专利名称：一种耐高温Pyrolobus聚合酶及其高效表达质粒和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因重组技术领域，具体涉及一种耐高温Pyrolobus聚合酶及其高效表达质粒和应用。
背景技术：
现有的耐热DNA聚合酶大多来源于嗜热菌。嗜热菌成为许多耐高温酶的主要来源，受到科学家的广泛关注。DNA聚合酶耐高温性对其在DNA扩增，DNA测序，DNA探针标记以及反转录等应用中必不可少的品质。在DNA扩增中应用广泛的聚合酶链式反应(PCR)是一个依赖于周期性的加热和冷却的循环过程。首先复制的双链DNA模板在高温(94°C 98°C) 下变形成单链DNA，单链DNA在降温后和引物杂交，然后聚合酶在最适合温度下由引物合成一条和单链DNA配对的新DNA片段。每个循环DNA的总量就增加一倍。一般的PCR反应需要2(Γ40个循环。催化此反应的聚合酶耐高温是催化的重要前提。现有的耐高温的有商业价值的聚合酶，例如Taq来源于嗜热菌(Ser^AS a卯aiicm)，其最适合温度在75°C ^80°C， 在95°C下的半衰期有池。但Taq的保真性和速度都不高。Pyrococcus是一类在100°C下生长的嗜热古菌。ykPyrococcus中分离的聚合酶，有很好的保真性但较慢的速度。Pyrolobus fumarii是另一类超嗜热古菌。在1997年首次在大西洋中脊背的超热矿物质喷口处被发现，可以在高达113°C下繁殖。其基因组在2011年9月21号完成发布。
发明内容
发明目的针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种耐高温 Pyrolobus聚合酶，以使其较高的温度耐受性。本发明的另一目的是提供一种高效表达 Pyrolobus聚合酶的质粒。本发明还有一目的是提供一种高效表达Pyrolobus聚合酶的体系。本发明还有一目的是提供一种构建高效表达Pyrolobus聚合酶的体系的方法。本发明还有一目的是提供一种构建高效表达Pyrolobus聚合酶的质粒的方法。技术方案为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下
一种耐高温Pyrolobus聚合酶，所述的Pyrolobus聚合酶为YP_004780419. 1蛋白，在 Pyrolobus聚合酶的碳端有用连接序列GGSG连接的ko7d DNA结合蛋白；其中，Pyrolobus 聚合酶的序列如序列表中的序列1所示；Sso7d DNA结合蛋白的序列如序列表中的序列3所
7J\ ο一种用于表达耐高温Pyrolobus聚合酶的DNA，片段包括在5，端的NdeI的限制性内切酶位点、Pyrolobus聚合酶编码序列、GGSG连接序列、Sso7d的编码序列和3’端的BioI 的限制性内切酶位点，DNA具体序列如序列表中的表2所示。一种高效表达耐高温Pyrolobus聚合酶的质粒，质粒载体为pEI^8a，在其上克隆有上述的用于表达耐高温Pyrolobus聚合酶的DNA。一种构建高效表达耐高温Pyrolobus聚合酶的质粒方法，包括酶切反应、连接反应和质粒质量检测，其中，
酶切反应50μ L酶切反应体系包括500ng Pyrolobus聚合酶的DNA或500ng pET28a 载体，5 μ L反应缓冲液，0. 5 μ L NdeI，0. 5 μ L BioI，补水至50 μ L ;37°C，保温Ih ；反应结束后，过柱纯化；
