专利名称：一种内切β－1,3葡聚糖酶基因及其克隆方法
技术领域：
一种内切β-1，3葡聚糖酶基因及其克隆方法，属于微生物基因工程领域。
背景技术：
β-1，3-葡聚糖酶分为内切β-1，3-葡聚糖酶(EC3.2.1.39)和外切β-1，3-葡聚糖酶(EC3.2.1.58)，广泛分布在细菌，真菌和高等植物中。内切β-1，3-葡聚糖酶以内部随机切割方式专一性水解以β-1，3-糖苷键聚合的高分子葡聚糖，产物为寡糖或葡萄糖。
β-1，3-葡聚糖酶的生理功能因来源而异在植物中，尽管有研究显示它在细胞分化中起一定作用，但它主要是作为一种病原真菌的防御系统；在细菌中，它起营养作用，因为大部分细菌不含有β-1，3-葡聚糖；在真菌中，β-1，3-葡聚糖酶有许多不同的功能，首先，有研究表明它在真菌发育和分化期间形态的形成与瓦解过程中具有一定生理作用；其次，作为裂解酶类，β-1，3-葡聚糖酶与碳源和能源枯竭时β-1，3-葡聚糖的转移有关系。
β-1，3-糖苷键存在于禾本科植物(玉米、水稻、高粱等)细胞壁半纤维素的非淀粉多糖中，并且一般是在支链上，是导致溶液黏度上升的重要原因之一。内切β-1，3-葡聚糖酶的添加可以使β-1，3-糖苷键支链所形成的网状结构解体，增加多糖的水溶性，进而被有效利用。例如，在饮料工业中，葡聚糖是导致啤酒和果汁浑浊的因素之一，尤其在麦汁过滤过程中葡聚糖的存在严重的阻碍着过滤，大大减慢过滤速度。高活性又稳定的葡聚糖酶的添加无疑大大便于过虑和澄清。另外，在饲料工业中，一方面，β-葡聚糖溶解后使食糜的粘度增大，不利于其他营养成分的消化和吸收；另一方面，未被消化和吸收的葡聚糖具有强烈的吸水性，大大增加了动物的排便量，对环境是极不友好的。内切β-1，3-葡聚糖酶的添加既可以降低饲料的粘度，增加畜禽和鱼类的采食量，又可以减少其排便体积，从而减轻对环境的污染。可见，内切β-1，3-葡聚糖酶开发和研究具有重要意义。
国内外学者在内切β-1，3-葡聚糖酶的异源表达方面进行的研究工作不多。Vladimir V.Zverlov等从热孢菌(Thermotoga neapolitana)中克隆并在大肠杆菌中成功表达了一种嗜热β-1，3-葡聚糖酶(LminA)。Hong等从链霉菌
(Streptomyces sioyaensis)中成功克隆并在大肠杆菌中表达了内切β-1，3-葡聚糖酶。蓝海燕等对烟草来源的β-1，3-葡聚糖酶进行了cDNA克隆，并成功在大肠杆菌中表达。
发明内容
本发明的目的是寻找一种新的β-1，3-葡聚糖酶及其编码基因，再利用基因扩增等手段克隆了该酶基因，最后在大肠杆菌中表达和制备该β-1，3-葡聚糖酶。
本发明提供了一种来源于粗糙脉孢菌中的β-1，3-葡聚糖酶基因序列及其相应的氨基酸序列。提供了含有粗糙脉孢菌的β-1，3-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中表达的表达载体pET28a-glu及其基因重组菌EC-Glu。利用本发明成果，可以用于β-1，3-葡聚糖酶工业化生产的基因工程菌的构建及其规模化制备。
本发明的技术方案用BLAST软件，以内切β-1，3-葡聚糖酶的氨基酸序列搜索微生物基因组序列，粗糙脉胞菌基因组序列中的开放阅读框架B23B10.170编码产物可能是内切β-1，3-葡聚糖酶。从基因组序列中提取这段序列，采用GenScan软件分析发现此基因含有两个内含子，用SignalP V2.0程序分析这段基因的编码产物。确定其为分泌性蛋白并确定了信号肽的切割位点。在上述分析的基础上，设计引物P1，P2，以粗糙脉胞菌AS 3.1604的染色体DNA为模板，PCR扩增出2432bp不含编码信号肽序列的核苷酸片段gluA，PCR扩增条件为95℃5min；94℃30s，54℃50s，72℃2min 30s，35个循环；72℃10min；扩增得到目的片段gluA经EcoRI酶切与相同酶切的pUC18连接，获得重组质粒pUC-gluA。核苷酸序列测定确认获得内切β-1，3葡聚糖酶基因gluA，其中在第267碱基之后的61bp为第一个内含子，在第448碱基之后的34bp为第二个内含子。
采用PCR方法进行外显子拼接，去除目的基因中的两个内含子。首先设计引物P3、P4、P5和P6，其中P3和P4，P5和P6两对引物5’端分别有20个和23个碱基是互补的，以便于拼接。以pUC-gluA为模板，P1和P3，P4和P2为引物作PCR，分别扩增获得PCR产物P1P3和P4P2。获得产物P1P3的PCR扩增条件是95℃5min；94℃30s，54℃50s，72℃30s，35个循环；72℃10min；获得PCR产物P4P2的PCR扩增条件是95℃5min；94℃30s，54℃50s，72℃2min，35个循环；72℃10min。然后以P1P3和P4P2的混合物为模板，通过引物P1和P2进行PCR拼接，去除第一个内含子intr1。以所得去除第一个内含子后的产物为模板，再用P1，P2，P5和P6组合，重复上述过程相同条件进行PCR扩增，先获得产物P1P5和P6P2，再通过引物P1，P2进行PCR拼接，去除第二个内含子intr2，将去除内含子的glu克隆入pUC18，获得重组质粒pUC-glu并进行序列测定，确认内含子已正确去除。