一种表达低过敏性花生过敏原的乳酸乳球菌重组菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种表达低过敏性花生过敏原的乳酸乳球菌重组菌及其应用。本发明在保留天然花生过敏原Arah2蛋白免疫原性的基础上，降低其过敏原性，对Arah2的天然基因进行密码子优化和修饰突变得到优化基因mArah2，构建了针对mArah2的重组表达质粒和重组乳酸乳球菌菌株。用本发明的重组菌免疫小鼠，可有效抑制花生过敏的发生，免疫保护作用显著；因此本发明在临床防治花生过敏方面有巨大的潜力。
【专利说明】一种表达低过敏性花生过敏原的乳酸乳球菌重组菌及其应用
【【技术领域】】
[0001]本发明涉及表达低过敏性花生过敏原mArah2的重组乳酸乳球菌菌株，其构建方法及应用，属于生物工程【技术领域】。
【【背景技术】】
[0002]花生过敏是最常见的食物过敏反应，发病率较高，会引起严重甚至致命的临床症状。花生过敏通常是终生的，一般不易随着年龄增长产生免疫耐受。目前，特异性免疫疗法是较为有效的花生过敏治疗方法。但传统的特异性免疫疗法大都使用过敏原粗提物，提取量小、纯度低。利用基因工程方法重组表达过敏原蛋白是一种简便可行的方法。陶爱林等在专利《一种重组花生过敏原与突变体及其制备方法和应用》中利用大肠杆菌作为表达宿主成功制备一种重组花生过敏原与突变体。但大肠杆菌产内毒素,其表达产物需后续纯化，都阻碍了大肠杆菌表达系统的大规模推广及应用。
[0003]乳酸乳球菌已被广泛用于食品、医药和农业等领域，是公认安全的食品级微生物。近年来，乳酸乳球菌分子遗传学研究的重大发展使得利用乳酸乳球菌表达外源抗原制备粘膜疫苗成为研究的热点。乳酸乳球菌表达的蛋白可直接连同菌体一起口服，同时其表达的外源蛋白可诱导机体产生有效的免疫应答。
[0004]花生过敏原包括分子量介于0.7-100kDa间的多种糖基化蛋白，Arah2是花生中致敏性最强的组分之一，可被超过90%的花生过敏患者血清中特异性IgE识别。Stanley J S、Chatel J M 等人的研究结果表明，Arah2的主要线性抗原表位为:aa9_18、aa39_48、aa47_56 及 aa61_66 (StanleyJS, etal.1dentification and mutationalanalysis of the immunodominant IgE binding epitopes of the major peanutallergen Arah2.Arch Biochem Biophys，1997，342 (2):244-253;Chatel J M，etal.1solation and characterization of two complete Arah2 isoforms cDNA.1ntarch Allergy Immyj 2003，131 (I): 14-18)。其中，第一个 IgE 结合表位 aa9_18 与 CD4+T细胞结合表位有重合(Prickett S R et al.Arah2 peptides containing dominantCD4+T_cell epitopes:candidates for a peanut allergy therapeutic.J Allergy ClinImmun, 2011, 127(3):608_615)。考虑到天然过敏原在免疫治疗中可能诱发过敏反应，本发明通过基因工程技术对优化后花生过敏原基因nArah2进行合理的修饰突变，在保留其免疫原性的同时降低其过敏原性，获得了低过敏原性的过敏原基因mArah2。
[0005]因此，本发明利用乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)作为宿主菌株表达mArah2蛋白，以制备花生过敏口服疫苗，并通过小鼠模型评价其免疫效果。
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【发明内容】