连接反应20 μ L连接反应体系包括50ng酶切后pEI^8a，IOOng酶切后Pyrolobus聚合酶的DNA，10 μ L快速连接酶反应缓冲液，1 μ L Τ4 DNA连接酶，加蒸馏水至20 μ L ;25°C， 保温5min，转至冰上冷却； 质粒质量检测为测序检测。一种高效表达耐高温Pyrolobus聚合酶体系，表达菌株为T7表达菌株BL21 DE3， 在其内转化有权利要求3所述的高效表达耐高温Pyrolobus聚合酶的质粒。一种构建高效表达耐高温Pyrolobus聚合酶体系的方法，将上述的高效表达耐高温Pyrolobus聚合酶的质粒转化入T7表达菌株BL21 DE3 ；具体包括感受态细胞冰上解冻细胞lOmin，加入Ing的检测正确的质粒DNA，混勻，置于冰上30min。然后42°C热激30s，再置于冰上5min。加入950 μ L室温的SOC培养基，37°C，250rpm振荡培养60min，取2 μ L加 98 μ L培养基混勻细胞涂布于氨苄霉素的选择平板上，37°C过夜培养。 上述的耐高温Pyrolobus聚合酶在PCR反应中的应用。有益效果与现有的耐热DNA聚合酶相比，本发明的耐高温Pyrolobus聚合酶具有的突出优点包括本发明通过在其末端连接DNA结合蛋白提高了聚合酶的效率，用体外合成修饰过的适合在大肠杆菌中表达的DNA合成重组Pyrolobus聚合酶，此酶和市场上拥有的产品有同样的聚合酶活力并可以更有效地合成大片段DNA。另外，Pyrolobus聚合酶有很强的耐高温性，即使在98°C下处理证仍有活力，此酶将在DNA合成，测序及标记探针合成等领域有广泛应用，具有很好的实用性，能够产生很好的经济效益和社会效应。
图1是载体pET28a的质粒图谱；
图2是纯化从组蛋白的SDS - PAGE电泳分析；图中，泳道1为75°C热处理后的粗蛋白；泳道2为过柱上清(flow through)，泳道3为漂洗(wash)，泳道圹19为洗脱的纯化蛋白；
图3是检测聚合酶的活力的电泳图；图中，泳道1是DNA分子量标准；泳道2-5是PCR 反应用Pyrolobus聚合酶合成的0. 5Kb (2)、1Kb (3) ,2Kb (4)和4Kb (5) PCR的反应产物；泳道 6-9 是用 Phusion 聚合酶的 0. 5Kb (6)、1Kb (7)、2Kb (8)和 4Kb (9) PCR 的反应产物；
图4是Pyrolobus聚合酶的热稳定性的检测电泳图；图中，Pyrolobus聚合酶在98°C下处理Oh (泳道l)，lh (泳道2)，2h (泳道3)，3h (泳道5)，4h (泳道6)后、5h (泳道7)后合成4Kb的PCR反应产物。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。实施例1
由Pyrolobus fumarii的超嗜热性推断其聚合酶有高耐热性，用已知的Pyrococcusfuriosus DNA聚合酶蛋白质序列(NP_577941. 1)作为靶子在/^ro/o/ws fummarii的基因组中查询，调出了 Pyrfu_0295编码蛋白(YP_004780419. 1 )，其蛋白质序列含803氨基酸，具体序列如序列表中序列1所示。对Pyrfu_0295蛋白的结构分析，发现和/^rococcm furiosus DNA聚合酶共享36%同样氨基酸序列，55%相似氨基酸。除了其碳端聚合酶结构领域，还包括在其氨基端的3’到5’的外切酶区域可以帮助检测基因复制错误。初步鉴定了 Pyrolobus聚合酶有和Pyrococcus聚合酶类似的功能。聚合酶和DNA的结合是整个催化反应的限速步骤，加快酶和DNA的结合速度可以提高酶的整体效率，减短反应时间。为了加快酶和DNA的结合速度，本发明把小且没有序列特意性的和DNA紧密结合的ko7d (1BBX_C) DNA结合蛋白用减短的4个氨基酸的连接序列(GGSG)连接在Pyrolobus聚合酶的碳端来提高和DNA的结合速度。实施例2