基因glu的核苷酸序列如下atgtctccat tgctggacgt ctccgcttca gtctccttga actggaccag cgctcaaggt 60gtttccgacc gaccgaccag gttttggtac tccagtatcg accacagcac tccccttgtg 120cgcggcttcg ctcccgacct tgacggagat gtcaactatg ccgtcttcaa ggcagtgaaa 180cccggcgatg gggcgagtat ccaaacagcg atcaactcgg ggaccaacgg tgctaagaga 240cacggtctat ggtttgcttc ccagccacga gttgtgtaca taccgccggg aacatacgag 300atctctgaga ccatcttcat gaacactgac acagttctga tgggcgacgc aacagatgta 360aggacgatgg cctctcccat gcaagcggaa ccacccatca tcaaagcatc ttcgaacttc 420tccgggaatc aaacgttgat ctctggccaa gaccccgcaa ctggtatttc cggtgagcta 480tcgttcgccg tctccttgaa gaacttaatc ctcgacacca ccaatatccc aggagaccaa 540gccttcacag ctctctggtg gggtgttgct caaggagctc agttgcagaa tgtgaagatc 600cgtatggcgc ctgccatcga tggtgaggga cacagtggta ttcgcctcgg ccgtggctcg 660actctcggag tttcggatgt tcgtatcgaa tacgggcaaa acggtatctg gtataacggc 720catcagcaag cagttttcaa gagcatctac ttcttcaaaa atgctgtggg aatgttcatt 780gacggtggcg ccacgatcag catcgtcaac ccgacctttg acggctgtgg cttgggcgtc 840taccacgtcg cgggcaaccc ttggattggt ctaatcgatg ccatctctat caactccggt 900acgacgctga agacgacaga ctggccaaac tacctggtcg agaaccttcg tgtcatcagc 960ggaaaaaccg agaacgcggt cgaagggccc ggcgactttg ttctggcaac caagccaaac 1020gtagcccagc tctcgtacgc caacactgtt ggccatgatc ccatctatgg ccccattgaa 1080gcagcgcagt tgaaccgtcc atcatcgctg gcgcctggac ctgatgggcg ttatgcatac 1140cttccagcac cgaactatgc cgagctcagc gtccaagact ttctcaacgt caaagatcct 1200cttcagaacg gaggctgcct cgtctttggc gacaacaccc gagacgagtc ctccaccctc 1260aacgccatcc ttcgtctggc cgctcgtcag aacaagatcg cttactttcc cttcggcaag 1320taccgcgtcg actcgactct tttcgttccc tccggctccc gtattgtcgg cgaagcgtgg 1380gccacaatca cgggatatgg ccccttcttc acagacagcg ctcatcccca accgatcatc 1440aaggtcggca accccggcga tattggcacc gcgcacatcc aggatatgcg cttcaccgta 1500tcggacgtgc ttcccggagc catcatcctg cagttcaacc tcgccggtgc gcagccgggg 1560gacgtggcaa tctggaactc gcttgtcaca gtcggaggaa cgcggggtgc gaaggcgtta 1620acggacaagt gcgtcaatcc ggagacggac gaggcgtgca aggctgcttt cttgggtatc 1680catctcgctt cgacgtcgtc cgtgtatctc gagaacgtat ggaactgggt agccgaccac 1740atcgccgaag aaccgatatc gccgggcggg agcaacatcg ccggaaaggg cggagtgctc 1800gtcgaagcga ccaaggggac ctggctgcac gcgctgggat cggagcactg gtggctgtac 1860
