很少或几乎没有转录，这样消除了细胞间的差异性，细胞间的免疫标记一致性也可以重复分析。免疫中期染色体能在单细胞中分析整个表观基因组，包括难以用基于测序方法达到的重复序列富集的区域，并且结合4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino_2-phenylindole, DAPI)染色 / 突光原位杂交技术(Fluorescence insitu hybridization,FISH)技术能识别单个染色体/某些染色质区域的表观修饰情况。尽管染色体显微技术比Chip-seq技术的分子分辨率低，但是它将提供一种有价值的表观图谱的补充方法和途径，两者相互补充。用表观修饰抗体进行的中期染色体免疫标记能够在显微镜下观察和研究亚细胞核结构和染色体水平的表观修饰分布，这也被称为表观基因组核型(Genome Biol.2010，11，R110)。
[0004]植物染色体由于与动物染色体结构的差异，植物中一些显带技术并没有产生很好的带型，一些紧密相邻的多条荧光带不能分辨出来。因此，用表观修饰的抗体进行免疫标记时只能观察到大致的分布趋势，并没有像动物中呈现出带纹。借助计算机进行的图像处理与分析技术的发展，尤其是反卷积图像复原技术为我们完善显带技术并在植物中获得清晰的带纹提供了机会(Chromosoma 2004，113，16)。图像模糊是由于光学显微系统中点扩散函数(point spread function,PSF)造成的，反卷积图像复原技术是以这个概念为基础,运用反卷积算法，对所得到的比较模糊的图像进行复原，能够显著提高宽场荧光显微镜所得图像的分辨率。因此如果能将反卷积图像复原技术运用于植物中期染色体表观基因组核型分析中，可以清晰地得到植物中表观修饰标记的信号模式以及染色质结构和功能。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题在于提供一种植物中期染色体表观基因组核型的分析方法，该方法能够显著提高宽场荧光显微镜所得图像的分辨率，在植物中期染色体中获得清晰的带纹，本方法操作简单、方便易行。
[0006]本发明提供的植物中期染色体表观基因组核型的分析方法，包括如下步骤: 制备植物中期染色体；使用不同的表观修饰抗体，进行传统的免疫染色实验；拍照，图
像处理；然后进行荧光原位杂交实验，利用不同的探针进行染色体的识别。
[0007]所述免疫染色实验拍照以及图像处理具体包括如下步骤:首先通过测量染色体的高度，设置步长，通过控制Z轴步进器，对染色体逐层扫描，采集到一组二维图像，用Metamorph软件的No Neighbors deconvolution程序,对这组图像进行反卷积处理，去模糊复原，接着用Meta morph软件的3D Reconstruction,对这些复原的图像沿Z轴进行三维重建，这样更反映了染色体表观带纹的真实形态。显微镜镜头的点扩散函数通常由激发光波长、镜头数值孔径、图像像素距离、介质折射率等决定。其中，图像像素距离和介质折射率是显微镜中固定的数值。一般Olympus IOOX镜头数值孔径为1.35，然后根据样品中所用的荧光染料的激发光波长来进行设置，处理DAPI染色形成的图像时激发光波长设为488 nm,FITC的为520 nm。然后再根据染色体的厚度，染色的深浅，信号的强弱，曝光时间的长短等其他因素来进一步调整程序中的一些参数，进行反卷积处理。
[0008]本发明与现有技术相比具有以下有益效果:
本发明采用三维反卷积图像复原技术得到的三维表观基因组核型，消除了离散的荧光信号，弱化了它们在带间的分布，展示了清晰的表观免疫带纹。并且结合FISH技术，可以识别出染色体，进一步分析FISH定位的一些重复序列中的表观修饰的情况，可以作为ChlP-seq—个互补的手段，可以分析植物不同表观修饰标记的信号模式以及染色质结构和功能。
[0009]
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1玉米中期染色体DAPI染色的原始图像,标尺=10 V- mo
[0011]图2玉米中期染色体H3K4me2免疫染色的原始图像,标尺=10 u m0
[0012]图3玉米中期染色体DAPI染色和H3K4me2免疫染色的合成图像，标尺=10 u m。
[0013]图4对图1中DAPI染色原始图像进行反卷积二维重构复原信号图像，标尺=10U m0
[0014]图5对图2中H3K4me2免疫染色的原始图像进行反卷积三维重构复原信号图像，标尺=10 U mo
[0015]图6对图3中玉米中期染色体DAPI染色和H3K4me2免疫染色的合成图像进行反卷积三维重构图像,标尺=10 u m。
[0016]图7通过四个探针(TAG、CentC,45s rDNA、knob 180-bp)和DAPI染色来识别中期染色体，标尺=10 U m。
[0017]图8 FISH核型模式图， N0R:核仁组织区。
[0018]图9 H3K4me2的免疫染色核型模式图。
【具体实施方式】[0019]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。实施例中的图片通过荧光显微镜(OlympusBX-60)观察，电荷稱合器件(charge coupled device, CCD)和Metamorph软件进行图像捕获而获得。图中标尺(Bar) =10 u mo
[0020]实施例1:
1)制备玉米中期染色体于载玻片上；