培养嗜热菌有各种技术障碍，比如它们不能在固体凝胶上生长，古菌细胞共同生长成网络结构，单个细胞脆弱几乎不存在，这使得在实验室发酵培养困难丛丛，价格昂贵。另外， 在Pyrolobus中原始聚合酶的表达量低，又将进一步提高成本。重组蛋白蛋白表达纯化技术已经在各个酶技术中广泛应用。可大量培养的宿主包括细菌，真菌，植物或真核细胞。在本发明中大肠杆菌将被用于大量表达此Pyrolobus聚合酶。但是因为各种生物都有其最适合的编码表的不同，当原始的Pyrolobus聚合酶的基因在大肠杆菌中表达时，蛋白表达量低到很难检测的程度。为了提高Pyrolobus聚合酶的表达量，Pyrolobus聚合酶的氨基酸序列用来反向翻译成适合在大肠杆菌中合成的基因序列。新设计的基因在核酸序列上和原始基因有25%的编码差别。整个序列用体外合成的方法合成。体外合成的用于克隆的DNA包括以下几个片段在5’端的NdeI的限制性内切酶位点，Pyrolobus聚合酶编码序列，GGSG 连接序列，Sso7d的编码序列和3’端的B10I的限制性内切酶位点，具体序列见序列表中的表2。合成基因用NdeI和B10I限制性内切酶处理后连接到用同样限制性内切酶处理后克隆载体pET28a (Novagen Cat#69864-3)上，如图1所示。在pET28a上有高表达的T7启动子。克隆好的表达载体经过测序来确保编码基因序列的准确性。表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3) (NEB C2527)菌株中诱导表达。具体步骤包括
(1)限制性内切酶反应
两个5(^1^反应体系包括500叫DNA (合成基因或pET28a载体)，5yL反应缓冲液 (100 μ g/mL BSA，20 mM Tris-Ac, 10 mM Mg (Ac)2, 50 mM Kac, 1 mM DTT, pH 7. 9),0. 5μ L NdeI (NEB R0111) ,0. 5μ L XhoI (NEB R0146)，补水至 50 μ L。37°C，保温lh。反应结束后，过柱纯化。(2)基因和载体连接反应
20 μ L反应体系包括50ng酶切后pEI^8a，IOOng酶切后基因，IOyL快速连接酶反应缓冲液，1 μ L T4DNA连接酶，加蒸馏水至20 μ L。
25 °C,保温5min，转至冰上冷却。
(3)连接反应样品转化到大肠杆菌
感受态细胞(NEB C3019)冰上解冻细胞10π η，ΜΛ 5ng的质粒DNA连接样品(2 μ L)， 混勻，置于冰上30min。然后42°C热激30s，再置于冰上5min。加入950 μ L室温的SOC培养基，37°C，振荡(250rpm)培养60min。混勻细胞，并用SOC做系列10倍稀释。每个稀释比例取100 μ L稀释液涂布于氨苄霉素的选择平板上，37°C过夜培养。第二天，挑选8个独立菌落培养在2mL的LB培养基中37°C培养后，抽提质粒。用NdeI和B10I酶切找出含克隆基因的质粒并测序保证编码序列的准确性。实施例3
将实施例2测序鉴定正确的表达质粒转化至T7表达菌株BL21 (DE3)，涂布于氨苄霉素选择平板，37°C培养过夜。挑一个独立菌落到IOmL含100μ g/mL的氨苄霉素的液体培养基中，37°C，培养直至OD6c 达到 0.4 0. 6后，加 40 μ L 100 mM IPTG (Sigma 15502)贮存液(终浓度为0. 4mM)，37°C，诱导4h，30°C，生长5h或16°C生长过夜。取40 μ L样品进行10 20% iTris —甘氨酸SDS— PAGE (Invitrogen Cat#EC61352B0X)电泳分析，通过考马斯亮蓝染色蛋白胶、Western Blot检测表达情况后，发现37°C诱导池的表达量最高。大规模表达时， 取新鲜IOmL培养液接种到IOL液体培养基(含抗生素)中，37°C培养直至0D_达到0. 4^0. 6 后，加IPTG至终浓度为0.4 mM，37°C，诱导4h。离心收集细胞，去除上清。