cagcttaatc tgcgaaaggc gtcgaatgtg ttagtgacga tgttgcaaag cgagaccaac 1920tatgaccagg gagacaacgc ggtgcaggtg gtgccgcatc cgtggacgcc ggacgtggag 1980ggatggggcg atccggactt tggctggtgc gcggggcagg cgaacgagaa gaggtgtcga 2040atggggttcg cgaactacat caatggcgga agcaacattc ggacctacgc cagtgcctcg 2100tgggcgttct tcagcgggcc gggataccaa gggtgcgcgg ggcagtatca gtgccaacgg 2160tatatgcatt gggtggagga gacaccggcc aatttgcagg cgtttgggtt gtgctcgaag 2220gatacgtggg cgacgttgag gttggagaat ggaaccgaga ttgtcacgaa cgaggggttc 2280accgggtcgt ggtctgggtc gggaggcgat gtcggcaggt acactccgga ggcatcgtga2340其中，atg为起始密码子，tga为终止密码子。
根据以上核苷酸序列，β-1，3-葡聚糖酶的氨基酸序列如下Met Ser Pro Leu Leu Asp Val Ser Ala Ser Val Ser Leu Asn Trp1 5 10 15Thr Ser Ala Gln Gly Val Ser Asp Arg Pro Thr Arg Phe Trp Tyr20 25 30Ser Ser Ile Asp His Ser Thr Pro Leu Val Arg Gly Phe Ala Pro35 40 45Asp Leu Asp Gly Asp Val Asn Tyr Ala Val Phe Lys Ala Val Lys50 55 60Pro Gly Asp Gly Ala Ser Ile Gln Thr Ala Ile Asn Ser Gly Thr65 70 75Asn Gly Ala Lys Arg His Gly Leu Trp Phe Ala Ser Gln Pro Arg80 85 90Val Val Tyr Ile Pro Pro Gly Thr Tyr Glu Ile Ser Glu Thr Ile95 100 105Phe Met Asn Thr Asp Thr Val Leu Met Gly Asp Ala Thr Asp Val110 115 120Arg Thr Met Ala Ser Pro Met Gln Ala Glu Pro Pro Ile Ile Lys125 130 135Ala Ser Ser Asn Phe Ser Gly Asn Gln Thr Leu Ile Ser Gly Gln140 145 150Asp Pro Ala Thr Gly Ile Ser Gly Glu Leu Ser Phe Ala Val Ser155 160 165
Leu Lys Asn Leu Ile Leu Asp Thr Thr Asn Ile Pro Gly Asp Gln170 175 180Ala Phe Thr Ala Leu Trp Trp Gly Val Ala Gln Gly Ala Gln Leu185 190 195Gln Asn Val Lys Ile Arg Met Ala Pro Ala Ile Asp Gly Glu Gly200 205 210His Ser Gly Ile Arg Leu Gly Arg Gly Ser Thr Leu Gly Val Ser215 220 225Asp Val Arg Ile Glu Tyr Gly Gln Asn Gly Ile Trp Tyr Asn Gly230 235 240His Gln Gln Ala Val Phe Lys Ser Ile Tyr Phe Phe Lys Asn Ala245 250 255Val Gly Met Phe Ile Asp Gly Gly Ala Thr Ile Ser Ile Val Asn260 265 270Pro Thr Phe Asp Gly Cys Gly Leu Gly Val Tyr His Val Ala Gly275 280 285Asn Pro Trp Ile Gly Leu Ile Asp Ala Ile Ser Ile Asn Ser Gly290 295 300Thr Thr Leu Lys Thr Thr Asp Trp Pro Asn Tyr Leu Val Glu Asn305 310 315Leu Arg Val Ile Ser Gly Lys Thr Glu Asn Ala Val Glu Gly Pro320 325 330Gly Asp Phe Val Leu Ala Thr Lys Pro Asn Val Ala Gln Leu Ser335 340 345Tyr Ala Asn Thr Val Gly His Asp Pro Ile Tyr Gly Pro Ile Glu350 355 360Ala Ala Gln Leu Asn Arg Pro Ser Ser Leu Ala Pro Gly Pro Asp365 370 375Gly Arg Tyr Ala Tyr Leu Pro Ala Pro Asn Tyr Ala Glu Leu Ser380 385 390Val Gln Asp Phe Leu Asn Val Lys Asp Pro Leu Gln Asn Gly Gly395 400 405