2)制好的片子于60°C烤片I h，在载玻片上加50耵的3%牛血清白蛋白(bovineserum albumin，BSA)，盖上盖玻片，37 °C封阻I h。揭去盖玻片，将载玻片放于I X磷酸缓冲液(phosphate buffered solution, PBS)溶液中洗3次,每次洗5 min。在载玻片上加50耵的H3K4me2的抗体(I耵抗体+49耵的3% BSA)，盖上盖玻片，4 °C孵育过夜。揭去盖玻片，将载玻片放于I X PBS溶液中洗3次，每次洗5 min。在载玻片上加50 W 二抗(I W抗体+49耵的3% BSA)，盖上盖玻片，37 °C孵育I h。揭去盖玻片，将载玻片放于I XPBS溶液中洗3次，每次洗5 min。 [0021]3)载玻片避光晾干后，加15 ill的DAPI，并盖上盖玻片，使用Olympus BX60荧光显微镜观察信号，Cool Snap HQ2 C⑶相机捕捉信号，MetaMorph软件记录结果。首先通过测量染色体的高度，设置步长，步长为0.1 y m，通过控制Z轴步进器，对染色体逐层扫描，采集到一组二维图像，用Metamorph软件的No Neighbors deconvolution程序，对这组图像进行反卷积处理，去模糊复原，接着用Metamorph软件的3D Reconstruction,对这些复原的图像沿Z轴进行三维重建，这样更反映了染色体表观带纹的真实形态，如图1-6所示。显微镜镜头的点扩散函数通常由激发光波长、镜头数值孔径、图像像素距离、介质折射率等决定。其中，图像像素距离和介质折射率是显微镜中固定的数值。一般Olympus IOOX镜头数值孔径为1.35，然后根据样品中所用的荧光染料的激发光波长来进行设置，处理DAPI染色形成的图像时激发光波长设为488 nm，FITC的为520 nm。然后再根据染色的深浅，信号的强弱，曝光时间的长短等其他因素来进一步调整程序中的一些参数，进行反卷积处理。图4、图 5 中所得的结果,其参数设置为 Filter size = 12, scaling factor = 0.99, resultscale = 10。其中scaling factor设置值越大,则图像反卷积程度越高,但是图像本身留下来的荧光值也越低。
[0022]4)做完免疫染色之后，镜检过的片子用IXPBS溶液中洗3次，每次洗5 min，洗掉片子上的DAPI。在载玻片上加50 W的乙醇:冰乙酸(3:1)固定液，固定10 min。放入-20°C酒精梯度中，依次为70%，95%和100%的酒精，各脱水5 min，于空气中晾干。然后进行荧光原位杂交(FISH)实验，载玻片放在70%的甲酰胺变性液(35 ml甲酰胺，5 ml 20XSSC, 10ml灭菌的双蒸水)中，90 °C变性2.5 min。取出载玻片后即放入_20 °C酒精梯度中，依次为70%，95%和100%的酒精，各脱水5 min，于空气中晾干。探针杂交液:配制杂交液(去离子甲酰胺:15 20X SSC:3 W，鲑鱼精DNA:3 W，硫酸葡聚糖:6 W，探针:3 W)，75 V变性5 min，取出后立即放入冰上，至少5 min。杂交:将杂交液滴在载玻片上，盖上盖玻片，放入湿皿中，37 °C杂交过夜。揭去盖玻片，将载玻片放于2XSSC溶液中，洗5 min。在载玻片上加50耵一抗(I耵抗体+49耵的0.5 % BSA)，盖上盖玻片，4 °C孵育过夜。揭去盖玻片，将载玻片放于IXPBS溶液中洗3次，每次洗5 min。镜检观察，拍照。用四个探针进行FISH实验(TAG信号拟为白色，CentC信号拟为绿色，45s rDNA信号拟为黄色和knob180-bp信号拟为红色)，如图7所示。根据以前的研究结果，按染色体长度、臂比来区分，着丝粒信号主要用来明确长臂和短臂的位置。I号染色体最长，10号染色体最短，5号染色体为等臂，8号染色体长臂和短臂的臂比最大(I:3)。然后6号染色体上有45s rDNA信号，I号染色体长臂、2号染色体两臂、4号染色体短臂上有微卫星TAG的信号，9号和10号染色体长短相差不大，但是9号染色体短臂上有knob信号，而10号染色体上没有来区分。根据这些特征，识别出10条染色体。
[0023]5)通过染色体的识别，绘制出FISH核型模式图，如图8所示，H3K4me2的免疫染色核型模式图，如图9所示，可以进一步分析每条染色体的表观修饰情况以及荧光原位杂交定位的一些重复序列中的表观修饰情况。
[0024]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本`发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种植物中期染色体表观基因组核型的分析方法，其特征在于包括如下步骤: a.制备植物中期染色体； b.使用表观修饰抗体，进行传统的免疫染色实验； c.使用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚染色，拍照，记录结果； 采用三维反卷积图像复原技术，对c步所得的结果进行图像处理，得到三维表观基因组核型； e.进行荧光原位杂交实验，利用不同的探针进行染色体的识别，拍照，记录结果，并绘制出染色体核型的模式图； f.根据荧光原位杂交的结果，绘制出三维表观基因组核型的模式图，并进一步分析每条染色体的表观修饰情况以及荧光原位杂交定位的一些重复序列中的表观修饰情况。
2.如权利要求1所述的植物中期染色体三维表观基因组核型的分析方法，其特征在于:所述免疫染色实验拍照以及图像处理具体包括如下步骤: a.首先通过测量染色体的高度，设置步长，通过控制Z轴步进器，对染色体逐层扫描，采集到一组二维图像； b、用Metamorph软件的NoNeighbors deconvolution程序,对这组图像进行反卷积处理，去模糊复原； C、接着用Metamorph软件的3D Reconstruction,对这些复原的图像沿Z轴进行三维重建。
【文档编号】C12Q1/68GK103614480SQ201310647518
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年12月6日 优先权日:2013年12月6日
【发明者】李立家, 何世斌, 颜识涵, 王璞, 王翔伍 申请人:武汉大学