收集的IOL表达细胞溶解在加有蛋白酶抑制剂(Roche Cat#11873580001)和溶菌酶(Sigma L6876)的 400mL 细胞裂解液(20mM NaP,500mM NaCl, IOmM imidizole, ImM DTT, 10% glycerol，pH7. 4)中，超声波破碎细胞。然后12500rpm离心30min后取上清中可溶聚合酶。利用聚合酶的热稳定性，75°C热变性20min来沉淀大部分不稳定大肠杆菌的杂蛋白。再次离心后，取上清进行亲和6组氨酸标签纯化。400ml样品加到有4X5ml的镍柱结合(GE Cat#17-5M7-01)，用2L含20mM咪唑洗去杂蛋白，最后用20mlT400mM的梯度咪唑竞争洗脱，收集洗脱样品后进行10 20% Tris 一甘氨酸SDS — PAGE (Invitrogen Cat#EC61352B0X)电泳分析，如图2所示。集中收集样品5号到15号后，在蛋白保存缓冲液中(20mM Tris-HCl, IOOmM KCl, ImM DTT, 0. ImM EDTA, 50% glycerol)透析两次，纯化的蛋白在一 20°C保存。其中，高效表达耐高温Pyrolobus聚合酶的质粒转化入T7表达菌株BL21 (DE3) 具体步骤包括感受态细胞(NEB C2527)冰上解冻细胞lOmin，加入Ing的检测正确的质粒 DNA,混勻，置于冰上30min。然后42°C热激30s，再置于冰上5min。加入950 μ L室温的SOC 培养基，370C，振荡(250rpm)培养60min。，取2 μ L加98 μ L培养基混勻细胞涂布于氨苄霉素的选择平板上，37 °C过夜培养。实施例4
纯化蛋白的在PCR的反应中鉴定DNA聚合酶活力并和市场上最耐高温的Wiusion聚合酶相比较合成四种不同大小的基因片段的能力。用于PCR的四对引物由IDT (Integrated DNA Technologies)合成，其序列如下
(1)用于合成495bp E.coli IspA 基因: IF :ATGAGTCAATCGATCTGTTCAACAGGG,
IR TTATTGTTTTTTCGCTCTAGAAGGCAA ；
(2)用于合成U87bp Ε. coli thrC 基因 2F ATGAAACTCTACAATCTGAAAGATCACAACG, 2R TTACTGATGATTCATCATCAATTTACGC ；
(3)用于合成2353bp Ε. coli polB 基因3F GTGGCGCAGGCAGGTTTTATCTTAA，
3R TCAAAATAGCCCAAGTTGCCCG ；
(4)用于合成 4681bp Ε. coli LeuA, B, C, D 基因
4F :ATGAGCCAGCAAGTCATTATTTTCG,
4R :TTAATTCATAAACGCAGGTTGTTTTGC。反应体系是50 μ L，包括0. 5 μ L (IOOng)的模板DNA (大肠杆菌的DNA，用Qiagen Cat#69504试剂盒从大肠杆菌K12 MG1655菌株中提取)，0. 5 μ L的IOOmM的一对引物，2 μ L IOX 反应缓冲液(500mM KCl, IOOmM Tris-HCl，ρΗ8· 8，25mM MgCl 2,1% Triton X-100),2yL dNTPs (IOmM), 1 μ L的聚合酶和43 μ L的蒸馏水。建立好反应体系后立即放入已经预热至变性温度的热循环仪中执行，反应条件为98°C 30s ；30 个循环98°C 10s,60°C 10s，72°C 30s ；72°C 5min ；4°C降温保存。基因被用来检测不同大小的产物合成。PCR反应样品和染料加密度试剂混合后，上样在1%的琼脂胶上电泳100V，2h。随后用溴化已锭给DNA染色后在紫外灯下照相。在图3 中，新纯化的聚合酶在现有的反应条件下和已有的酶相比，不仅有很高的酶活力，还能更有效的扩增较大的DNA片段。实施例5