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[0006]本发明要解决的技术问题是提供一种低过敏原性的花生过敏原蛋白mArah2，包含该蛋白编码基因的重组质粒，用该质粒转化乳酸乳球菌菌株，其中所述菌株可以是乳酸乳球菌NZ9000，得到重组乳酸乳球菌菌株L.lactis NZMH。
[0007]本发明还涉及包含所述的重组乳酸乳球菌菌株的疫苗，所述疫苗可以是口服制剂，例如胶囊剂、锭剂、粉剂或颗粒剂等。
[0008]本发明还涉及所述的重组质粒或重组乳酸乳球菌菌株在制备可用于治疗花生过敏的乳酸乳球菌疫苗中的用途。
[0009]本发明中低过敏原性的花生过敏原蛋白mArah2在保留原始蛋白免疫原性的基础上降低了其过敏原性，可有效避免在免疫治疗中天然过敏原可能诱发的过敏反应，大大降低副作用。并且通过动物实验结果表明，低过敏原性的乳酸乳球菌重组菌株可促使免疫反应从Th2型向Thl型转变，对花生过敏起到预防作用。
[0010]因此，mArah2基因可以重组质粒疫苗的形式用于防治花生过敏；重组乳酸乳球菌菌株L.lactis NZMH可作为一种新型的低致敏性疫苗应用于花生过敏的临床预防及免疫治疗。
[0011]本发明涉及的乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZMH,于2013年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC N0.8219 ；
[0012]本发明涉及的乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZNH,于2013年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC N0.8216。
【【专利附图】
【附图说明】】
[0013]图1:nArah2和 mArah2蛋白在乳酸乳球菌中表达的Western blot分析；Μ,非预染蛋白质低分子量标准；第I泳道为纯化的His-nArah2蛋白；第2泳道为L.lactis NZ ；3和4 泳道分别为 L.lactis NZNH、L.lactis NZMH ；
[0014]图2:动物实验流程图；
[0015]图3:过敏症状的评分:符号(Λ)代表小鼠个体，线段表示平均值。不同字母(a_c)表示组别之间具有显著性差异(P〈0.05)；
[0016]图4:重组乳酸乳球菌对小鼠血清特异性抗体的影响:血清CPE特异性的IgE(A)、IgGl (B)和IgG2a (C)含量以450nm处的OD值来表示。符号(▲，.，?)代表小鼠个体，线段表示平均值。不同字母(a-d)表示组别之间具有显著性差异(p〈0.05)。
[0017]图5重组乳酸乳球菌对小鼠血清中总IgE抗体和MCP-1的影响:a:与阴性对照组相比，ρ〈0.05 ；b:与模型组相比，ρ〈0.05。
【【具体实施方式】】
[0018]以下通过实施例来进一步阐述本发明，下例实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册进行实验操作，各种试剂如无特殊说明，其浓度均为质量百分比浓度。
[0019]实施例1低过敏原性基因mArah2的获得
[0020](I)天然花生过敏原基因Arah2的优化:
[0021]在Arah2的氨基酸序列(genbank:AAN77576.1)中删除信号肽序列，同时结合乳酸乳球菌密码子的偏爱性对Arah2基因序列进行密码子优化，并亚克隆至pUC57上，得到包含天然过敏原优化基因nArah2的质粒PUC57_nArah2 (由上海生工合成，其中pUC57为商业化质粒)。
[0022](2)天然过敏原优化基因nArah2的修饰突变:
[0023]将aa47_56抗原表位断开，并按50-151-1-49的氨基酸顺序重新排列，得到低过敏原性的花生过敏原基因mArah2。相关序列如下:
[0024]优化前天然基因序列(genbank:AY158467.1), SEQ ID N0.1。
[0025]修饰突变后的优化基因序列(mArah2)，SEQ ID N0.2。
[0026]优化前天然氨基酸序列(genbank:AAN77576.1), SEQ ID N0.3。
[0027]修饰突变后的优化氨基酸序列，SEQ ID N0.4。