Cys Leu Val Phe Gly Asp Asn Thr Arg Asp Glu Ser Ser Thr Leu410 415 420Asn Ala Ile Leu Arg Leu Ala Ala Arg Gln Asn Lys Ile Ala Tyr425 430 435Phe Pro Phe Gly Lys Tyr Arg Val Asp Ser Thr Leu Phe Val Pro440 445 450Ser Gly Ser Arg Ile Val Gly Glu Ala Trp Ala Thr Ile Thr Gly455 460 465Tyr Gly Pro Phe Phe Thr Asp Ser Ala His Pro Gln Pro Ile Ile470 475 480Lys Val Gly Asn Pro Gly Asp Ile Gly Thr Ala His Ile Gln Asp485 490 495Met Arg Phe Thr Val Ser Asp Val Leu Pro Gly Ala Ile Ile Leu500 505 510Gln Phe Asn Leu Ala Gly Ala Gln Pro Gly Asp Val Ala Ile Trp515 520 525Asn Ser Leu Val Thr Val Gly Gly Thr Arg Gly Ala Lys Ala Leu530 535 540Thr Asp Lys Cys Val Asn Pro Glu Thr Asp Glu Ala Cys Lys Ala545 550 555Ala Phe Leu Gly Ile His Leu Ala Ser Thr Ser Ser Val Tyr Leu560 565 570Glu Asn Val Trp Asn Trp Val Ala Asp His Ile Ala Glu Glu Pro575 580 585Ile Ser Pro Gly Gly Ser Asn Ile Ala Gly Lys Gly Gly Val Leu590 595 600Val Glu Ala Thr Lys Gly Thr Trp Leu His Ala Leu Gly Ser Glu605 610 615His Trp Trp Leu Tyr Gln Leu Asn Leu Arg Lys Ala Ser Asn Val620 625 630Leu Val Thr Met Leu Gln Ser Glu Thr Asn Tyr Asp Gln Gly Asp635 640 645
Asn Ala Val Gln Val Val Pro His Pro Trp Thr Pro Asp Val Glu650 655 660Gly Trp Gly Asp Pro Asp Phe Gly Trp Cys Ala Gly Gln Ala Asn665 670 675Glu Lys Arg Cys Arg Met Gly Phe Ala Asn Tyr Ile Asn Gly Gly680 685 690Ser Asn Ile Arg Thr Tyr Ala Ser Ala Ser Trp Ala Phe Phe Ser695 700 705Gly Pro Gly Tyr Gln Gly Cys Ala Gly Gln Tyr Gln Cys Gln Arg710 715 720Tyr Met His Trp Val Glu Glu Thr Pro Ala Asn Leu Gln Ala Phe725 730 735Gly Leu Cys Ser Lys Asp Thr Trp Ala Thr Leu Arg Leu Glu Asn740 745 750Gly Thr Glu Ile Val Thr Asn Glu Gly Phe Thr Gly Ser Trp Ser755 760 765Gly Ser Gly Gly Asp Val Gly Arg Tyr Thr Pro Glu Ala Ser770 775 779该β-甘露聚糖酶由779个氨基酸残基组成。
用EcoRI酶切重组质粒pUC-glu，胶回收获得基因glu片段，将基因glu克隆入质粒pET28a的EcoRI位点，得到基因glu顺向插入的重组质粒pET28a-glu。重组质粒pET28a-glu转化大肠杆菌DE3(RILplus)，获得基因重组菌EC-Glu。
本发明的有益效果本发明提供了来源于粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)AS 3.1604的一种内切β-1，3葡聚糖酶基因glu，提供了基因glu的核苷酸序列和相应蛋白质的氨基酸序列，提供了含有基因glu的大肠杆菌表达载体pET28a-glu以及在大肠杆菌中的高效表达。本发明可用于内切β-1，3葡聚糖酶工业化生产的基因工程菌的构建，提高微生物发酵法生产内切β-1，3葡聚糖酶的水平和质量。
图1拼接法去除内含子的过程。P1-P6为引物，P1P3，P4P2，P1P5和P6P2是相对应的PCR扩增产物。
图2重组表达质粒pET28a-glu的物理图谱。
图3重组菌表达β-1，3-葡聚糖酶的SDS-PAGE分析。1.蛋白质分子量标准；2.空载体对照；3.EC-Glu。
具体实施例方式