为了测定聚合酶的热稳定性，纯化的酶在98°C下热处理Hh后，在进行实施例4的扩增4Kb片段的PCR反应。图4显示，这种新型的来源于超嗜热古菌Pyrolobus的聚合酶有很强的耐高温性能。即使证的高温处理后，仍然能有效合成4Kb的DNA。
权利要求
1.一种耐高温Pyrolobus聚合酶，其特征在于所述的Pyrolobus聚合酶为 YP_004780419. 1蛋白，在Pyrolobus聚合酶的碳端有用连接序列GGSG连接的ko7d DNA结合蛋白；其中，Pyrolobus聚合酶的序列如序列表中的序列1所示；Sso7d DNA结合蛋白的序列如序列表中的序列3所示。
2.一种用于表达耐高温Pyrolobus聚合酶的DNA，其特征在于片段包括在5’端的 NdeI的限制性内切酶位点、Pyrolobus聚合酶编码序列、GGSG连接序列、Sso7d的编码序列和3’端的B10I的限制性内切酶位点，DNA具体序列如序列表中的表2所示。
3.一种高效表达耐高温Pyrolobus聚合酶的质粒，其特征在于质粒载体为pET28a，在其上克隆有权利要求2所述的用于表达耐高温Pyrolobus聚合酶的DNA。
4.一种构建权利要求3所述的高效表达耐高温Pyrolobus聚合酶的质粒方法，其特征在于，包括酶切反应、连接反应和质粒质量检测，其中，酶切反应50μ L酶切反应体系包括500ng Pyrolobus聚合酶的DNA或500ng pET28a 载体，5 μ L反应缓冲液，0. 5 μ L NdeI，0. 5 μ L BioI，补水至50 μ L ;37°C，保温Ih ；反应结束后，过柱纯化；连接反应20 μ L连接反应体系包括50ng酶切后pEI^8a，IOOng酶切后Pyrolobus聚合酶的DNA，10 μ L快速连接酶反应缓冲液，1 μ L Τ4 DNA连接酶，加蒸馏水至20 μ L ;25°C， 保温5min，转至冰上冷却；质粒质量检测为测序检测。
5.一种高效表达耐高温Pyrolobus聚合酶体系，其特征在于表达菌株为T7表达菌株 BL21 DE3，在其内转化有权利要求3所述的高效表达耐高温Pyrolobus聚合酶的质粒。
6.一种构建高效表达耐高温Pyrolobus聚合酶体系的方法，其特征在于将权利要求 3所述的高效表达耐高温Pyrolobus聚合酶的质粒转化入T7表达菌株BL21 DE3 ；具体步骤包括感受态细胞冰上解冻细胞lOmin，加入Ing的检测正确的质粒DNA，混勻，置于冰上 30min ；然后42°C热激30s，再置于冰上5min ；加入950 μ L室温的SOC培养基，37 °C，250rpm振荡培养60min，取2 μ L力卩98 μ L培养基混勻细胞涂布于氨苄霉素的选择平板上，37°C过夜培养。
7.权利要求1所述的耐高温Pyrolobus聚合酶在PCR反应中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种耐高温Pyrolobus聚合酶及其高效表达质粒和应用，所述的Pyrolobus聚合酶为YP_004780419.1蛋白，在Pyrolobus聚合酶的碳端有用连接序列GGSG连接的Sso7dDNA结合蛋白；其中，Pyrolobus聚合酶的序列如序列表中的序列1所示。本发明通过在其末端连接DNA结合蛋白提高了聚合酶的效率，用体外合成修饰过的适合在大肠杆菌中表达的DNA合成重组Pyrolobus聚合酶，此酶和市场上拥有的产品有同样的聚合酶活力并可以更有效地合成大片段DNA。另外，Pyrolobus聚合酶有很强的耐高温性，即使在98℃下处理5h仍有活力，此酶将在DNA合成，测序及标记探针合成等领域有广泛应用。
文档编号C12N15/66GK102392000SQ20111034718
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月7日 优先权日2011年11月7日
发明者李志茹 申请人:李志茹