[0028]实施例2含低过敏原性基因mArah2的重组表达载体的构建
[0029]目的片段aal-49、aa50_151的重排拼接:以质粒pUC57_nArah2 (由上海生工合成，其中PUC57为商业化质粒)为模板，分别利用引物P1F:CAGGTGGTCGTGATCGTTATCGTCAACAATGGGAATTAC/PIR:CCCTCGAGATCTTGTGATGGTGAATATG 和引物 P2F:CGCCATATGCCATATTCTCCTTCACAAG/P2R:GTAATTCCCATTGTTGACG ATAACGATCACGACCACCTG 扩增 aal-49及aa50-151片段基因。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测并分别回收纯化两个基因片段的PCR产物。采用重叠区扩增基因拼接法对目的片段aal-49、aa50_151进行拼接。扩增体系如下(总体积为 50 μ L): 10 XKOD plus buffer:5 μ L ；dNTP:5 μ L ；MgS04:2 μ L ;模板 1-49:2μ L ;模板50-151:2 μ L ;K0D酶:0.5μ L ；ddH20:31.5 μ L。5个循环后再加入上、下游引物(P1R/P2F)各1μ L。将拼接完成的目的基因片段命名为mArah2和载体pNZ8148 (Mierauand Kleerebezem.1Oyears of the nisin-controlled gene expression system(NICE)inLactococcus lactis.Appl Microbiol Biotechnol.2005，68 (6): 705-717)双酶切后进行过夜连接反应。
[0030]实施例3重组乳酸乳球菌的制备
[0031]将上述连接反应产物电击转化L.lactis NZ9000 (Kuipers et al.Quorumsensing-controlled gene expression in lactic acid bacteria.Journal ofBiotechnology.1998，64 (I): 15-21)感受态细胞。挑取转化子进行测序验证，将测序正确的重组质粒和转化子分别命名为pNZ8148-mh2 (自行构建)和L.lactis NZMHjf L.1actisNZ9000和重组表达nArah2蛋白的L.lactis NZ9000菌株分别命名为L.lactis NZ和L.lactis NZNH0
[0032]实施例4重组蛋白在乳酸乳球菌中的诱导表达及Western blot检测分析
[0033](I)重组蛋白在乳酸乳球菌中的诱导表达:`[0034]挑取测序正确的转化子单菌落接种到5mL含10 μ g/mL氯霉素(Cm)的GM17液体培养基(每升GM17培养基配方:大豆蛋白胨5g,细菌蛋白胨5g,牛肉膏5g,酵母粉2.5g,葡萄糖5g，β -磷酸甘油二钠19g，维生素C0.5g，Imol/LMgSO4ImL)中，30°C培养过夜；按照2%接种量转接于5mL含有10 μ g/mL Cm的GM17培养基中，培养到OD6tltl为0.5-0.6 ;加入nisin(Sigma,购自上海悠扬生物科技有限公司)诱导物使其终浓度为10ng/mL，30°C继续培养6h后，于4°C，6000g离心IOmin收集菌体；PBS洗涤菌体沉淀两次后，重悬于1/20体积的PBS中。超声破碎菌液至半透明状，4°C以12000g离心20min，收集上清液进行Western blot检测。
[0035](2) Western blot检测重组蛋白的表达情况:
[0036]将上述制备的样品和L.lactis NZ (作为阴性对照)经12%SDS_PAGE凝胶分离后，于冰浴稳流(150mA)转移40min，使得蛋白转移至PVDF膜(Millipore，购自中科瑞泰生物科技有限公司)；转印膜经PBST (每升10XPBS缓冲液配方:NaC180g，KC12g, Na2HPO4.12H2035.8g, KH2P042g ；每升 PBST 缓冲液配方:10 XPBSlOOml，蒸馏水900ml, Tween-200.05%)洗涤后，用PBST(含5%脱脂奶粉)室温封闭2h ;—抗(1:1000稀释度)与转移膜于4°C过夜孵育；用HRP标记羊抗兔二抗(1:1.0X IO4稀释度，SouthernBiotech,购自上海悠扬生物科技有限公司)和转印膜室温孵育Ih ;转印膜上滴加显色液(购自北京康为世纪生物科技有限公司)避光条件下显色。由图1的结果可知:阴性对照(泳道2)中未见条带，阳性对照(泳道l)His-nArah2为预期19kDa大小，同时在泳道3和4也检测出同为19kDa的条带,与预期大小一致,分别对应nArah2和mArah2蛋白。
[0037]实施例5动物实验
[0038](I)菌体制备:
[0039]将过夜培养的重组菌株按照1:50的比例转接到含10 μ g/mL氯霉素(Cm)的新鲜GMl7液体中，30°C培养至OD600约0.5-0.6左右时，加入10ng/mL的nisin (Sigma,购自上海悠扬生物科技有限公司)进行诱导。30°C诱导6h后6000g，离心IOmin收集诱导后的菌体。用无菌的PBS溶液洗涤菌体沉淀两次后，重悬于适量的PBS溶液中，调整菌体浓度为1X101CICFU。
[0040](2)动物实验程序
[0041]动物实验流程如图2所示；采用Balb/c小鼠建立花生过敏模型，对其灌胃重组菌L.lactis NZNH和L.lactis NZMH，通`过观察小鼠的过敏症状，测定小鼠血清中总IgE、特异性抗体及MCP-1水平，从而对重组菌预防小鼠花生过敏的效果进行评估。动物实验程序:30只4周龄雌性Balb/c小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司)适应性喂养一周后，随机分成5组，每组6只。整个动物实验过程分为三个阶段:(I)预防阶段--第1-4、7-10天连续灌胃0.2mL诱导后的菌液(2X IO9CFU) ; (2)致敏阶段:第17、22、28、34、40、46天灌胃6mg花生蛋白粗提物(CPE)和10 μ gCT ；(3)激发阶段:最后一次灌胃后第7天，即第53天时灌胃12mg CPE进行激发。
[0042]设第I组为PBS对照组，每只小鼠在预防及致敏阶段均灌胃0.2mL PBS。第2组为阳性对照模型组，在预防阶段灌胃等量PBS，而在致敏阶段灌胃CPE和CT。第3组为实验对照组，在预防阶段灌胃L.lactis NZ9000 ;第4、5组均为实验组，在预防阶段分别灌胃重组菌L.lactis NZNH和L.lactis NZMH。第3、4和5组在致敏阶段中均灌胃CPE和CT。所有组别的小鼠均在第53天灌胃CPE进行激发。
[0043]实验结果表明，通过灌胃重组乳酸乳球菌L.lactis NZNH和L.lactis NZMH 口服疫苗，花生过敏小鼠的过敏症状显著减轻，肥大细胞脱粒和体内Th2型免疫反应(血清IgE抗体)明显受到抑制，而Thl型特异性IgG2a抗体水平显著增加；且与L.lactis NZNH相比，L.lactis NZMH对小鼠肥大细胞脱粒、总IgE及特异性IgE抗体分泌的抑制作用更显著。这些结果表明，低过敏原性重组乳酸乳球菌口服疫苗能更有效地抑制过敏性的免疫反应，从而预防花生过敏。[0044]由图3可知:激发后，PBS对照组的小鼠无明显的过敏症状。相对于阴性组，模型组小鼠过敏症状较为明显，100%的小鼠在激发后有频繁搔挠鼻子及头部的行为，此外还出现眼周水肿，腹泻等症状。在益生菌组中，小鼠均出现轻微的过敏症状，频繁搔挠鼻子及头部的行为也普遍存在，但仅有一两只小鼠出现腹泻症状。结果表明，灌胃L.lactis NZ9000和重组乳酸乳球菌均能减缓小鼠花生过敏症状。
[0045]由图4可知，与阴性组相比，模型组中CPE特异性IgE和IgGl抗体含量显著增加(Ρ〈0.05)。重组菌L.lactis NZNH和L lactis NZMH均能明显地降低CPE特异性IgE抗体，但是对IgGl抗体的影响 并不显著；并且灌胃L.lactis NZMH组特异性IgE水平较L.1actisNZNH组下降更为显著。同时，原始菌株L.lactis NZ9000对特异性IgE和IgGl抗体并没有产生影响。重组菌L.lactis NZNH和L.lactis NZMH均能诱导产生大量的Thl型CPE特异性IgG2a抗体，与模型组和阴性组的差异显著。