实施例1内切β-1，3葡聚糖酶基因glu的克隆和改造P1 accggaattcatgtctccattgctggacgtP2 cgtgaattcacgatgcctccggagtgtP3 cccggcggtatgtacacaactcgtggctgggaagcaaaccP4 gttgtgtacataccgccgggaacatP5 gatgctttgatgatgggtggttccgcttgcatgggagaggP6 ccacccatcatcaaagcatctcg用BLAST软件，以内切β-1，3-葡聚糖酶的氨基酸序列搜索微生物基因组序列，粗糙脉胞菌基因组序列中的开放阅读框架B23B10.170编码产物可能是内切β-1，3-葡聚糖酶。从基因组序列中提取这段序列，采用GenScan软件分析发现此基因含有两个内含子，用Signa1PV2.0程序分析这段基因的编码产物。确定其为分泌性蛋白并确定了信号肽的切割位点。在上述分析的基础上，设计引物P1，P2，以粗糙脉胞菌AS3.1604的染色体DNA为模板，PCR扩增出2432bp不含编码信号肽序列的核苷酸片段gluA，PCR扩增条件为95℃5min；94℃30s，54℃50s，72℃2min 30s，35个循环；72℃10min；扩增得到目的片段gluA经EcoRI酶切与相同酶切的pUC18连接，获得重组质粒pUC-gluA。核苷酸序列测定确认获得内切β-1，3葡聚糖酶的基因gluA，其中在第267碱基之后的61bp为第一个内含子，在第448碱基之后的34bp为第二个内含子。采用PCR方法进行外显子拼接，去除目的基因中的两个内含子(图1)。首先设计引物P3、P4、P5和P6，其中P3和P4，P5和P6两对引物5’端分别有20和23个碱基是互补的，以便于拼接。以pUC-gluA为模板，P1和P3，P4和P2为引物作PCR，分别扩增获得PCR产物P1P3和P4P2。获得产物P1P3的PCR扩增条件是95℃5min；94℃30s，54℃50s，72℃30s，35个循环；72℃10min；获得PCR产物P4P2的PCR扩增条件是95℃5min；94℃30s，54℃50s，72℃2min，35个循环；72℃10min。以所得去除第一个内含子后的产物为模板，再用P1，P2，P5和P6适当组合，重复上述过程相同条件进行PCR扩增，先获得产物P1P5和P6P2，再通过引物P1，P2进行PCR拼接，去除第二个内含子，将去除内含子的glu克隆入pUC18，获得重组质粒pUC-glu并进行序列测定，确认内含子已正确去除。
实施例2内切β-1，3葡聚糖酶基因glu的表达用EcoRI酶切重组质粒pUC-glu，胶回收获得基因glu片段，将基因glu克隆入质粒pET28a的EcoRI位点，得到基因glu顺向插入的重组质粒pET28a-glu(图2)。重组质粒pET28a-glu转化大肠杆菌DE3(RILplus)，获得基因重组菌EC-Glu。重组菌EC-Glu接种于35mL LB培养基中，于37℃，200r/min振荡培养至OD值0.6左右，加入终浓度0.5mmol/L异丙基-β-D-半乳糖苷诱导培养4h。离心收集菌体，加入终浓度为12.5μg/mL溶菌酶进行细胞破碎，得到内切β-1，3葡聚糖酶粗酶液。用SDS-PAGE法检测表达产物(图3)，重组菌EC-Glu在80kD处表达出明显的蛋白条带。重组β-1，3葡聚糖酶在45-55℃下表现出最佳的液化大麦葡聚糖的能力。
权利要求
1.一种来源于粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)AS 3.1604中的内切β-1，3葡聚糖酶基因glu，其核苷酸序列为atgtctccat tgctggacgt ctccgcttca gtctccttga actggaccag cgctcaaggt 60gtttccgacc gaccgaccag gttttggtac tccagtatcg accacagcac tccccttgtg 120cgcggcttcg ctcccgacct tgacggagat gtcaactatg ccgtcttcaa ggcagtgaaa 180cccggcgatg gggcgagtat ccaaacagcg atcaactcgg ggaccaacgg tgctaagaga 240cacggtctat ggtttgcttc ccagccacga gttgtgtaca taccgccggg aacatacgag 300atctctgaga ccatcttcat gaacactgac acagttctga tgggcgacgc aacagatgta 360aggacgatgg cctctcccat gcaagcggaa ccacccatca tcaaagcatc ttcgaacttc 420tccgggaatc aaacgttgat ctctggccaa gaccccgcaa ctggtatttc cggtgagcta 480tcgttcgccg tctccttgaa gaacttaatc ctcgacacca ccaatatccc aggagaccaa 540gccttcacag ctctctggtg gggtgttgct caaggagctc agttgcagaa tgtgaagatc 600cgtatggcgc ctgccatcga tggtgaggga cacagtggta ttcgcctcgg ccgtggctcg 660actctcggag tttcggatgt tcgtatcgaa tacgggcaaa acggtatctg gtataacggc 720catcagcaag cagttttcaa gagcatctac ttcttcaaaa atgctgtggg aatgttcatt 780gacggtggcg ccacgatcag catcgtcaac ccgacctttg acggctgtgg cttgggcgtc 840taccacgtcg cgggcaaccc ttggattggt ctaatcgatg ccatctctat caactccggt 900acgacgctga agacgacaga ctggccaaac tacctggtcg agaaccttcg tgtcatcagc 960ggaaaaaccg agaacgcggt cgaagggccc ggcgactttg ttctggcaac caagccaaac 1020gtagcccagc tctcgtacgc caacactgtt ggccatgatc ccatctatgg ccccattgaa 1080gcagcgcagt tgaaccgtcc atcatcgctg gcgcctggac ctgatgggcg ttatgcatac 1140cttccagcac cgaactatgc cgagctcagc gtccaagact ttctcaacgt caaagatcct 1200cttcagaacg gaggctgcct cgtctttggc gacaacaccc gagacgagtc ctccaccctc 1260aacgccatcc ttcgtctggc cgctcgtcag aacaagatcg cttactttcc cttcggcaag 1320taccgcgtcg actcgactct tttcgttccc tccggctccc gtattgtcgg cgaagcgtgg 1380gccacaatca cgggatatgg ccccttcttc acagacagcg ctcatcccca accgatcatc 1440aaggtcggca accccggcga tattggcacc gcgcacatcc aggatatgcg cttcaccgta 1500tcggacgtgc ttcccggagc catcatcctg cagttcaacc tcgccggtgc gcagccgggg 1560gacgtggcaa tctggaactc gcttgtcaca gtcggaggaa cgcggggtgc gaaggcgtta 1620acggacaagt gcgtcaatcc ggagacggac gaggcgtgca aggctgcttt cttgggtatc 1680catctcgctt cgacgtcgtc cgtgtatctc gagaacgtat ggaactgggt agccgaccac 1740atcgccgaag aaccgatatc gccgggcggg agcaacatcg ccggaaaggg cggagtgctc 1800gtcgaagcga ccaaggggac ctggctgcac gcgctgggat cggagcactg gtggctgtac 1860cagcttaatc tgcgaaaggc gtcgaatgtg ttagtgacga tgttgcaaag cgagaccaac 1920tatgaccagg gagacaacgc ggtgcaggtg gtgccgcatc cgtggacgcc ggacgtggag 1980ggatggggcg atccggactt tggctggtgc gcggggcagg cgaacgagaa gaggtgtcga 2040atggggttcg cgaactacat caatggcgga agcaacattc ggacctacgc cagtgcctcg 2100tgggcgttct tcagcgggcc gggataccaa gggtgcgcgg ggcagtatca gtgccaacgg 2160tatatgcatt gggtggagga gacaccggcc aatttgcagg cgtttgggtt gtgctcgaag 2220gatacgtggg cgacgttgag gttggagaat ggaaccgaga ttgtcacgaa cgaggggttc 2280accgggtcgt ggtctgggtc gggaggcgat gtcggcaggt acactccgga ggcatcgtga2340其中，atg为起始密码子，tga为终止密码子。
2.根据权利要求1所述基因glu，其氨基酸组成为Met Ser Pro Leu Leu Asp Val Ser Ala Ser Val Ser Leu Asn Trp1 5 10 15Thr Ser Ala Gln Gly Val Ser Asp Arg Pro Thr Arg Phe Trp Tyr20 25 30Ser Ser Ile Asp His Ser Thr Pro Leu Val Arg Gly Phe Ala Pro35 40 45Asp Leu Asp Gly Asp Val Asn Tyr Ala Val Phe Lys Ala Val Lys50 55 60Pro Gly Asp Gly Ala Ser Ile Gln Thr Ala Ile Asn Ser Gly Thr65 70 75Asn Gly Ala Lys Arg His Gly Leu Trp Phe Ala Ser Gln Pro Arg80 85 90Val Val Tyr Ile Pro Pro Gly Thr Tyr Glu Ile Ser Glu Thr Ile95 100 105Phe Met Asn Thr Asp Thr Val Leu Met Gly Asp Ala Thr Asp Val110 115 120Arg Thr Met Ala Ser