[0046]由图5可知，与模型组相比，L lactis NZNH和L lactis NZMH组总IgE和肥大细胞脱粒均受到显著抑制，且L.lactis NZMH的抑制效果比L.lactis NZNH更为显著。
[0047]以上结果表明，重组菌L.lactis NZNH和L.lactis NZMH均能促使小鼠体内Th2型反应向Thl型转变，调节Thl/Th2平衡；但1 lactis NZMH对于花生过敏小鼠的免疫调节作用优于重组菌L.lactis NZNH，其预防花生过敏的功效更优越。
[0048]虽然本发明专利已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明。任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种改动与修饰。因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
【权利要求】
1.一种低过敏原性的花生过敏原蛋白mArah2,其特征在于,其是将天然Arah2蛋白的aa47-56抗原表位断开，并按50_151_1_49的氨基酸顺序重新排列得到的低过敏原性花生过敏原基因mArah2,如SEQN0.2所示。
2.一种包含编码根据权利要求1所述的低过敏原性花生过敏原蛋白mArah2的编码基因的重组质粒。
3.包含根据权利要求2所述的重组质粒的乳酸乳球菌菌株。
4.根据权利要求3所述的乳酸乳球菌菌株，其特征在于，所述菌株是用包含低过敏原性的花生过敏原mArah2的编码基因的质粒载体转化乳酸乳球菌NZ9000后所获得的菌株Lactococcus lactis NZMH,于2013年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为 CGMCC N0.8219。
5.包含权利要求4所述的重组乳酸乳球菌菌株的疫苗，其特征在于，所述疫苗为口服制剂。
6.根据权利要求5所述的包含重组乳酸乳球菌菌株的疫苗，其特征在于，所述口服制剂为胶囊剂、锭剂、粉剂或颗粒剂。
7.权利要求2所述的重组质粒或权利要求3-4任一项所述的重组乳酸乳球菌菌株在制备可用于治疗花生过敏的乳酸乳球菌疫苗中的用途。
8.一种制备权利要求3所述的重组乳酸乳球菌菌株的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤: a)对花生过敏原Arah2的天然基因序列进行密码子优化和修饰突变得到低过敏原性的花生过敏原基因mArah2 ； b)构建重组表达质粒； c)利用重组表达质粒转化乳酸乳球菌并进行筛选鉴定获取重组乳酸乳球菌菌株。
9.根据权利要求8所述的制备重组乳酸乳球菌菌株的方法，其特征在于步骤a)、b)中构建重组表达质粒包括以质粒PUC57-nArah2为模板，分别利用引物P1F:CAGGTGG TCGTGATCGTTATCGTCAACAATGGGAATTAC/P1R:CCCTCGAGATCTTGTGA TGGTGAATATG 和引物P2F:CGCCATAT GCCATATTCTCCTTCACAAG/P2R: GTA ATTCCCATTGTTGACGATAACGATCACGACCACCTG扩增aal-49及aa50_151片段基因；利用1%琼脂糖凝胶电泳检测并分别回收纯化两个基因片段的PCR产物；采用重叠区扩增基因拼接法对目的片段aal-49、aa50_151进行拼接，以及将拼接完成的目的基因片段mArah2和载体pNZ8148双酶切后进行过夜连接反应的步骤。
10.根据权利要求8所述的制备重组乳酸乳球菌菌株的方法，其特征在于步骤c)中的转化方法是电转化。
【文档编号】C12N1/21GK103626860SQ201310647930
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年12月4日 优先权日:2013年12月4日
【发明者】陈卫, 张秋香, 任晟诚, 王刚, 田丰伟, 刘小鸣, 赵国忠, 赵建新, 张灏, 郭敏 申请人:江南大学