Pro Met Gln Ala Glu Pro Pro Ile Ile Lys125 130 135Ala Ser Ser Asn Phe Ser Gly Asn Gln Thr Leu Ile Ser Gly Gln140 145 150Asp Pro Ala Thr Gly Ile Ser Gly Glu Leu Ser Phe Ala Val Ser155 160 165Leu Lys Asn Leu Ile Leu Asp Thr Thr Asn Ile Pro Gly Asp Gln170 175 180Ala Phe Thr Ala Leu Trp Trp Gly Val Ala Gln Gly Ala Gln Leu185 190 195Gln Asn Val Lys Ile Arg Met Ala Pro Ala Ile Asp Gly Glu Gly200 205 210His Ser Gly Ile Arg Leu Gly Arg Gly Ser Thr Leu Gly Val Ser215 220 225Asp Val Arg Ile Glu Tyr Gly Gln Asn Gly Ile Trp Tyr Asn Gly230 235 240His Gln Gln Ala Val Phe Lys Ser Ile Tyr Phe Phe Lys Asn Ala245 250 255Val Gly Met Phe Ile Asp Gly Gly Ala Thr Ile Ser Ile Val Asn260 265 270Pro Thr Phe Asp Gly Cys Gly Leu Gly Val Tyr His Val Ala Gly275 280 285Asn Pro Trp Ile Gly Leu Ile Asp Ala Ile Ser Ile Asn Ser Gly290 295 300Thr Thr Leu Lys Thr Thr Asp Trp Pro Asn Tyr Leu Val Glu Asn305 310 315Leu Arg Val Ile Ser Gly Lys Thr Glu Asn Ala Val Glu Gly Pro320 325 330Gly Asp Phe Val Leu Ala Thr Lys Pro Asn Val Ala Gln Leu Ser335 340 345Tyr Ala Asn Thr Val Gly His Asp Pro Ile Tyr Gly Pro Ile Glu350 355 360Ala Ala Gln Leu Asn Arg Pro Ser Ser Leu Ala Pro Gly Pro Asp365 370 375Gly Arg Tyr Ala Tyr Leu Pro Ala Pro Asn Tyr Ala Glu Leu Ser380 385 390Val Gln Asp Phe Leu Asn Val Lys Asp Pro Leu Gln Asn Gly Gly395 400 405Cys Leu Val Phe Gly Asp Asn Thr Arg Asp Glu Ser Ser Thr Leu410 415 420Asn Ala Ile Leu Arg Leu Ala Ala Arg Gln Asn Lys Ile Ala Tyr425 430 435Phe Pro Phe Gly Lys Tyr Arg Val Asp Ser Thr Leu Phe Val Pro440 445 450Ser Gly Ser Arg Ile Val Gly Glu Ala Trp Ala Thr Ile Thr Gly455 460 465Tyr Gly Pro Phe Phe Thr Asp Ser Ala His Pro Gln Pro Ile Ile470 475 480Lys Val Gly Asn Pro Gly Asp Ile Gly Thr Ala His Ile Gln Asp485 490 495Met Arg Phe Thr Val Ser Asp Val Leu Pro Gly Ala Ile Ile Leu500 505 510Gln Phe Asn Leu Ala Gly Ala Gln Pro Gly Asp Val Ala Ile Trp515 520 525Asn Ser Leu Val Thr Val Gly Gly Thr Arg Gly Ala Lys Ala Leu530 535 540Thr Asp Lys Cys Val Asn Pro Glu Thr Asp Glu Ala Cys Lys Ala545 550 555Ala Phe Leu Gly Ile His Leu Ala Ser Thr Ser Ser Val Tyr Leu560 565 570Glu Asn Val Trp Asn Trp Val Ala Asp His Ile Ala Glu Glu Pro575 580 585Ile Ser Pro Gly Gly Ser Asn Ile Ala Gly Lys Gly Gly Val Leu590 595 600Val Glu Ala Thr Lys Gly Thr Trp Leu His Ala Leu Gly Ser Glu605 610 615His Trp Trp Leu Tyr Gln Leu Asn Leu Arg Lys Ala Ser Asn Val620 625 630Leu Val Thr Met Leu Gln Ser Glu Thr Asn Tyr Asp Gln Gly Asp635 640 645Asn Ala Val Gln Val Val Pro His Pro Trp Thr Pro Asp Val Glu650 655 660Gly Trp Gly Asp Pro Asp Phe Gly Trp Cys Ala Gly Gln Ala Asn665 670 675Glu Lys Arg Cys Arg Met Gly Phe Ala Asn Tyr Ile Asn Gly Gly680 685 690Ser Asn Ile Arg Thr Tyr Ala Ser Ala Ser Trp Ala Phe Phe Ser695 700 705Gly Pro Gly Tyr Gln Gly Cys Ala Gly Gln Tyr Gln Cys Gln Arg710 715 720Tyr Met His Trp Val Glu Glu Thr Pro Ala Asn Leu Gln Ala Phe725 730 735Gly Leu Cys Ser Lys Asp Thr Trp Ala Thr Leu Arg Leu Glu Asn740 745 750Gly Thr Glu Ile Val Thr Asn Glu Gly Phe Thr Gly Ser Trp Ser755 760 765Gly Ser Gly Gly Asp Val Gly Arg Tyr Thr Pro Glu Ala Ser770 775 779。
3.如权利要求1所述一种内切β-1，3葡聚糖酶基因glu的克隆方法，其特征是A)所使用引物的序列如下P1accggaattcatgtctccattgctggacgtP2cgtgaattcacgatgcctccggagtgtP3cccggcggtatgtacacaactcgtggctgggaagcaaaccP4gttgtgtacataccgccgggaacatP5gatgctttgatgatgggtggttccgcttgcatgggagaggP6ccacccatcatcaaagcatctcgB)以粗糙脉孢菌AS 3.1604染色体DNA为模板，通过引物P1和引物P2，PCR扩增出2432bp不含编码信号肽序列的核苷酸片段gluA，PCR扩增条件为95℃ 5min；94℃ 30s，54℃ 50s，72℃ 2min 30s，35个循环；72℃ 10min；C)扩增得到的片段gluA经EcoR I酶切与相同酶切的pUC18连接，获得重组质粒pUC-gluA，核苷酸序列测定确认获得内切β-1，3葡聚糖酶基因gluA，其中在第267碱基之后的61bp为第一个内含子intr1，在第448碱基之后的34bp为第二个内含子intr2；D)采用PGR方法进行外显子拼接，去除基因gluA中的两个内含子，设计引物P3、P4、P5和P6，为便于拼接P3和P4，P5和P6两对引物5’端分别有20个及23个碱基是互补的；E)以pUC-gluA为模板，P1和P3为引物作PGR，扩增获得PCR产物P1P3，PCR扩增条件是95℃ 5min；94℃ 30s，54℃ 50s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 10min；F)以pUC-gluA为模板，P4和P2为引物作PGR，扩增获得PCR产物P4P2，PCR扩增条件是95℃ 5min；94℃ 30s，54℃ 50s，72℃ 2min，35个循环；72℃ 10min；G)以P1P3和P4P2的混合物为模板，通过引物P1和P2进行PCR拼接，PCR扩增条件是95℃ 5min；94℃ 30s，54℃ 50s，72℃ 2min30s，35个循环；72℃ 10min去除第一个内含intr1；H)以步骤G)所得去除第一个内含子后的产物为模板，再用P1，P2，P5和P6组合，与E)、F)过程相同条件，PCR扩增先获得产物P1P5和P6P2，再与G)过程相同条件，通过引物P1，P2进行PCR拼接，去除第二个内含子intr2；I)将去除内含子的glu克隆入pUCl8，获得重组质粒pUC-glu并进行序列测定，确认内含子已正确去除；J)glu的表达用EcoR I酶切重组质粒pUC-glu，胶回收获得基因glu片段，将基因glu克隆入质粒pET28a的EcoR I位点，得到基因glu顺向插入的重组质粒pET28a-glu，将重组表达质粒pET28a-glu转化大肠杆菌DE3获得基因重组菌EC-Glu。
全文摘要
一种内切β－1，3葡聚糖酶基因及其克隆方法，属于微生物基因工程领域。本发明提供了来源于粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)AS 3.1604的一种内切β－1，3葡聚糖酶基因glu，提供了基因glu的核苷酸序列和相应蛋白质的氨基酸序列，提供了含有基因glu的大肠杆菌表达载体pET28a－glu以及在大肠杆菌中的高效表达。本发明可用于内切β－1，3葡聚糖酶工业化生产的基因工程菌的构建，提高微生物发酵法生产内切β－1，3葡聚糖酶的水平和质量。
文档编号C12N15/56GK1699576SQ200510080820
公开日2005年11月23日 申请日期2005年6月30日 优先权日2005年6月30日
发明者王正祥, 马骏双 申请人:江南大学